Os elementos de transposição (TEs) são ubíquos e abundantes, presentes nos mais diversos genomas analisados até então. Neste trabalho foram estudadas duas famílias de elementos (hosimary e hobo) pertencentes à superfamília hAT de transposons que possui membros amplamente distribuídos. Descrevemos aqui uma nova família de TEs denominada hosimary que surgiu da análise de sequências inicialmente descritas por nosso grupo de pesquisa, e que foram denominadas hosim e hosec. Através de análise de PCR sequências homólogas a hosim e hosec foram buscadas no genoma de 51 espécies de drosofilídeos e foram detectadas apenas em espécies do subgrupo melanogaster de Drosophila e em Zaprionus indianus. Entre essas espécies o número de cópias observadas mostrou-se variável, sendo que a maioria das sequências mostrou-se potencialmente codificadora. A alta similaridade entre essas sequências de dois gêneros distintos, juntamente com inconsistências observadas entre a filogenia da espécie hospedeira e dos TEs, pode ser um indicativo de transferência horizontal desses elementos. Adicionalmente, as sequências apresentaram uma similaridade maior que 90%, e baixa similaridade com outros elementos descritos, o que nos levou a sugerir que essas sequências devam constituir uma nova família, a qual denominamos hosimary. A outra família analisada neste trabalho inclui os elementos hobo e hoboVA (ou hoboVAHS), que podem estar envolvidos em um fenômeno de hipermutabilidade observado por nosso grupo de pesquisa. Através da análise de expressão transcricional dos elementos foram detectados transcritos senso e antisenso, sugerindo a atuação de um mecanismo de interferência por RNA (iRNA) como controlador da atividade destes elementos. Através de hibridização in situ de embriões inteiros o padrão de expressão de hobo e hoboVAHS revelou similaridades com padrões observados para genes do desenvolvimento. Isso nos levou a sugerir a existência de sequências cis-reguladoras nos elementos que podem estar interagindo com genes do hospedeiro. A presença destas sequências cis-reguladoras em TEs pode ter implicações evolutivas, uma vez que podem ser geradoras de variabilidade genética. / Transposable elements (TEs) are ubiquitous and abundant in several analyzed genomes. In this work two TE families (hosimary and hobo), belonging to the hAT superfamily, were studied. Here is described a new family, called hosimary, that was arised of analyzes of two sequences initially described by our research group (hosim e hosec). By performing PCR analysis in 50 drosophilidae species, sequences homologous to hosim and hosec were detected in Drosophila species of the melanogaster subgroup and in Zaprionus indianus. The number of copies observed among these species showed to be variable and most sequences presented coding potential. High similarity between these sequences, which belong to two distinct genera, as well as some inconsistencies among the phylogeny of the host species and the TEs were observed. This can be an indicative of horizontal transfer of these elements. Additionally, the sequences presented more than 90% of mutual similarity and no significant similarity with other already described element. This led us to suggest this new transposon family, that we called hosimary. The other family analyzed in this work includes the hobo and hoboVA (or hoboVAHS) elements. These elements may be involved in a hypermutability phenomenon observed by our research group. Sense and antisense transcripts were detected by transcriptional expression analysis, which suggests an RNA interference mechanism (iRNA) controlling the activity of these elements. in situ hybridization of whole mount embryo analysis showed similarity of the hobo and hoboVAHS expression pattern with patterns observed in developmental genes. This led us to suggest the existence of cis-regulatory sequences into the elements that can be interacting with the host genes. The presence of these cis-regulatory sequences in TEs can be related to evolutionary issues since they can be responsible for genetic variability.

O elemento transponível hobo pode estar presente sob três formas no genoma de Drosophila simulans: como cópias autônomas completas (ou canônicas), como cópias defectivas internamente deletadas e como seqüências relacionadas a hobo (ou “relics”). Algumas evidências indicam que cópias completas e internamente deletadas são aquisições recentes desse genoma, enquanto os “relics” são componentes antigos, normalmente degenerados, defectivos e até recentemente considerados imóveis. O estudo desse tipo de seqüências pode ajudar a desvendar algumas questões sobre sua origem, dinâmica e seu papel na história evolutiva da família hobo. No presente trabalho, buscamos contribuir ao entendimento de algumas dessas questões estudando a dinâmica de uma família particular de seqüências relacionadas a hobo de D. simulans. Primeiramente, isolamos uma seqüência “relic” hobo envolvida no surgimento de uma mutação white de novo em uma linhagem hipermutável de D. simulans. Esta seqüência, denominada hobov-a, apresenta divergência típica de elemento “relic” em relação ao elemento canônico, é defectiva como outras já descritas, porém, mobilizável, pois apresentando estruturas essenciais para mobilização bem conservadas. Além disso, apresenta alta similaridade estrutural e de seqüência com um elemento “relic” de Drosophila sechellia, mas parece estar ausente do genoma de Drosophila melanogaster. A análise populacional de hobov-a revela que estes elementos são bem conservados entre diferentes populações de D. simulans. Apresentam, ainda, polimorfismo de sítios de inserção e variabilidade no número de cópias, o que nos dá fortes indícios de atividade atual ou recente desses elementos no genoma dessas populações. Pela similaridade compartilhada com elementos MITEs em muitas de suas características estruturais e funcionais, sugerimos, apontando algumas evidências, que elementos hobov-a podem ser ou uma nova família de MITEs de Drosophila ou, mais provavelmente, estariam se encaminhando para esse destino, utilizando o elemento canônico como fonte para sua mobilização.

Na tentativa de identificar possíveis vetores para transferência horizontal (fenômeno que vem sendo cada vez mais bem documentado) de elementos transponíveis entre espécies reprodutivamente isoladas de Drosophilidae, foi investigada a presença dos elementos transponíveis P e gypsy no genoma de quatro ácaros (parasitas ou potencialmente parasitas) e nove microhimenópteros parasitóides de Drosophila, através das técnicas de PCR e Southern blot. Estes organismos são parte integrante das guildas de invertebrados, cuja riqueza na Região Neotropical é particularmente expressiva. Em dois dos ácaros analisados (Proctolaelaps sp. e Macrocheles muscaedomesticae), reconhecidamente predadores de ovos de Drosophila, foram identificadas sequências com homologia a ambos os transposons, cuja forma de mobilização é diferente: gypsy é um retroelemento, com características de infectividade similares à dos retrovírus e P é um transposon de DNA, que usa uma transposase para mediar sua movimentação dentro e entre genomas. Embora seja ainda necessário isolar e clonar estas seqüências, de forma a permitir a sua comparação com os elementos P e gypsy de Drosophila, sugere-se a potencialidade destes ácaros como vetores de transferência horizontal. Dos genomas de oito entre os nove microhimenópteros (vespas) parasitóides de pupas de Drosophila estudados, foram amplificadas seqüências homólogas tanto com P, quanto com gypsy. Dada a compatibilidade ecológica e a íntima relação estabelecida entre essas vespas e Drosophila, a potencialidade desses organismos como vetores de transferência lateral entre taxa reprodutivamente isolados também é proposta.

A mobilização dos elementos de transposição (TEs) está sujeita a um conjunto complexo de mecanismos regulatórios que envolvem não apenas proteínas codificadas pelos próprios transposons, mas também pela célula hospedeira. Entretanto, até o momento, se conhece pouco sobre os fatores que levam à mobilização de TEs nos genomas hospedeiros. De uma maneira geral, fatores que expõem um organismo a situações de estresse levam à mobilização de transposons. Em função disso, propomos a adaptação, a nossas condições de laboratório, de uma metodologia de transformação genética para ser utilizada como ferramenta, na tentativa de contribuir na elucidação dos mecanismos de mobilização do elemento transponível hobo. Para o estabelecimento desta metodologia utilizamos como ferramentas um microscópio óptico binocular e um micromanipulador adaptado LEITZ. Neste micromanipulador foi acoplado um sistema de compressão a ar, composto por uma seringa de vidro de 20 ml e um dispositivo para infusão endovenosa (butterfly), onde é encaixada uma ponteira de micropipeta. Na ponteira, foi colada, com adesivo instantâneo, uma agulha feita a partir de capilares de vidro. O processo de microinjeção ocorreu em uma lâmina de microscopia contendo uma fita adesiva dupla-face que serve de suporte para os ovos a serem injetados. Com o auxílio de uma agulha histológica, ovos do mutante white de Drosophila simulans, previamente desidratados, foram decorionados manualmente e colocados enfileirados sobre este suporte para evitar deslocamentos durante a injeção. Posteriormente, os embriões foram imersos em “óleo de halocarbono”, e, em seguida, foi realizada a microinjeção de DNA. Para esta etapa do trabalho foram testados vários vetores de transformação, sendo mais eficaz o elemento transponível piggyBac, com o vetor pBac[3xp3-GFPafm], o qual possui um promotor que conduz uma forte expressão da proteína GFP (Green Fluorescent Protein) em tecidos do olho de moscas adultas, o que, sob luz laser azul, fluoresce com uma intensa cor verde. Com este vetor conseguimos a detecção de transformantes, e a comprovação da eficiência da metodologia estabelecida. A segunda etapa do trabalho teve como objetivo estudar a mobilização do transposon hobo por meio de microinjeção de DNA. Para isso foram utilizados os mutantes white, cuja mutação é causada pela inserção do elemento hobo “relic” (hoboVA) neste gene, e dpp-like de D. simulans. Como vetor de transformação foram utilizados, independentemente, os plasmídeos pHFL1 (hobo canônico), e BlueScript como controle. Os adultos microinjetados sobreviventes (G0) foram individualmente cruzados com outro da mesma linhagem, e, a partir deste cruzamento, foram estabelecidas cinco isolinhagens de cada G0 acompanhadas até a 3ª geração. Todos os indivíduos foram analisados quanto ao fenótipo, para possíveis eventos de reversão de mutação, e alguns, analisados molecularmente por Southern Blot. Foram observadas diversas alterações morfológicas, essencialmente nas asas, tanto em G0 como em seus descendentes. Na linhagem dpp-like foram observados eventos de reversão ao fenótipo selvagem, porém, essa característica não foi transmitida à descendência, indicando ausência de mobilização do elemento hobo, pelo menos em células germinativas. Para o mutante white, nenhum processo de reversão foi observado, sendo o número de indivíduos com alteração de asas menos pronunciado. No entanto, foi possível isolar uma nova isolinhagem dpp-like, provavelmente fruto de uma inserção de novo no gene dpp. Na análise molecular foi detectada a mobilização do elemento hobo em duas isolinhagens de dpp-like de um total de 27 isolinhagens analisadas, sugerindo uma taxa de mobilização do hobo canônico de 7,4%. Entretanto, não foi possível observar a mobilização de hoboVA através da reversão das mutações white e dpp-like. Isso mostra que a taxa de mobilização desse elemento deve ser inferior à do hobo canônico, e sugere que deve haver um mecanismo de regulação de transposição em hobo. / Transposable elements (TEs) mobilization depends on complex regulatory mechanisms that involve not only proteins codified by the transposons themselves, but also by the host cell. However, until the present, the factors that lead to the TEs mobilization in the host genomes are not well-known. Generally, factors that expose an organism to stress conditions lead to transposon mobilization. Therefore, we propose the adaptation of a transformation methodology to our laboratorial conditions, in order to investigate the mobilization mechanism of the hobo transposable element. To devise this methodology two tools were used: a binocular optic microscope and an adapted LEITZ micromanipulator. An air compression system comprising a 20 ml glass syringe and an intra-venous injection “butterfly” tube attached to a micro-pipette tip was coupled to the micromanipulator. A needle made of glass capillary tube was glued with instant adhesive to the micro-pipette tip. The micro-injection process was performed by using a microscope slide containing a double side adhesive band which served as support to the eggs to be injected. Aided by a histological needle, white mutant Drosophila simulans eggs, previously de-hydrated, were manually decorionied and lined up upon this support to avoid moving during the injection. After this step, the embryos were immersed in “halocarbon oil” and the DNA micro-injection was performed. In this part of the work several transformation vectors were tested, and the most efficient transposable element was the piggyBac with the pBac[3xp3-GFPafm] plasmid, which has a promoter that drives strong expression of the GFP (green fluorescent protein) in the eye-tissues of the adult flies; that fluoresce with a strong green color when exposed to blue laser light. With this vector we achieved the detection of transformants, as well as the proofing of the efficiency of the established methodology. The second step of the work was focused on the study of the hobo transposon mobilization by means of DNA microinjection. For this, white mutants, whose mutation is caused by the insertion of the hobo “relic” element (hoboVA) in this gene, and dpp-like of D. simulans, were used. The plasmids pHFL1 (canonical hobo) and BlueScript (control) were independently used as transformation vectors. The micro-injected adult survivors (Go) were individually crossed with other from the same line. From this crossing five isolines from each Go were obtained and observed until the 3rd generation. All individuals phenotype were analyzed in order to detect possible mutation reversion events, and some of them were molecularly analyzed by Southern Blot. Several morphological alterations were observed, essentially in the wings of the Go individuals as well as in their descendents. In the dpp-like line, events of reversion to wild phenotype were observed, however this characteristic was not transmitted to the descendents, indicating the absence of hobo element mobilization in the germ-line. No reversion process was observed for the white mutant, and the number of individuals with wings alterations was less expressive. However it was possible to insulate a new dpp-like isoline probably resulting of de novo insertion in the dpp gene. The molecular analysis showed the hobo element mobilization in two dpp-like isolines in a total of 27, suggesting a hobo canonic mobilization tax of 7.4%. Nevertheless, it was not possible to observe the hoboVA mobilization through white and dpp-like mutation reversion, showing that the mobilization tax of this element might be inferior to the canonic hobo and suggesting that may exist a regulatory mechanism of hobo transposition.

Errantivirus compreende um grupo monofilético de retrotransposons com LTRs de insetos, caracterizados pela presença do gene env em adição aos genes gag e pol. Nos retrovírus a proteína Env é responsável pela sua infecciosidade, causando a fusão do vírion com a membrana da célula. Dados recentes sugerem que os Errantivirus se originaram a partir de um retrotransposon desprovido de gene env que incorporou um gene para proteína de fusão de baculovírus por um evento de recombinação. O gypsy é o Errantivirus mais estudado, possui propriedades infecciosas comprovadas e um padrão evolutivo complexo. Já o retroelemento gtwin, proximamente relacionado ao gypsy, foi recentemente descoberto através da análise in silico do genoma de Drosophila melanogaster e ainda é pouco estudado. Esse trabalho visa ampliar o conhecimento sobre a história evolutiva desses dois Errantivirus através de buscas in silico nos genomas de Drosophila e análises filogenéticas do gene env. Nós mostramos que gtwin possui distribuição restrita ao subgrupo melanogaster e sua filogenia mostra algumas incongruências em relação à filogenia das espécies hospedeiras, sugerindo transmissão horizontal. Para gypsy, mostramos um grande número de subfamílias distribuídas em diferentes grupos de Drosophila, podendo coexistir mais de uma subfamília no mesmo genoma. Múltiplos eventos de transmissão horizontal são inferidos, evidenciando o padrão evolutivo complexo desse retroelemento reportado por outros autores. Além disso, relatamos a existência de seqüências potencialmente codificadoras de Env funcional para a maioria das seqüências envolvidas em transmissão horizontal, para os dois elementos. Esses dados sugerem que essas seqüências podem ser retrovírus com capacidade de invadir novos genomas sem necessitar de vetor, suportando a hipótese sugerida por outros autores de que ondas infecciosas poderiam explicar o padrão evolutivo dos Errantivirus. / Errantivirus comprises a monophyletic group of insect LTR retrotransposons, which has an env gene in addition to gag and pol genes. In retroviruses, the Env protein is responsible for its infectious properties, causing the fusion of the virion to the cell membrane. Recent data suggest that Errantivirus have originated from a retrotransposon unprovided of env gene, which incorporated a fusion protein gene from baculovirus by a recombination event. Gypsy is the most studied Errantivirus, it has proved infectious properties and a complex evolution pattern. Otherwise, gtwin, closely related to gypsy, was recently found through in silico analysis of Drosophila melanogaster genome and it is still poorly studied. This work aim to amplify the knowledge about the evolutionary history of both gypsy and gtwin Errantivirus, through in silico genome search of Drosophila and phylogenetic analysis of the env gene. We show that gtwin has a distribution restricted to the melanogaster subgroup and its phylogeny shows incongruences with host species phylogeny, suggesting horizontal transmission events. Gypsy show a high number of subfamilies spread in different Drosophila groups and more than one subfamily can coexist in the same genome. Multiple events of horizontal transmission are inferred, making evident the complex evolution pattern of gypsy reported by some authors. Moreover, it was reported the existence of DNA sequences putatively encoding Env proteins in most of the sequences involved in horizontal transfer, for both gypsy and gtwin elements. Our data suggest these sequences can be retroviruses with capacity to invade new genomes without require a vector, corroborating the hypothesis suggested by other authors that infectious waves could explain the complex evolutionary pattern of Errantivirus.

Apesar da grande quantidade de informação disponível a respeito dos elementos transponíveis (TEs), há muito a ser pesquisado, principalmente em relação à ocorrência de diferentes elementos em muitas espécies e ao fenômeno de transferência horizontal. Entretanto, os mecanismos pelos quais tais transferências horizontais ocorrem permanece desconhecido. O presente trabalho buscou contribuir para a compreensão do fenômeno de transferência horizontal de elementos transponíveis através da procura de possíveis vetores entre ácaros parasitas e microhimenópteros parasitóides de Drosophila. Através das abordagens de PCR e southern blot, foi observada a existência de seqüências homólogas ao elemento P e ao retroelemento gypsy de Drosophila melanogaster no genoma de dois ácaros predadores de ovos de Drosophila analisados, Proctolaelaps sp. e Macrocheles muscaedomesticae. Com as mesmas abordagens, foi observada a existência de seqüências homólogas ao elemento P e ao retroelemento gypsy de Drosophila melanogaster nos genomas de oito taxa de vespas parasitóides de Drosophila encontradas em diferentes locais de coleta. Os microhimenópteros estudados pertencem às Superfamílias Cynipoidea, Chalcidoidea, Proctotrupoidea e Ichneumonoidea. A partir de amostras de frutos vindos da natureza, microhimenópteros parasitóides de Drosophila emergidos em laboratório, pertencentes ao Gênero Ganaspis e à família Diapriidae, foram criados parasitando Drosophila melanogaster por até sete gerações. Foram encontradas seqüências homólogas ao elemento P e ao retroelemento gypsy de Drosophila no genoma destes microhimenópteros analisados. O seqüenciamento destas amostras demonstrou que as seqüências dos fragmentos amplificados pelos primers desenhados para o elemento P de D. melanogaster apresentaram 100% de similaridade com o elemento P de D. willistoni. Quanto ao retroelemento gypsy, as amostras da família Diapriidae apresentaram seqüências com 100% de homologia com a seqüência de gypsy de D. melanogaster. As amostras do gênero Ganaspis apresentaram seqüências com 99% de homologia ao retroelemento gypsy de Drosophila melanogaster. Considerando as características ecológicas próprias das assembléias de Drosofilídeos, muitos deles compartilhando substratos de criação e de alimentação, convivendo intimamente com parasitas como ácaros, parasitóides como microhimenópteros e com uma ampla gama de microorganismos, não podemos descartar a potencialidade destes organismos em oportunizar eventos de transferência horizontal. Esforços para identificar elementos transponíveis em outros táxons, entretanto, são ainda necessários para melhor entender a evolução dessas seqüências nos genomas onde estão inseridas. / Despite the vast amount of information available about the transposable elements (TEs), there is much to be studied, especially in relation to the occurrence of different elements in many species and the phenomenon of horizontal transfer. However, mechanisms of these horizontal transfers remain unknown. The present study was made aiming to contribute to the comprehension of the phenomenon of horizontal transfer of transposable elements, through the search for putative vectors, such as parasitic mites and microhymenopteran parasitoids of Drosophila. Using PCR and southern blot assays, it was detected the presence of sequences homologous to the P element and to the gypsy retroelement of Drosophila melanogaster in the genomes of two of the mites predators of eggs of Drosophila analyzed, Proctolaelaps sp. and Macrocheles muscaedomesticae. Through the same approaches, we observed the existence of sequences homologous to the P element and to the gypsy retroelement of Drosophila melanogaster in the genomes of eight wasps, parasitoids of Drosophila, collected in different sites in nature. The microhymenopterans studied are members of the Superfamilies Cynipoidea, Chalcidoidea, Proctotrupoidea and Ichneumonoidea. From samples of rotten fruits collected in the field, microhymenopterans parasitoids of Drosophila emerged in the laboratory, members of the Ganaspis genus and of the Diapriidae family, were reared parasiting Drosophila melanogaster flies during until seven generations. The presence of sequences homologous to the P element and to the gypsy retroelement of Drosophila was detected in the genome of the wasps analyzed. The sequencing of those samples revealed that the fragments amplified by the primers drawn to detect the P element of D. melanogaster, are 100% similar to the P element of Drosophila. willistoni. Respect to gypsy, the samples of the wasps of the Diapriidae family presented sequences with 100% of homology with the sequence of gypsy of D. melanogaster, whereas the samples of the genus Ganaspis presented sequences with 99% of similarity with the gypsy retroelement of Drosophila melanogaster in their genomes. Considering the ecological characteristics of the Drosophilidae assemblages, where several of them share same substrates as breeding and feeding sites and co-exist in intimacy with parasites such as mites, with parasitoids, such as microhymenopterans, and with several microorganisms, we can not discharge the potentiality of many of them to mediate events of horizontal transfer. Efforts to identify transposable elements in other taxa, however, are still necessary for a better understanding of the evolution of those sequences in the genomes where they are inserted.

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No. of bitstreams: 2 license_rdf: 811 bytes, checksum: e39d27027a6cc9cb039ad269a5db8e34 (MD5) DISSERTAÇÃO Elizabeth Maria Bispo Beltrão.pdf: 1979482 bytes, checksum: 4c352a671acf0ad5c11d2ee0a0879114 (MD5) Previous issue date: 2017-02-23 / CAPES / Enterobacter aerogenes é uma enterobactéria frequentemente envolvida em Infecções Relacionadas a Assistência à Saúde, que pode apresentar resistência às diferentes classes de antimicrobianos. Há evidências de que a aquisição de resistência nessa espécie, se deve à disseminação plasmidial, juntamente com transposons, entre bactérias gram-negativas. Portanto, o objetivo deste trabalho foi realizar a caracterização de grupos de incompatibilidade plasmidiais (Incs) e determinar o ambiente genético de blaKPC-2 e outros genes de resistência presentes em plasmídeos de isolados clínicos de E. aerogenes provenientes de um hospital público de Recife-PE. Foram selecionados 17 isolados clínicos de E. aerogenes, carreadores do gene blaKPC, e os mesmos foram submetidos a PCR para os grupos Incs A/C, L/M e HI-2. Foram selecionados dois isolados de E. aerogenes para o sequenciamento do DNA plasmidial, por serem provenientes de septicemia em pacientes de UTI e portadores do gene blaKPC. Todos os 17 isolados foram positivos na PCR para os Incs A/C e L/M, enquanto o Inc HI-2 não foi detectado. Na análise do sequenciamento plasmidial além da confirmação da presença do gene blaKPC-2, também foram encontrados os genes de resistência, blaSCO-1, sul2 e aph (3')-VIi. O gene blaKPC-2 foi encontrado inserido no transposon Tn4401 com uma deleção da sequência de inserção ISKpn7 e dos genes istA, istB e transposase (TnpA). Próximo ao gene blaKPC-2 também foi encontrado o gene aph (3')-VIi. Com relação ao gene blaSCO-1, este foi encontrado próximo a uma transposase tnpAtnpR, sendo este o primeiro relato do gene blaSCO-1 em isolados de E. aerogenes. A presença de diferentes genes de resistência, inseridos em plasmídeos Inc A/C₂ e L/M, confirmam a importância de se monitorar a circulação dos plasmídeos e analisar as sequências gênicas dessas estruturas. Deve-se destacar que embora o gene blaKPC-2 tenha sido codificado dentro do elemento Tn4401, foram encontradas diferentes características estruturais, notadamente a perda de tnpA e ISKpn7, indicando uma nova versão do Tn4401 (a ser denominada Tn4401i). Essas características podem fazer com que o transposon Tn4401 perca sua capacidade de transposição, pois as sequências de inserção são essenciais para a sua mobilidade. Estes achados enfatizam ainda a continuada recombinação e evolução de plasmídeos e do elemento Tn4401 que contém o gene blaKPC-2, e o potencial de disseminação plasmidial de diferentes genes de resistência por E. aerogenes no ambiente hospitalar. / Enterobacter aerogenes is a frequently enterobacterium involved in healthcare-associated infections, it may be resistant to different antimicrobials agents classes. There is evidence of resistance acquisition in this species, due to plasmid propagation, along with transposons between gram-negative bacteria. This study aimed to characterize Plasmid Incompatibility Groups (Incs) and to determine the genetic region of blaKPC-2 and other resistance genes present in plasmids from clinical isolates of E. aerogenes from a public hospital in Recife/PE. Seventeen clinical isolates of E. aerogenes carriers of the blaKPC gene were selected and subjected to PCR for the Incs A/C, L/M and HI-2 groups. Only two E. aerogenes isolates were selected for the sequencing of the plasmid DNA by carriers blaKPC-2 gene and from septicemia in ICU patients. All seventeen strains were PCR positive for Incs A/C and L/M, while Inc HI-2 was not detected. Plasmid sequencing confirmed the presence of the blaKPC-2 gene, and resistance genes, blaSCO-1, sul2 and aph (3')-Vi were also found. blaKPC-2 gene was found inserted in Tn4401 transposon with deletion of the ISKpn7 insertion sequence and the istA, istB gene and a transposase (TnpA). Next to the blaKPC-2 gene was also found the aph (3')-VIi gene. Related to the blaSCO-1 gene, it was found next to a tnpAtnpR transposase, which is the first report of the blaSCO-1 gene in E. aerogenes isolates. Presence of different resistance genes inserted in Inc A/C₂ and L/M plasmids confirm the importance of monitoring the circulation of plasmids and analyzing their gene sequences. It is important to note that although the blaKPC-2 gene was encoded within the Tn4401 element, different structural characteristics were found; noting that the loss of tnpA and ISKpn7 indicated a new version of Tn4401 (will be called Tn4401i). These characteristics may do the transposon Tn4401 to lose its transposing ability, since the insertion sequences are essential for its mobility. These findings emphasize the continuous recombination and evolution of plasmids and Tn4401 element that contains the blaKPC-2 gene, in addition to the potential for plasmidial dissemination of different resistance genes by E. aerogenes in the hospital environment.

O elemento transponível Galileo foi encontrado em Drosophila buzzatii e é apontado como o responsável pela formação de três inversões descritas para esta espécie: 2j, 2z3 e 2q7, através de recombinação ectópica. Análises in silico dos 12 genomas de Drosophila disponíveis constatou que ele é distribuído no gênero, estando presente também nos genomas de D. ananassae, D. pseudoobscura, D. persimilis, D. mojavensis, D. willistoni, as quais são reconhecidamente polimórficas, e D. virilis. Drosophila willistoni destacou-se nestas análises devido à presença de 495 cópias defectivas do elemento transponível Galileo encontradas em seu genoma, uma quantidade maior do que nas demais espécies. Estes achados somados com o fato de D. willistoni figurar entre as espécies mais polimórficas de Drosophila abrem um estimulante campo para os estudos da associação do elemento transponível Galileo com seu polimorfismo. O presente estudo analisou através de hibridização in situ a presença do elemento transponível Galileo nos cromossomos politênicos de três linhagens de D. willistoni oriundas de locais distintos da distribuição geográfica da espécie: Gd-H4-1 (América Central), a linhagem utilizada no sequenciamento; WIP-4 (nordeste do Brasil) e 17A2 (sul do Brasil), e estabeleceu as coincidências de inserções deste elemento com pontos de quebra descritos para a espécie e as coincidências com sítios de inserções do elemento P. Para tal, utilizou-se uma sonda com 2441 pb, baseada na maior variante do elemento transponível Galileo encontrada in silico, a qual não engloba suas repetições terminais invertidas (TIRs), portanto somente hibridiza com cópias mais completas do elemento. Nossas análises encontraram 100 sítios de inserções do elemento transponível Galileo distribuídos em todos os cromossomos de D. willistoni. Destes, 20 coincidem com pontos de quebra para inversões paracêntricas descritas, dois com pontos de quebra de uma rara inversão pericêntrica descrita e 10 com sítios de inserção do elemento P. O padrão de distribuição dos sinais de hibridização foi altamente similar entre as três linhagens. Também foram encontrados sinais de hibridizações nos cromocentros das linhagens analisadas. Associações estatisticamente significativas de sítios de inserção do elemento transponível Galileo com pontos de quebra ocorreram nos braços cromossômicos XR e IIL em Gd-H4-1 e IIL em WIP-4. Quando o reuso (compartilhamento) dos pontos de quebras para as diferentes inversões foi considerado, o cromossomo III também apresentou associações estatisticamente significativas em Gd-H4-1 e WIP-4. As análises quanto à distribuição geográfica das inversões mostrou que houve maior coincidência de sítios de inserções do elemento transponível Galileo que correspondem a pontos de quebra de inversões com distribuição restrita, ou seja, provavelmente mais recentes na história evolutiva da espécie. Com base em nossos resultados, é possível inferir que o elemento transponível Galileo é um elemento transponível antigo no genoma de Drosophila willistoni, e que a sua maior prevalência com pontos de quebra de inversões mais recentes pode estar associada à sua característica de formar estruturas secundárias quando desnaturado e assim promover rearranjos cromossômicos, mesmo se tratando de uma cópia defectiva. / The Galileo transposable element was discovered in Drosophila buzzatii and was appointed as responsible for the formation of three chromosomal inversions: 2j, 2z3 e 2q7 by ectopic recombination. In silico analyses of the 12 Drosophila genomes available showed that it is widely distributed in the genus, being present in the genomes of D. ananassae, D. pseudoobscura, D. persimilis, D. mojavensis, D. willistoni, recognized as chromosomally polymorphic, and in D. virilis. Drosophila willistoni was particularly interesting among the others, because of the finding of 495 defective copies of the Galileo transposable element in its genome, the highest amount found among all the studied species. Those results, and the fact that D. willistoni is one of the most polymorphic species of Drosophila, opened a stimulating field of study for the probable relationship between the Galileo transposable element and its chromosomal polymorphism. In the present study we analyzed the presence and the polytene chromosomal localization of the Galileo transposable element in three strains of D. willistoni from different geographical origins, through in situ hybridization: Gd-H4-1 (from Guadaloupe Island, Central America), the strain sequenced; WIP-4 (from Northeast Brazil) and 17A2 (from South Brazil), and detected coincidences of the Galileo transposable element insertion sites with break points of inversions known in this species and with sites of P element insertions. For this, we used a 2441 pb probe, drawn according to the larger variant of the Galileo transposable element found in silico, not including its inverted terminal repetitions (TIRs), thus only hybridizing with more complete copies of the element. We registered 100 sites of the Galileo transposable element insertions, distributed in all chromosomes of Drosophila willistoni. Among them, 20 coincide with break points of described paracentric inversions, two with those of a rare pericentric inversion and 10 with insertion sites of the P transposable element. The pattern of distribution of the hybridization signals was highly similar among the three strains. We also found hybridization signals in the chromocenters of all the strains analyzed. Statistically significant associations between insertion sites of the Galileo transposable element insertions with break points of inversions were detected in the chromosomal arms XR and IIL in Gd-H4-1 and IIL in WIP-4 samples. When the reuse (sharing) of the break points of different inversions was evaluated, we observed significant associations in the data of the third chromosome (III) of the Gd-H4-1 and WIP-4 samples. The analyses of the geographical distribution of the inversions showed higher coincidences of the Galileo transposable element insertions and break points of inversions with narrower distribution, i.e., apparently more recent in the evolutionary history of the species. Considering all our findings, we suggest Galileo as an ancient transposable element in the genome of D. willistoni, and that its apparent preference for break points of more recent inversions, can be due to its molecular characteristic of forming secondary structures when denatured, so promoting chromosomal rearrangements, even if it is a defective copy.

O objetivo deste projeto foi entender a organização genômica e o conteúdo de genes de dois fitopatógenos relacionados geneticamente, mas que infectam diferentes hospedeiros: Leifsonia xyli subsp. xyli (Lxx), um patógeno de cana-de-açúcar; e Leifonia xyli subsp. cynodontis (Lxc), um patógeno de gramíneas do gênero Cynodon. Os resultados do seqüenciamento parcial do genoma de Lxc são descritos, incluindo as seqüências comuns ao genoma de Lxx e os fragmentos de organização distinta e genes específicos de Lxc. Para alcançar o objetivo, bibliotecas genômicas do genoma de Lxc foram construídas. A estratégia revelou seqüências específicas, algumas provavelmente adquiridas por transferência horizontal, e regiões não sintênicas do genoma de Lxc, quando comparadas com Lxx. Regiões específicas somaram 311.353 pb e foram anotadas. Devido a associação de elementos genéticos móveis com reorganização cromossômica e transferência horizontal de genes, um estudo detalhado dos transposons do tipo IS, presentes em ambos os genomas, foi realizado. A análise revelou um número variável de elementos para cada genoma atuando na diversificação dos mesmos. / This study aimed to understand genome organization and gene content of two closely related plant pathogens that infect different hosts: Leifsonia xyli subsp. xyli (Lxx), a sugarcane pathogen; and Leifonia xyli subsp. cynodontis (Lxc), a Cynodon grass pathogen. We describe the results of a partial genome sequence of Lxc, assessing the similarity to Lxx completely sequenced genome, describing differences in genome organization and uncovering genes specific to Lxc genome. To accomplish the objective, genomic libraries were constructed. The strategy uncovered specific sequences, some probably acquired by horizontal transfer and non-syntenic regions of Lxc genome compared to Lxx. Specific regions of Lxc genome accounted for 311,353 bp and were annotated. Because mobile genetic elements are often associated with rearrangements and horizontal gene transfer, a detailed study of all insertion sequence (IS) elements presented in both genomes were realized. The analysis revealed a variable number of transposable elements acting upon genomic diversity.

Les piwi-interacting RNAs (piRNA) interagissent avec les protéines qui font partie de la branche PIWI de la famille des Argonautes. Ils participent à la répression des transposons dans la ligne germinale. Chez la souris, les protéines PIWI sont indispensables pour la fertilité des mâles et sont responsables de la méthylation de l'ADN au niveau des promoteurs des transposons. Les piRNA sont produis à partir de deux mécanismes: la biogenèse primaire et le cycle d'amplification ping-pong. Nous avons fait des études fonctionnelles sur deux protéines qui participent à la voie des piRNA: l'hélicase d'ARN MOV10L1 et l'immunophiline FKBP6. Nous avons décrit le rôle de MOV10L1 en tant que facteur de biogenèse primaire. La disruption génétique du domaine hélicase de MOV10L mène à une activation des transposons et à une perte de la méthylation de l'ADN. Ainsi, les piRNA ne sont pas produits chez le mutant, ce qui suggère que MOV10L1 est essentielle pour la biogenèse des piRNA. Tdrd1 interagit avec les protéines PIWI et joue un rôle dans la voie des piRNA en recrutant quelques facteurs à partir de son domaine MYND N-terminal. Nous avons montré que le domaine MYND de Tdrd1 interagit avec FKBP6, une protéine qui appartient à une famille d'isomérases de prolines qui sont présentes dans des complexes de chaperonnes. Les études biochimiques réalisées indiquent que FKBP6 est inactive et qu'elle utilise son domaine isomérase comme un module structural qui interagit avec les protéines PIWI, alors qu'elle interagit avec Hsp90 avec son domaine TPR. L'analyse d'une souris mutante pour fkbp6 a révélé une dérépression des transposons et une perte de la méthylation de l'ADN, mais peu d'effets sur la biogenèse primaire. Ces résultats sont en accord avec un rôle de FKBP6 en aval de Tdrd1, et nous pouvons penser que ce rôle pourrait être le recrutement de Hsp90 pour participer au cycle d'amplification ping-pong. / Piwi-interacting RNAs (piRNAs) associate to members of the PIWI clade of Argonaute proteins and are responsible for silencing of transposable elements in animal germ lines. In mouse, PIWI proteins mediate DNA methylation at the level of transposon promoters and are required for male fertility. piRNAs are produced through two biogenesis pathways, known as primary processing and ping-pong amplification cycle. This study focuses on the functions of two PIWI-associated proteins: the putative RNA helicase MOV10L1 and the immunophilin FKBP6. Here, the role of MOV10L1 as a primary piRNA processing factor is described. Genetic disruption of MOV10L1's RNA helicase domain results in male-specific sterility and derepression of retrotransposons due to reduction of DNA methylation. A complete loss of piRNAs is observed in the mutant, pointing to a pivotal role of MOV10L1 in piRNA biogenesis. Tdrd1 associates with PIWI proteins and has been suggested to play a role in the piRNA pathway by recruiting some factor through its N-terminal MYND domain. We show that Tdrd1's MYND domain interacts with FKBP6, which belongs to a family of prolyl isomerases present in chaperone complexes. Biochemical studies suggest FKBP6 is inactive and uses its prolyl isomerase domain as a structural module for binding PIWI proteins, while binding Hsp90 through its TPR domain. Analysis of an fkbp6 mutant mouse reveals transposon derepression and loss of DNA methylation, but little defects in primary piRNA biogenesis. These results are consistent with a role of FKBP6 downstream of Tdrd1, and we speculate that it might recruit Hsp90 to PIWI complexes to mediate ping-pong amplification cycle.