L’objectif de cette thèse est de déterminer l’étendue de la variabilité épigénétique, plus particulièrement du polymorphisme de méthylation de l’ADN, non liée à la variabilité génétique dans les populations asexuées en milieu naturel. Cette évaluation nous a permis de mieux cerner l’importance que peuvent avoir les processus épigénétiques en écologie et en évolution. Le modèle biologique utilisé est l’hybride clonal du complexe gynogénétique Chrosomus eos-neogaeus. Malgré une homogénéité génétique, une importante variabilité phénotypique est observée entre les hybrides d’une même lignée clonale mais retrouvés dans des environnements différents. L’influence des processus épigénétiques apporte une explication sur ce paradoxe. L’épigénétique se définit comme une modification de l’expression des gènes sans changement de la séquence d’ADN. La diversité des phénotypes peut entre autre s’expliquer par des patrons de méthylation différentiels des gènes et/ou des allèles des gènes entre les hybrides génétiquement identiques. La diversité des lignées épiclonales peut quant à elle s’expliquer par la colonisation de plusieurs lignées épiclonales, s’établir en réponse à l’environnement ou de façon aléatoire. Plusieurs méthodes seront utilisées afin de survoler le génome des hybrides clonaux pour mettre en évidence le polymorphisme de méthylation de l’ADN à l’échelle de l’individu et entre les individus de différentes populations. / The aim of the thesis is to determine the extent of epigenetic variation, more specifically DNA methylation polymorphism, not linked to genetic variation in natural populations of an asexual vertebrate. This evaluation enables to better understand the importance that plays epigenetics processes in ecology and evolution. The biological model used is the clonal hybrid of the gynogenetic Chrosomus eos-neogaeus complex. Even in absence of genetic difference, an important phenotypic variability is observed among hybrids of the same clonal lineage living in different environments. Epigenetics, a modification of genes expression without a change at the DNA sequence, provides an explanation to this paradox. The diversity of phenotypes may be explained by differential methylation patterns of genes and/or alleles among genetically identical hybrids. The diversity of epiclonal lineages may be explained by the colonisation of many epiclonal lineages, established in response to the environment or stochastically. Many methods were used for screening the genome of clonal hybrids in order to highlight DNA methylation polymophism at the scale of an individual and among individuals of different populations.

Le succès évolutif de la polyploïdie, notamment de l’allopolyploïdie (où la duplication de génome complet est associée à une hybridation entre génomes différenciés) est en partie lié au fait que cet événement s’accompagne de nombreux changements dans l'organisation du génome et la régulation de l'expression des gènes. On parle du « choc génomique » de l’hybridation interspécifique et de l’allopolyploïdie. Ces sources de diversité génétique, à la fois structurale et fonctionnelle, apparaissent utiles et nécessaires à l'adaptation et l’évolution des espèces. Alors que de nombreuses études portant sur la compréhension des mécanismes moléculaires à l’origine du succès des allopolyploïdes ont concerné les modifications de l’expression des gènes, mes travaux de thèse ont porté sur les agents non codants du génome que sont les éléments transposables et les petits ARN non codants. Le modèle d'étude est le colza (Brassica napus, AACC), espèce allotétraploïde issue de l'hybridation entre les espèces diploïdes navette (B. rapa, AA) et chou (B. oleracea, CC). Nous disposions de colzas néo-synthétisés, étudiés à différentes générations d’autofécondation, permettant de caractériser les changements génomiques accompagnant la formation puis l’évolution du génome néo-allopolyploïde. Une étude a tout d’abord été menée sur un élément transposable (ET) spécifique du génome C, Bot1, en vue d’identifier de nouvelles transpositions survenant chez les colzas néo-synthétisés par rapport aux parents diploïdes, par une approche SSAP. Quelques rares événements de transposition ont été identifiés. Ces résultats, confrontés à ceux obtenus sur deux autres ET, ont permis de mettre en évidence un impact modéré de l’allopolyploïdie sur la transposition de ces différents ET. Par contre, il est apparu que des changements de méthylation auraient accompagné cette allopolyploïdisation, sans doute à l’origine de la réactivation et la transposition de quelques copies de Bot1. Les petits ARN non codants ont été suggérés comme impliqués dans les différents événements génomiques accompagnant la formation d’un génome allopolyploïde. Pour étudier la dynamique d’expression des petits ARN chez des colzas néo-synthétisés pris à deux générations d’autofécondation (S1, S5) en comparaison de leurs parents diploïdes, j’ai exploité des données de séquençage haut débit obtenues pour 11 banques construites à partir des tiges de ces différents génotypes. J’ai ainsi démontré, qu’à une échelle globale, les petits ARN présentaient une réponse immédiate mais transitoire à l’événement d’allopolyploïdie. Les fractions particulièrement affectées par l’allopolyploïdie se sont révélées correspondre (1) à des petits ARN interférents dérivés d’éléments transposables avec une baisse de leur abondance en génération précoce S1, et (2) à des populations de petits ARN de 21 nucléotides exprimées uniquement de manière très précoce, de l’hybride F1 à la génération S1. Nous avons notamment identifié des transcrits de type viral correspondant à ces petits ARN de 21-nt, et présentant les mêmes profils d’expression (de l’hybride F1 à la génération S1), suggérant une réactivation d’éléments viraux endogènes (EVE) en réponse à l’hybridation et l’allopolyploïdie. L’ensemble de mon étude a démontré la mise en place d’une succession des voies de régulation par petits ARN où ET et EVE, réactivés au niveau transcriptionnel, sont immédiatement soumis à une répression post-transcriptionnelle (PTGS), renforcée ensuite par une répression de leur transcription (TGS). L’hypothèse d’une absence de cette régulation par petits ARN lors des phénomènes de nécrose et létalité hybride, amène à envisager ces populations de petits ARN comme les clés de la réussite de la formation d’un génome hybride, où la répression immédiate et efficace des ET et autres endovirus, réactivés suite au choc génomique, se révèle être une nécessité. / The evolutionary success of polyploid species is partly due to the dynamic changes in genome organization and gene expression patterns that occur at the onset of the polyploid formation. These changes are promoted by the merging of divergent genomes into a single nucleus (i.e. allopolyploidy) that causes a “genomic shock”; they are thought to provide a rich source of new genetic material upon which selection can act to promote adaptation and evolution. Many studies have thus aimed to uncover molecular mechanisms that are responsible for the evolutionary success of allopolyploid species, most of them focusing on gene expression changes. In the present PhD thesis, my interest has been concentrated on the non-coding components of the genome: transposable elements and small non-coding RNAs. My study involves oilseed rape (Brassica napus, AACC), a relatively young allopolyploid species that originated from hybridizations between B. rapa (AA) and B. oleracea (CC). Specifically, I have used resynthesized B. napus polyploids advanced by self-pollination of single plants for several generations; I have analyzed these plants at different generations for genomic changes accompanying polyploid formation and subsequent evolution. In a first part, sequence-specific amplification polymorphism (SSAP) targeting the C genome-specific transposable element Bot1, was used to evaluate transposition rate of Bot1 in resynthesized B. napus in comparison with the diploid parents. Only a few transposition events were identified. When combined with the results obtained for two other TEs, this work suggests that allopolyploidy has only a moderate impact on TE transposition and restructuring. The changes observed in SSAP profiles led us to hypothesize that some of them resulted from changes in DNA methylation, resulting in rare but highly specific TE activation and transposition. In a second part, I have concentrated on small non-coding RNAs (sRNAs), which are thought to mediate different aspects of the response to the “genomic shock” induced by allopolyploid formation. Comprehensive analyses of sRNA expression in resynthesized B. napus allopolyploids have been carried out by deep sequencing sRNAs from 11 libraries prepared from stems of three allotetraploids (surveyed at the two generations S1 and S5) and the two diploid parents. Characterization of sRNA distributions in these plants indicates that sRNAs show an immediate but transient response to allopolyploidy. The sRNAs derived from transposable elements (down-regulated in the S1) or targeting unknown sequences (no Blast hit against any available public database) were particularly affected. The use of B. napus mRNAseq data revealed that these latest unknown candidates, which are 21-nt long and over-expressed in the earliest generations (F1, S0, S1) were derived from endogenous viral elements (EVE). We confirmed that these EVEs showed the same expression patterns as the 21-nt long sRNAs that specifically target them (over-expression in the F1, S0 and S1). These results suggest that (at least) some EVEs might be reactivated as a response to the merging of divergent genomes (in interspecific hybrids and newly formed allopolyploids). Altogether, our results have demonstrated a succession of sRNA pathways that counteract the reactivation of some specific TEs and/or EVEs at the onset of polyploid formation; reactivated TEs and/or EVEs being immediately repressed at the post-transcriptional level (PTGS), and then fully repressed by transcriptional gene silencing (TGS) in the subsequent generations. Such data lead to hypothesize that sRNAs are essential to overcome interspecific hybrid incompatibilities due to the uncontrolled and deleterious reactivation of TEs / EVEs. Therefore, sRNAs should be considered as the guardians of genome integrity even in newly-formed allopolyploids.

L’objectif de cette thèse est de déterminer l’étendue de la variabilité épigénétique, plus particulièrement du polymorphisme de méthylation de l’ADN, non liée à la variabilité génétique dans les populations asexuées en milieu naturel. Cette évaluation nous a permis de mieux cerner l’importance que peuvent avoir les processus épigénétiques en écologie et en évolution. Le modèle biologique utilisé est l’hybride clonal du complexe gynogénétique Chrosomus eos-neogaeus. Malgré une homogénéité génétique, une importante variabilité phénotypique est observée entre les hybrides d’une même lignée clonale mais retrouvés dans des environnements différents. L’influence des processus épigénétiques apporte une explication sur ce paradoxe. L’épigénétique se définit comme une modification de l’expression des gènes sans changement de la séquence d’ADN. La diversité des phénotypes peut entre autre s’expliquer par des patrons de méthylation différentiels des gènes et/ou des allèles des gènes entre les hybrides génétiquement identiques. La diversité des lignées épiclonales peut quant à elle s’expliquer par la colonisation de plusieurs lignées épiclonales, s’établir en réponse à l’environnement ou de façon aléatoire. Plusieurs méthodes seront utilisées afin de survoler le génome des hybrides clonaux pour mettre en évidence le polymorphisme de méthylation de l’ADN à l’échelle de l’individu et entre les individus de différentes populations. / The aim of the thesis is to determine the extent of epigenetic variation, more specifically DNA methylation polymorphism, not linked to genetic variation in natural populations of an asexual vertebrate. This evaluation enables to better understand the importance that plays epigenetics processes in ecology and evolution. The biological model used is the clonal hybrid of the gynogenetic Chrosomus eos-neogaeus complex. Even in absence of genetic difference, an important phenotypic variability is observed among hybrids of the same clonal lineage living in different environments. Epigenetics, a modification of genes expression without a change at the DNA sequence, provides an explanation to this paradox. The diversity of phenotypes may be explained by differential methylation patterns of genes and/or alleles among genetically identical hybrids. The diversity of epiclonal lineages may be explained by the colonisation of many epiclonal lineages, established in response to the environment or stochastically. Many methods were used for screening the genome of clonal hybrids in order to highlight DNA methylation polymophism at the scale of an individual and among individuals of different populations.

Retrotransposons are major components of plant genomes influencing their genome size, organization and evolution. In the frame of this work, retrotransposons of the Beta vulgaris genome have been identified by molecular methods and whole genome bioinformatics approaches. Neither belonging to the rosids nor asterids, B. vulgaris (cultivated beet including sugar beet, beet root and mangold) is taxonomically placed at a key position at the root of the core eudicots, and considerably different from traditional plant model species such as thale cress or rice. Its genome has been sequenced, and annotation is under way. In order to compare different evolutionary lineages of B. vulgaris retrotransposons, long terminal repeat (LTR) and non-LTR retrotransposon family have been analyzed in detail. Full-length members have been isolated and characterized by bioinformatics, Southern and fluorescent in situ hybridization. Hallmarks of the LTR retrotransposon family Cotzilla are an additional env-like open reading frame (ORF), homogeneity of the members and the very high abundance. Most family members are evolutionarily young, and have most likely been created during recent bursts of amplification during species radiation. In contrast, the non-LTR retrotransposon family BNR has fewer copies and is much more diverged. Although the BNR ORF2 resembles previously analyzed long interspersed nuclear elements (LINEs) of the L1 clade, its ORF1 sequence differs strongly. It lacks the zinc finger domain described for plant LINEs, but contains instead an RNA recognition motif (RRM) likely to have an RNA-binding function. Database searches revealed the presence of similar LINE families in higher plant genomes such as poplar, lotus and soybean. Comparing their reverse transcriptase regions with other retrotransposons, these BNR-like LINEs form a separate group of L1 LINEs designated as BNR subclade. Availability of the B. vulgaris genome sequence allowed retrotransposon analyses on a genome-wide scale. A Hidden Markov Model-based detection algorithm has been developed in order to retrieve retrotransposon information directly from the database. Nearly 6000 B. vulgaris reverse transcriptase sequences have been isolated and classified into LTR retrotransposons of the Ty3-gypsy and Ty1-copia type, and non-LTR retrotransposons of the LINE type. As a result, a comprehensive overview of the retrotransposon spectrum of the B. vulgaris genome has been generated. Since plant LINEs have been only rarely investigated, the B. vulgaris LINE composition was studied in detail. Out of 28 described LINE clades, only members of the L1 and RTE clades have been identified. Based on a minimal shared sequence identity of 60 %, they form at least 17 L1 families and one RTE family. Full-length members of all investigated L1 families have been analyzed regarding their sequence, structure and diversity. In order to transfer the algorithm tested in B. vulgaris to other angiosperm genomes, twelve additional plant genomes have been queried for LINE reverse transcriptases. Key finding is the presence of only two LINE clades (L1 and RTE) in the analyzed genomes of higher plants. Whereas plant L1 LINEs are highly diverse and form at least seven subclades with members across species borders, RTE LINEs are extremely homogenized and constitute most likely only a single family per genome. In summary, this work’s results help to gain an understanding of the different strategies of retrotransposon evolution in plants, whereas the generated data directly contributes to the B. vulgaris genome annotation project. / Retrotransposons sind eine wesentliche Komponente von Pflanzengenomen, die sowohl die Größe und Organisation als auch die Evolution dieser Genome wesentlich beeinflussen können. Im Rahmen dieser Arbeit wurden verschiedene Gruppen von Retrotransposons des Beta vulgaris Genoms mittels molekularer und bioinformatischer Methoden identifiziert. Innerhalb der dikotyledonen Blütenpflanzen gehört B. vulgaris (kultivierte Rübe einschließlich Zuckerrübe, Roter Beete und Mangold) weder zu den Rosiden noch zu den Asteriden, sondern nimmt eine Schlüsselposition innerhalb der Kerneudikotyledonen ein. Somit zeigt das Rübengenom wesentliche Unterschiede zu traditionellen Modellpflanzen wie Arabidopsis thaliana oder Oryza sativa. Das Genom ist bereits sequenziert, die Annotation jedoch noch nicht abgeschlossen. Um verschiedene evolutionäre Linien von B. vulgaris Retrotransposons vergleichend zu untersuchen wurden insbesondere Long Terminal Repeat (LTR)- und Non-LTR-Retrotransposon-Familien detailliert analysiert. Vollständige Mitglieder wurden isoliert und mittels bioinformatischer Methoden, Southern- und Fluoreszenz-in situ-Hybridisierung untersucht. Die LTR-Retrotransposon-Familie Cotzilla ist durch einen zusätzlichen env-ähnlichen offenen Leserahmen (ORF), Homogenität ihrer Mitglieder und eine hohe Abundanz gekennzeichnet. Die meisten Cotzilla-Kopien sind evolutionär jung und wurden wahrscheinlich innerhalb eines kurzen Zeitraumes während der Artentstehung stark amplifiziert. Im Gegensatz zur Cotzilla-Familie besitzt die Non-LTR-Retrotransposon-Familie BNR weniger Kopien und ist wesentlich divergierter. Während der BNR-spezifische ORF2 starke Ähnlichkeiten zu anderen pflanzlichen Long Interspersed Nuclear Elements (LINEs) der L1-Klade aufweist, unterscheidet sich der BNR ORF1 von diesen sehr stark. Im Gegensatz zu bereits beschrieben pflanzlichen LINEs kodiert er kein Zinkfingermotiv, sondern substituiert dieses durch ein RNA-Erkennungsmotiv (RRM). Durch Datenbanksuche konnten BNR-ähnliche LINEs in den Genomen höherer Pflanzen wie Soja, Lotus und Pappel identifiziert werden. Ein Vergleich der entsprechenden Reversen Transkriptasen (RT) mit den RTs anderer Retrotransposons zeigt, dass die BNR-ähnlichen LINEs eine separate Gruppe innerhalb der L1 LINEs bilden. Diese wurde daher als BNR-Subklade definiert. Die Untersuchung von Retrotransposons auf Genomebene wurde durch die B. vulgaris Genomsequenz ermöglicht. Um Retrotransposon-Informationen direkt aus dem Genom zu extrahieren, wurde ein Hidden Markov Modell (HMM)-basierter Detektions-algorithmus entwickelt. Annähernd 6000 B. vulgaris Reverse Transkriptase-Sequenzen konnten identifiziert und in LTR-Retrotransposons des Ty3-gypsy- beziehungsweise des Ty1-copia-Typs und in Non-LTR-Retrotransposons des LINE-Typs klassifiziert werden. Somit wurde ein umfassender Überblick über die Bandbreite der B. vulgaris Retrotransposons arhalten. Da pflanzliche LINEs bisher nur wenig erforscht sind, wurde die B. vulgaris LINE Zusammensetzung genauer untersucht. Von 28 beschriebenen LINE-Kladen konnten nur Mitglieder der L1- und der RTE-Klade identifiziert werden. Basierend auf einer Identität von mindestens 60 % bilden die Sequenzen 17 L1 Familien und eine RTE Familie. Vollständige Mitglieder aller L1 Familien wurden hinsichtlich ihrer Sequenz, Struktur und Diversität analysiert. Um den in B. vulgaris getesteten HMM-basierten Algorithmus auf andere Angiospermengenome zu übertragen, wurden zwölf weitere Pflanzengenome auf das Vorhandensein von LINE-spezifischen Reversen Transkriptasen untersucht. Wesentlichstes Ergebnis ist der Nachweis von nur zwei LINE-Kladen (L1 und RTE) in höheren Pflanzen. Während pflanzliche L1 LINEs hochgradig divers sind und über Artgrenzen hinaus mindestens sieben Subkladen mit Vertretern verschiedener Pflanzen bilden, sind RTE LINEs extrem homogenisiert und stellen höchstwahrscheinlich nur eine einzelne Familie pro Genom einer Art dar. Zusammenfassend ermöglichen die Ergebnisse dieser Arbeit eine Erweiterung des Verständnisses der unterschiedlichen Evolutionsstrategien von Retrotransposons in Pflanzen. Zusätzlich tragen die gewonnen Daten zur Annotation des B. vulgaris Genoms bei.