Made available in DSpace on 2014-10-09T12:48:54Z (GMT). No. of bitstreams: 0 / Made available in DSpace on 2014-10-09T14:01:11Z (GMT). No. of bitstreams: 1 09617.pdf: 5595560 bytes, checksum: 5a054c653d88ec87b2d3c979b79b00b5 (MD5) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / Dissertacao [Mestrado] / IPEN/D / Instituto de Pesquisas Energeticas e Nucleares - IPEN/CNEN-SP / FAPESP:00/09008-4

Made available in DSpace on 2014-10-09T12:42:23Z (GMT). No. of bitstreams: 0 / Made available in DSpace on 2014-10-09T14:02:00Z (GMT). No. of bitstreams: 0 / A influência do butirato de sódio (NaBu), do cloreto de manganês (MnCl2), combinados ou isolados, e da cicloheximida (CHX) na síntese de tireotrofina humana recombinante (r-hTSH) derivada de células CHO foi investigada pela primeira vez. Com exceção da CHX, que gerou uma redução de 1,5 vezes na produtividade volumétrica, todos os reagentes geraram um aumento (1,4 vezes para o MnCl2 e 3 vezes para o NaBu e NaBu+MnCl2) na produtividade volumétrica. Também foi observada uma diminuição no número de células viáveis com a utilização de todos os reagentes. A adição destes reagentes ao meio de cultura de células CHO produtoras de hTSH gerou também alterações na glicosilação do r-hTSH. As alterações geradas pela presença de CHX foram todas negativas, resultando em uma diminuição de 5,5% no conteúdo de ácido siálico, 10% na ocupação dos sítios de glicosilação, além de uma diminuição no conteúdo de todos os monossacarídeos neutros. Os demais reagentes, por outro lado, resultaram em alterações positivas. A presença de NaBu no meio de cultura acarretou um aumento de 12% no conteúdo de ácido siálico e de 3% na ocupação dos sítios de glicosilação. Com relação às estruturas de carboidratos presentes no hTSH, foi observado um aumento de 14% nas estruturas bi-antenárias, aumento no conteúdo de manose e fucose e uma diminuição no conteúdo de galactose e N-acetilglucosamina. A presença de MnCl2 no meio de cultura resultou em um aumento de 1,7% no conteúdo de ácido siálico e de 1,3% na ocupação dos sítios de glicosilação. Houve ainda um aumento no conteúdo de manose e N-acetilglucosamina e uma diminuição no conteúdo de fucose e galactose. Um aumento de 7% na freqüência de estruturas bi-antenárias foi também observado quando MnCl2 foi utilizado. O uso simultâneo de NaBu e MnCl2 proporcionou um aumento de 14% no conteúdo de ácido siálico e de 3% na ocupação dos sítios de glicosilação, bem como um aumento no conteúdo de todos os monossacarídeos neutros. Não houve, entretanto, alterações na freqüência das estruturas de carboidratos. Apesar de todas as alterações causadas pelos diferentes reagentes, não foram observadas diferenças na atividade biológica ou no comportamento farmacocinético das diferentes preparações de hTSH estudadas. Este estudo é extremamente relevante, tanto do ponto de vista do desenvolvimento de novos biofármacos, quanto do ponto de vista do controle de qualidade das glicoproteínas hormonais já utilizadas na clínica médica. / Tese (Doutoramento) / IPEN/T / Instituto de Pesquisas Energeticas e Nucleares - IPEN-CNEN/SP

Made available in DSpace on 2014-10-09T12:26:48Z (GMT). No. of bitstreams: 0 / Made available in DSpace on 2014-10-09T14:06:19Z (GMT). No. of bitstreams: 0 / Uma linhagem celular de CHO, previamente modificada geneticamente pela introdução de cDNA da 2,6 sialiltransferase de rato, gerou, pela primeira vez, um hTSH recombinante com sialilação humanizada (hlsr-hTSH), mais similar ao hormônio nativo, com 61% de ligação de ácido siálico na conformação 2,3 e 39%, na conformação 2,6. O clone mais produtivo, quando submetido à amplificação gênica com 8 M de metotrexato, apresentou um nível de secreção de aproximadamente 2 g de hTSH/106 células/dia, nível este útil para a purificação e caracterização do produto. A massa molecular relativa do heterodímero e das subunidades e do hlsr-hTSH purificado, determinada por espectrometria de massa MALDI-TOF, e a hidrofobicidade relativa, determinada por RP-HPLC, não apresentaram diferenças significativas com relação às preparações de hTSH recombinante derivadas de células CHO sem a modificação devida ao gene da 2,6 sialiltransferase. Entretanto, algumas diferenças foram observadas na composição dos N-glicanos, com mais estruturas tri- e tetra-sialiladas no hlsr-hTSH. O hlsr-hTSH mostrou-se eqüipotente (p>0,05) à preparação comercial de r-hTSH (Thyrogen) e 1,5 vezes mais potente do que a preparação nativa de hTSH (p<0,001), quando analisado por um bioensaio in vivo baseado na capacidade do TSH de estimular a liberação de T4. / Dissertacao (Mestrado) / IPEN/D / Instituto de Pesquisas Energeticas e Nucleares - IPEN-CNEN/SP

Made available in DSpace on 2014-10-09T12:53:36Z (GMT). No. of bitstreams: 0 / Made available in DSpace on 2014-10-09T14:08:07Z (GMT). No. of bitstreams: 0 / Neste trabalho foi desenvolvida pela primeira vez uma estratégia de purificação com duas etapas, uma cromatografia de troca iônica e uma cromatografia líquida de alta eficiência em fase-reversa (RP-HPLC), para obter um hTSH derivado de CHO (r-hTSH-IPEN), que mostrou-se rápida e prática, permitindo um rendimento de 70% e uma pureza > 99%. Um aumento de ~60% na produtividade de r-hTSH-IPEN foi observado quando condições de cultura celular foram alteradas de 5% de CO2 para ar (0,03% CO2). A qualidade dos produtos obtidos em ambas as condições foi avaliada com relação à estrutura dos N-glicanos, aos isômeros de carga e à atividade biológica em comparação com a única preparação comercial conhecida (Thyrogen®) e com uma preparação de referência de origem hipofisária (p-hTSH) do National Hormone and Pituitary Program (NIDDK, EUA). Os N-glicanos identificados nas preparações recombinantes foram do tipo complexo, apresentando estruturas bi-, tri- e tetra- antenárias, algumas fucosiladas, sendo 86-88% sialiladas com níveis variáveis. As três estruturas mais abundantes foram monosialiladas, representando ~69% de todas as formas identificadas nas três preparações. A principal diferença foi encontrada em termos de antenaridade, com 8-10% mais estruturas bi-antenárias na ausência de CO2 e 7-9% mais estruturas tri-antenárias na presença de CO2. No caso do p-hTSH foram identificadas estruturas do tipo complexo, com alta-manose e híbridas, a maioria delas contendo resíduos terminais de ácido siálico e/ou sulfato. As duas estruturas mais abundantes contem um ou dois resíduos de sulfato, sendo que no primeiro caso ele inesperadamente se liga a uma galactose. A porcentagem de ligação do ácido siálico à galactose nas conformações 2-3 e 2-6 foi de 68 ± 10% e 32 ± 10% respectivamente. Não foram observadas diferenças fundamentais nos isômeros de carga, nas três preparações recombinantes, os perfis da focalização isoelétrica mostrando seis bandas distintas no intervalo de pI de 5,39 a 7,35. Uma distribuição consideravelmente diferente, com várias formas na região ácida, foi observada, no entanto, para duas preparações hipofisárias. Uma bioatividade ligeiramente superior (p <0,02) foi encontrada para o r-hTSH-IPEN obtido na presença de CO2 quando as preparações foram analisadas com boa precisão por um simples bioensaio em dose única; esta atividade, no entanto, não é significativamente diferente da atividade do Thyrogen, as duas preparações sendo 1,6 e 1,8 vezes mais potentes do que a preparação de referência (p-hTSH). Podemos concluir que, pelo menos para o caso dos r-hTSH derivados de CHO, diferentes condições de cultivo não afetam significativamente as estruturas dos N-glicanos, distribuição de isómeros de carga ou atividade biológica. Thyrogen e r-hTSH-IPEN, quando comparados com p-hTSH-NIDDK, apresentaram cerca de 7% de aumento da massa molecular determinada por MALDI-TOF-MS. Esta técnica, que permite uma avaliação exata da massa do heterodímero, apresentou valores de MR de 29611, 29839 e 27829, respectivamente. Diferenças significativas foram encontradas entre o r-hTSH e o p-hTSH pelo que se refere às propriedades hidrofóbicas, avaliadas por RP-HPLC. Também foram observadas diferenças relacionadas à composição de carboidratos, principalmente de ácido siálico e galactose, tendo sido encontrado um menor teor destes resíduos no p-hTSH. / Tese (Doutoramento) / IPEN/T / Instituto de Pesquisas Energéticas e Nucleares - IPEN-CNEN/SP

Elevated Thyroid-Stimulating Hormone (TSH) is associated with an increased risk of cardiovascular disease (CVD). We hypothesized that TSH-stimulated FA release from adipocytes contributes to macrophage inflammation. 3T3-L1 and human subcutaneous differentiated adipocytes were treated with TSH for 4 hours under various conditions and lipolysis assessed via glycerol secretion. Optimal conditions were determined and protein expression of ATGL, HSL and perilipin remained stable. TSH-stimulated 3T3-L1 or human adipocyte-conditioned medium (T-ACM) was placed on murine J774 or human THP-1 macrophages, respectively, and macrophage cytokine mRNA levels (IL-1β, IL-6, MCP-1, and TNFα) were measured by real-time RT-PCR. T-ACM did not change cytokine mRNA expression in J774 macrophages or THP-1 macrophages when compared to ACM. Absence of BSA in the medium may have hindered release of FA from differentiated adipocytes into the medium, BSA may be required to permit adequate FA accumulation in the medium to then evaluate the effect of T-ACM on macrophages. Further investigation is required to determine the effect of FA on J774 and THP-1 inflammatory response.

In subclinical hypothyroidism (SH), high levels of circulating thyroid stimulating hormone (TSH) maintain normal thyroid hormone levels, despite mild thyroid failure. SH is associated with cardiovascular disease and insulin resistance, although the underlying pathophysiology is not fully understood. We hypothesized that TSH may inhibit insulin action in adipocytes. To investigate this relationship, we studied primary human differentiated adipocytes. Abdominal subcutaneous adipose tissue samples were obtained (approved by OHSN-REB) from 16 weight-stable patients undergoing elective abdominal surgery. We stimulated adipocytes differentiated from stromal preadipocytes with 5 mU/ml TSH and/or 100 nM insulin, and assessed acute insulin signaling, lipogenesis and glucose uptake. Immunoblot analysis revealed that TSH suppressed insulin-stimulated Akt phosphorylation by 45% (n=5; p = 0.01). When adipocytes were pre-incubated with conventional protein kinase C (cPKC) inhibitor Gö6976, TSH inhibition was blocked. Our data indicate that TSH inhibits insulin-stimulated lipogenesis (up to 37%), but depends on BMI. Insulin-stimulated glucose uptake was enhanced by 36% and also correlated with BMI. This data suggests that TSH can modulate adipocyte insulin signaling.

Pregnancy is a condition leading to an important strain on thyroid morphology and function.A normal functioning of the thyroid gland in the mother is essential for the early fetal development, since the fetal thyroid does not produce thyroid hormones until the end of the first trimester (approximately 12 to 14 weeks).The impact of thyroid dysfunction (and especially hypothyroidism) during pregnancy is well documented and has been associated with a number of obstetrical complications, such as premature delivery, low birth weight and even fetal death. In view of all changes in thyroid physiology during pregnancy the ATA (American Thyroid Association) guidelines recommend using trimester- and population-specific normality ranges, to define thyroid dysfunction. It is proposed to determine them in pregnant women without thyroid antibodies (TPO) and without severe iodine deficiency. Due to the few numbers of randomized clinical trials, there is still no consensus whether all pregnant women should be screened or only women at risk for the development of thyroid dysfunction during pregnancy.Thyroid dysfunction during pregnancy is caused in most cases by the presence of thyroid autoimmunity (TAI) and also the altered pregnancy outcomes in most studies are associated with the presence of TAI.Besides the presence of TAI, other factors might also change, influence and/or modify thyroid function. When we started our research, there were only few studies that investigated the impact of other variables, such as iron, BMI, smoking habit and/or the background of the pregnant women on the prevalence of thyroid dysfunction during the first trimester of pregnancy.The aims of the thesis were therefore, to investigate: • the association between the iron reserve status (ferritin levels), thyroid (dys)function and autoimmunity, corrected for confounders such as age, BMI, smoking habit and the time of blood sampling;• the impact of the ethnic background of the pregnant woman on thyroid function and autoimmunity, corrected for confounders such as age, BMI, smoking habit, and the time of blood sampling. Furthermore, to determine ethnic-specific reference ranges and investigate their impact on the diagnosis of thyroid dysfunction;• the impact of changes in thyroid function within the normal reference range in women free of thyroid autoimmunity on pregnancy outcomes, corrected for established covariates (age, BMI, smoking) and iron reserve as candidate new variable.• whether targeted high-risk screening for thyroid dysfunction during pregnancy could be improved with the inclusion of iron status and ethnicity to the actual risk factors defined in the ATA-GL.The results can be summarized as follows:Thyroid function during pregnancy can be influenced by variables others than thyroid antibodies such as the iron status and the ethnical background of the women. However, their impact on thyroid function is less important compared to that of thyroid antibodies. No significant impact of well-known variables (BMI, age, smoking) and others such as iron has been shown on clinical pregnancy outcomes when thyroid function remained within the normal range and no thyroid antibodies were present.We have shown that adding variables such as iron deficiency, ethnic background and obesity to the currently provided list of factors leading to a high-risk for the development of thyroid dysfunction during pregnancy, might improve the detection rate of subclinical hypothyroidism to comparable rates obtained in case of universal screening. / Doctorat en Sciences médicales (Médecine) / info:eu-repo/semantics/nonPublished

Bei der vorliegenden Arbeit handelt es sich um eine experimentelle Untersuchung zu Unterschieden in der Signaltransduktion von drei mutierten Thyrotropin-Rezeptoren (mTSHR), die in Rattenschilddrüsenzellen stabil exprimiert werden. Mittels Proteomanalyse konnte die Proteinexpression von mehreren Signalproteinen quantitativ untersucht werden und mit der Proteinexpression in Zellen, die Wildtyp (WT)-Rezeptoren exprimieren, verglichen werden. In den Zellen mit mutierten Rezeptoren konnte eine gesteigerte Expression von Proteinen nachgewiesen werden, die in der Endozytose eine Schlüsselrolle spielen. Weiterhin konnte hier eine verstärkte Internalisierung der mTSHR festgestellt werden. Der Phosphatidyl-Inositol-3-Kinase (PI3K) Signalweg wurde in mTSHR-Schilddrüsenzellen im Vergleich zu WT-Zellen verstärkt aktiviert, und dies geschah Proteinkinase A (PKA) -unabhängig. Zudem konnte eine vorübergehende Aktivierung des Proteins Exchange protein directly activated by cAMP (Epac) durch das zyklische Adenosinmonophosphat (cAMP) nachgewiesen werden, die möglicherweise mit der Aktivierung des PI3K-Signalwegs in Zusammenhang steht. Die Ergebnisse gewähren somit neue Einblicke in die biologische Aktivität von mTSHR. Zum einen bleiben wahrscheinlich die mTSHR nach Internalisierung weiterhin aktiv, zum anderen reduziert sich die weitere Signaltransduktion nicht nur auf cAMP-PKA/Inositoltrisphosphat-Signalwege. Diese Ergebnisse könnten zu einem besseren Verständnis für den Verlauf der Schilddrüsenautonomie beitragen.

Das Krankheitsbild der disseminierten Schilddrüsen(SD)-Autonomie ist nur in Mitteleuropa bekannt und wird in der englischsprachigen Literatur nicht beschrieben. Die exakte Pathogenese der disseminierten SD-Autonomie, insbesondere ob es sich um ein eigenständiges Krankheitsbild oder nur um ein szintigrafisches Phänomen handelt, ist nicht geklärt. Daher war es Ziel dieser Arbeit, die klinische Entität der disseminierten Autonomie genauer zu klassifizieren, mit anderen SD-Autonomien zu vergleichen und weitere Erkenntnisse über die Pathogenese, insbesondere bezüglich des intrathyreoidalen Iodgehalts sowie TSH-Rezeptorkeimbahnmutationen dieser Erkrankung zu gewinnen.

Proper functioning of endocrine cells is crucial for organismal homeostasis. The underlying mechanisms that fine-tune the amount, and the timing of hormone secretion are not clear. JIP1 / MAPK8IP1 (JNK interacting protein 1) is a scaffold protein that mediates cellular stress response, and is highly expressed in endocrine cells, including insulin secreting b-cells in pancreas islets. However, the role of JIP1 in b-cells is unclear. This study demonstrates that b-cell specific Jip1 ablation results in decreased glucose-induced insulin secretion, without a change in Insulin1 and Insulin2 gene expression. Inhibition of both JIP1-kinesin interaction, and JIP1-JNK interaction by genetic mutations also resulted in decreased insulin secretion, suggesting that JIP1 may mediate insulin vesicle trafficking through interacting with kinesin and JNK. Autophagy is a cellular recycling mechanism and implicated in the b-cell function. Both JIP1 and JNK are proposed to regulate autophagy pathway. However, it is unclear whether JNK plays a role in the promotion or suppression of autophagy. The findings of this study show that JNK is not essential for autophagy induction, but can regulate autophagy in a cell and context specific manner. The results in this thesis implies a mechanism that link cellular trafficking and stress signaling pathways in the regulated hormone secretion. In addition to the known role of JIP1 in metabolism and insulin resistance, this finding may also be relevant to endocrine pathologies.