Durant la progression tumorale cérébrale, les cellules envahissent le tissu environnant, afin de s'y infiltrer. Pour ce faire, elles sécrètent ou expriment à leur surface des métalloprotéases matriciel1es (MMPs), capables de dégrader les composants de la matrice extracellulaire. Parmi ces MMPs, la MMP membranaire de type 1 (MT1-MMP) joue un rôle crucial dans l'acquisition du potentiel invasif des cellules tumorales cérébrales. La MT1-MMP dégrade de nombreux composants de la matrice extracellulaire et des protéines de surface. Grâce à son activité protéolytique, la MT1-MMP joue ainsi un rôle important dans les différentes étapes de la progression tumorale cérébrale incluant l'angiogenèse. Le ciblage pharmacologique des fonctions de MT1-MMP serait donc une approche thérapeutique efficace dans le traitement de gliomes. Bien que l'activité protéolytique de la MT1-MMP demeure sa fonction la plus importante, plusieurs études tendent à démontrer que la portion cytoplasmique de l'enzyme contribue à l'induction de signaux intracellulaires possiblement impliqués dans la chimio et la radiorésistance à la thérapie des gliomes. Parmi les marqueurs associés à cette résistance et surexprimés dans les gliomes hautement malins, il y a la cyclooxygénase-2 (Cox-2). Toutefois, le mécanisme moléculaire reliant l'activité intracellulaire de MT1-MMP à l'expression de Cox-2 demeure incompris. La première partie de mon mémoire a pour objectif d'étudier le ciblage pharmacologique des fonctions de MT1-MMP par l'actinonine, un inhibiteur sélectif de l'aminopeptidase N/CD13 et des MMPs solubles, dans les cellules de glioblastome U87. Nous y montrons que l'actinonine inhibe l'activation de la proMMP-2 induite par la concanavaline-A (ConA), une condition expérimentale connue pour induire l'expression de MT1-MMP dans les cel1ules U87. De plus, grâce à l'analyse de l'expression génique de MT1-MMP, l'actinonine n'a pas modulé l'expression de MT1-MMP induite par la ConA, suggérant que les effets de l'actinonine sont post-transcriptionnels. Nos résultats positionnent l'actinonine comme un possible candidat thérapeutique ciblant MT1-MMP. La deuxième partie de mon mémoire s'est orientée sur l'axe MT1-MMP/Cox-2 dans les glioblastomes U87. Nos observations préalables d'une modulation conjointe de l'expression de MT1-MMP et de Cox-2 dans les cellules isolées de glioblastomes humains U87 induite par la ConA nous ont permis d'évaluer le rôle de la ConA dans le déclenchement des processus cellulaires pro-inflammatoires qui régulent l'expression de Cox-2. Nous avons trouvé que le traitement avec la ConA, ou la surexpression directe de MT1-MMP recombinante conduit à l'induction de Cox-2 via une voie de signalisation impliquant NF-kB/IKKy. Collectivement, les résultats présentés dans ce mémoire apportent de nouvelles informations quant à l'implication du domaine intracellulaire de la MT1-MMP dans le phénotype pro-inflammatoire des cellules cancéreuses cérébrales. Ceci inspirera la conception de nouvel1es stratégies de thérapie pouvant combiner l'action des inhibiteurs de MT1-MMP à celle des drogues anti-inflammatoires pour le traitement de gliomes. ______________________________________________________________________________ MOTS-CLÉS DE L’AUTEUR : MT1-MMP, Concanavaline-A, Actinonine, Cox-2, Inflammation, Glioblastome

Si certains cancers sont maintenant traités avec succès, la lutte à finir avec plusieurs autres tels les cancers cérébraux, passe impérativement par une meilleure connaissance des cellules constituant ces tumeurs et de ce qui les entoure. Les tumeurs cérébrales sont isolées du reste du corps par la barrière hémato-encéphalique, ce qui rend le traitement de ces dernières un défi de taille. Cibler le microenvironnement dans lequel évoluent ces tumeurs est un nouveau moyen d'augmenter peut être l'efficacité des thérapies anticancéreuses. En effet, les cellules endothéliales tumorales (CET) sont connues pour avoir un phénotype distinct des CE normales. Ces CE peuvent donc être une cible potentielle supplémentaire pour l'inhibition sélective de la croissance tumorale. En même temps, les tumeurs semblent être dirigées et initiées par une sous-population de cellules au sein de la tumeur, les cellules souches cancéreuses (CSC). Le concept des CSC a pris de l'envergure ces trois dernières années et la recherche de caractéristiques intrinsèques particulières des CSC semblerait un bon début pour l'avancement de l'oncologie. Une des signatures phénotypiques de plusieurs CSC est le marqueur CD133 ou Prominine-1. Comme les cellules cancéreuses ne sont pas la seule cible thérapeutique envisageable, les cellules endothéliales, composantes du milieu tumoral, ont servi de modèle pour l'étude de récepteurs aux facteurs plaquettaires. À l'aide de la lignée HBMEC (human brain microvascular endothelial cell), nous avons mis en évidence une migration préférentielle marquée des HBMEC en réponse à l'acide lysophosphatidique (LPA) comparativement à la sphingosine 1- phosphate (S1P), le LPA et la S1P étant deux facteurs plaquettaires. La voie des MAP (Mitogen-activated protein) kinases semble être une des voies activée chez les HBMEC stimulées au LPA. Nous avons démontré sous condition hypoxique, que cette migration était fortement inhibée (>50%) suite à l'invalidation de l'un ou l'autre des récepteurs au LPA, LPAR-1 ou LPAR-3, deux récepteurs qui s'exprimaient à la hausse suite à l'étude du profil génique des LPAR chez les HBMEC. Dans le but d'investiguer la réponse au LPA et à la S1P dans un modèle de résistance tumorale, une sous-population de cellules CD133(+) a été triée à partir de la lignée cellulaire de médulloblastome DAOY. Il a été observé que les cellules CD133(+) sont plus sensibles au LPA que les CD133(-) , fait qui a été constaté via une réponse précoce et plus intense de l'activation de la voie des MAP kinases chez les cellules CD133(+) ainsi que par une surexpression des récepteurs au LPA, en particulier, LPAR-2 et LPAR-4 chez cette même sous-population. En plus, la résistance des cellules CD133(+) a été reliée à un phénotype d'expression différentielle des récepteurs lipoprotéiques de basse densité (LRP). En effet, la déprivation en nutriments régule à la hausse l'expression des récepteurs LRP-1, LRP-1b et LRP-5 ainsi que celle du marqueur CD133. En somme, nous proposons que les LPAR constituent une cible propice pour combattre le cancer, que ce soit au niveau du compartiment tumoral cérébral ou vasculaire cérébral. Nos résultats suggèrent aussi que les CSC s'adaptent entre autre par l'intermédiaire de récepteurs LRP, qui constituent une autre cible thérapeutique du compartiment tumoral cérébral. ______________________________________________________________________________ MOTS-CLÉS DE L’AUTEUR : cellule endothéliale, cellule souche cancéreuse, CD133, acide lysophosphatidique, récepteur au LPA, médulloblastome, low-density lipoprotein receptor-related protein.

Les cellules endothéliales (CE) vasculaires cérébrales jouent un rôle important en tant que composantes structurales et fonctionnelles de la barrière hémato-encéphalique. L'angiogenèse tumorale, un processus important pour la croissance tumorale et pour le processus métastasique, régule le recrutement des CE qui, lorsqu'activées, prolifèrent et se différencient pour générer des structures capillaires afin de livrer les nutriments et l'oxygène au sein du compartiment tumoral. Les recherches rapportées dans ce mémoire nous ont permis de cibler, d'un point de vue pharmacologique, l'angiogenèse tumorale cérébrale. Dans le premier volet de cette étude, nous avons évalué l'impact anti-angiogénique in vitro de l'AD4-015, un inhibiteur du transporteur du glucose-6-phosphate (G6PT), sur les CE vasculaires cérébrales. Nous avons observé une inhibition de la migration cellulaire, de la tubulogenèse in vitro et de l'inhibition de la sécrétion et de l'expression génique de la métalloprotéinase matricielle-9 induite par le phorbol 12-myristate 13-acétate (PMA), un carcinogène promoteur de tumeur. L'expression de la cyclooxygénase-2 (cox-2) était aussi inhibée. L'inhibition pharmacologique de G6PT pourrait être une importante avenue thérapeutique ciblant la néo-vascularisation tumorale. Dans le deuxième volet de notre étude, nous avons investigué les effets du 2-déoxy-D-glucose (2DG), un analogue du glucose ayant comme rôle d'inhiber la glycolyse par la déplétion d'ATP, sur les propriétés angiogéniques des CE vasculaires cérébrales. Nous avons observé une diminution de la tubulogenèse conséquente à une diminution du niveau d'ATP. L'induction de l'expression de cox-2 et de GRP78 a été potentialisée par la combinaison du 2DG avec le PMA. Le niveau de la sécrétion de protéine et de l'expression génique de MMP-9 a été diminué en présence du 2DG, un phénomène impliquant la signalisation par le facteur nucléaire kappa-B. Nous fournissons donc des preuves que l'ATP est nécessaire au processus de la tubulogenèse et nous établissons un lien entre le stress du réticulum endoplasmique et l'inflammation. Dans le troisième volet de notre étude, nous avons investigué les propriétés inhibitrices de plusieurs flavonoïdes et la voie de signalisation du facteur nucléaire kappa-B, qui est une voie commune pour la régulation de l'expression de cox-2 et de MMP-9. Nous avons observé une diminution de l'expression génique et des niveaux de protéines de cox-2 et de MMP-9 par la fisetine, l'apigénine et la lutéoline. Il a également été démontré qu'il y a inhibition des niveaux de phosphorylation d'IkB prouvant leur impact sur l'activité de phosphorylation des IkB kinases. Nos résultats démontrent donc que la perturbation de la barrière hémato-encéphalique pourrait être minimisée par certains flavonoïdes qui agissent comme des inhibiteurs de la voie de signalisation de NF-kB. Collectivement, nos résultats démontrent les effets de différents inhibiteurs sur la tubulogenèse médiée par les CE vasculaires cérébrales. Dans le futur, ceci permettra le ciblage pharmacologique de l'angiogenèse tumorale cérébrale avec l'utilisation de molécules inhibitrices comme l'analogue de la mumbaistatine, le 2DG et certains flavonoïdes. ______________________________________________________________________________ MOTS-CLÉS DE L’AUTEUR : cellules endothéliales vasculaires cérébrales, angiogenèse, cox-2, MMP-9.

L'implication de la Membrane Type-Matrix Metalloproteinase (MT1-MMP) dans la progression du cancer a été grandement étudiée dans la dernière décennie. Elle possède une vaste variété de substrats, incluant des composants de la matrice extracellulaire, des cytokines et des récepteurs membranaires. Nos résultats identifient le marqueur de cellules souches (CSC) CD133 comme une nouvelle cible de l'activité protéolytique de la MT1-MMP. Des essais d'immunoprécipitation et de clivage in vitro effectués à l'aide de protéines recombinantes ont démontré que la MT1-MMP interagit physiquement avec CD133 et clive son domaine N-terminal à la position 30KAWN↓Y34. De plus, cette interaction semble commencer au niveau intracellulaire, dans le réticulum endoplasmique, avant l'activation de la proMT1-MMP et avant la maturation complète de CD133; toutefois, seulement la forme mature de CD133 peut être clivée. Ces résultats représentent la première interaction protéine-protéine connue de CD133, dont la fonction cellulaire demeure incomprise. Des expériences supplémentaires pourraient mener à une meilleure compréhension de cette protéine et de son rôle dans la biologie des CSCs. ______________________________________________________________________________ MOTS-CLÉS DE L’AUTEUR : MT1-MMP, CSC, N-terminal, réticulum endoplasmique

L'objectif de ce travail était d'optimiser les conditions ainsi que les techniques d'acquisition par spectroscopie et par imagerie spectroscopique par RMN du proton in vivo, chez le petit animal pour les appliquer à des études biologiques. Les conditions d'acquisitions ont été améliorées par la mise en place d'une technique de correction automatique des inhomogénéités de champ magnétique. Les séquences d'acquisition ont été optimisées par l'utilisation de la technique de suppression d'eau VAPOR et par l'utilisation de l'imagerie spectroscopique par encodage spiral à temps d'écho court. <br />Le pH extracellulaire (pHe) dans les tumeurs est plus acide que dans le tissu sain. Cette acidité semble être un facteur favorisant la prolifération. A l'aide d'une nouvelle molécule sonde, l'ISUCA, nous avons utilisé l'imagerie spectroscopique pour cartographier la distribution de pH extracellulaire dans les tumeurs et la comparer avec la distribution du lactate. Celles-ci ne sont pas corrélées spatialement, de plus à la suite d'une hyperglycémie, les quantités de lactate et de protons augmentent de manière globale mais avec une corrélation spatiale négative. Ces résultats suggèrent une redistribution des protons des sites de la glycolyse vers des pompes membranaires.<br />Le second projet biologique portait sur l'étude du rôle de l'ammonium dans la régulation de la glycolyse dans le cerveau. L'hyperammoniémie augmente la concentration de lactate cérébral: j'ai montré que cette augmentation peut être transitoire, ce qui est une condition incontournable pour un éventuel rôle physiologique de l'ammonium dans le couplage métabolique entre neurones et astrocytes.

De nombreux modèles ont été proposés pour expliquer les mécanismes de développement et de progression tumorale, néanmoins certains aspects comme la nature et la hiérarchie des altérations primaires et secondaires sont encore discutés. Pour répondre à ces questions, nous nous sommes intéressés à la progression tumorale des tumeurs hypophysaires à prolactine humaines. Ces tumeurs d'origine monoclonale sont souvent bénignes mais certaines présentent un phénotype agressif voire malin. Afin d'identifier les mécanismes impliqués dans la progression vers le phénotype agressif nous avons utilisé des techniques de génomique intégrative (puces à ADN, séquençage haut débit) couplant l'étude du transcriptome, du génome (variation du nombre de copie chromosomique, polymorphismes) et du miRNome à partir des mêmes échantillons tumoraux. Par cette stratégie nous avons identifié et hierarchisé des altérations spécifiques des tumeurs agressives et / ou malignes dans un modèle expliquant la progression tumorale des tumeurs hypophysaires à prolactine humaines. Nous avons montré que la sous-expression des microARNs miR-183, miR-744 et miR-98 stimule la prolifération via la surexpression de leurs cibles KIAA0101, TGFB1 et E2F2 spécifiquement dans les tumeurs agressives. Ceci entraine l'acquisition d'altérations chromosomiques (perte du chromosome 11 et le gain du chromosome 1q) permettant l'activation de la dissémination métastatique. Enfin, ce travail montre que l'approche de génomique intégrative multidimensionnelle permet d'apporter de nouveaux éléments pour la caractérisation des phénotypes tumoraux, le diagnostic des tumeurs agressives et la prédiction du comportement tumoral

En 1889, le clinicien Stefen Paget proposa l'hypothèse de " la graine et du terroir " pour expliquer la progression tumorale. La graine - la tumeur - ne peut pousser que dans le bon terroir - le microenvironnement tumoral. Durant le développement du cancer, la tumeur et ce microenvironnement sont en constant dialogue biochimique. Nous nous sommes intéressés durant cette thèse à l'hypothèse de Paget d'un point de vue mécanique : le terroir mécanique peut-il influencer la progression tumorale ? Nous avons choisi une approche in vitro afin de découpler les influences biochimiques et mécaniques. Nous avons travaillé avec des sphéroïdes multicellulaires, petites boules de cellules tumorales qui imitent remarquablement bien une tumeur. Nous avons développé une méthodologie nous permettant d'exercer des contraintes mécaniques sur des sphéroïdes, et nous avons étudié l'influence de telles contraintes. Nous avons montré qu'une contrainte mécanique influence le développement tumoral. Une contrainte mécanique réduit fortement la croissance d'un sphéroïde, et ce de manière réversible. Le volume des cellules au centre est diminué, ce qui semble déclencher un arrêt de la prolifération. Nous avons également montré que la division cellulaire est source de flux cellulaires à l'intérieur d'un sphéroïde, et que ces flux peuvent être inhibés par l'application d'une contrainte. Enfin, nous avons observé qu'une contrainte mécanique peut promouvoir l'envahissement d'une matrice de collagène par un sphéroïde. En conclusion, qu'un dialogue mécanique restreigne la progression tumorale ou la promeuve, il en est un élément intrinsèque.

Le gène suppresseur de tumeur LKB1 code une protéine sérine/thréonine kinase qui régule le métabolisme et la polarité cellulaires. LKB1 exerce une partie de ses fonctions biologiques en phosphorylant et en activant les 14 kinases appartenant à la famille des protéines kinases activées par l'AMP (AMPK). Le membre éponyme de cette famille, AMPK, agit comme un senseur nutritionnel essentiel dans la cellule. La recherche que j'ai conduite au cours de ma thèse a porté sur le mode de régulation de LKB1. L'holoenzyme LKB1, un hétérotrimère comprenant deux autres protéines appelées STRAD et MO25, est dotée d'une activité catalytique constitutive. Mon travail a permis de montrer que la lysine 48 de LKB1 est acétylée par l´acétyltransférase GCN5. Par des approches biochimiques et des techniques d'imagerie, j'ai montré que l'acétylation de LKB1 par GCN5 favorise sa localisation nucléaire, la fraction non-acétylée étant localisée à la fois dans le cytoplasme et le noyau. GCN5 promeut également l´export cytoplasmique de LKB1 de manière HAT-indépendente et régule son niveau d´expression. Afin de préciser la contribution de cette acétylation à la fonction in vivo de LKB1, j'ai utilisé le modèle expérimental de la crête neurale (CN) chez le poulet. En effet, j'ai été impliquée au cours de ma thèse dans une étude issue du laboratoire, qui a établi que l'activité de LKB1 est requise pour la délamination, la migration polarisée et la survie des cellules de la CN céphalique. Ces dernières contribuent à la formation de la majorité du squelette cranio-facial des vertébrés. Le signal LKB1 dans ces cellules est relayé par l'AMPK et la kinase ROCK et converge sur le moteur moléculaire dépendant de l'actine, la Myosine II. A l'aide du même modèle expérimental, j'ai montré que GCN5 est exprimé dans les cellules de la CN au cours de l'embryogenèse et que l'interaction fonctionnelle entre LKB1 et GCN5 est nécessaire à l'activité de LKB1 au cours de l'ontogénie des cellules de la CN céphalique et donc de la formation de la tête. / The tumor suppressor gene LKB1 encodes a serine/threonine kinase which regulates the cellular metabolism and polarity. Its biological activity is partly exerted through the phosphorylation and activation of 14 kinases which belong to the AMP-activated protein kinases (AMPK). The eponym member of this family acts as an essential nutritional sensor in the cell. The research that I conducted during my PhD focused on the regulation of LKB1. The LKB1 holoenzyme is a constitutively active heterotrimer comprising two other proteins called STRAD and MO25. My PhD project shows that LKB1 is acetylated on the lysine 48 residue by the acetyltransferase GCN5. Using biochemical approaches and cell imaging, I have shown that the acetylation of LKB1 by GCN5 favors its nuclear localization, while the non-acetylated fraction is localized in both the nucleus and the cytoplasm. GCN5 also promotes the cytoplasmic export of LKB1 in an HAT-independent manner and regulates its expression levels. In order to investigate the contribution of this acetylation to the functions of LKB1 in vivo, I have used the experimental model of the neural crest (NC) in chick embryos. Indeed, during my PhD, I have contributed to a study, initiated by my host laboratory, in which we show that LKB1 is required for the delamination, polarized migration and survival of neural crest cells (NCCs) which contribute to the formation of most craniofacial structures in vertebrates. LKB1 signaling is mediated by AMPK and the ROCK kinase and converges towards the actin-dependent molecular motor, Myosin II. Using the same experimental model, I have shown that GCN5 is expressed in NCCs during embryogenesis and that the functional interaction between GCN5 and LKB1 is essential for the activity of LKB1 in the cephalic NCCs ontogenesis and head formation.

Malgré la complexité du processus de transformation, plusieurs systèmes modèles ont été développés dans lesquels les cellules normales se transforment d'une manière progressive par l'introduction d’éléments génétique. Ici, seules les cellules transformées rentrent en apoptose induite par TRAIL. Comme le milieu des cellules sénescentes a déjà été impliqué dans certaines caractéristiques tumorales (la prolifération, l'invasion et d'autres), notre objectif était d'évaluer soneffet potentiel sur l'acquisition de la sensibilité à TRAIL. Lorsque toutes les cellules de ce système de transformation sont incubés avec le milieu conditionné de cellules sénescentes (CMS) la sensibilisation à TRAIL a été observée dans les cellules pré-transformées mais pas dans les cellules immortalisées ou normales. Ainsi, nous avons conclu que les différentes étapes de la transformation fournissent un contexte cellulaire et moléculaire particulier qui agit en synergie avec le CMS afin de promouvoir la sensibilisation à TRAIL. Ces observations mettent l'accent sur le rôle spécifique descellules sénescentes et leur phénotype sécrétoire. Nous avons ensuite étudié les mécanismes activés dans les cellules pré-transformées par le CMS et responsables de leur sensibilisation à TRAIL. Nos résultats suggèrent un rôle clé de l'axe Myc-FLIPL dans la signalisation activée par le CMS. / Despite the complexity of the transformation process, several model systems have been developed in which normal cells are transformed in a step-wise manner by introduction of genetic elements (telomerase, SV40ER viral genes and oncogenes). In this system, only the transformed cells go into TRAIL-induced apoptosis. As senescent-secreted factors have already been involved in promoting some of the tumor characteristics (proliferation, invasion and others), our objective was to assess its potential effect on the acquisition of sensitivity to TRAIL. When all the cells of the transformation system were incubated with conditioned medium of senescent cells (CMS) the sensitization to TRAIL was observed only in the pre-transformed, but never in normal or immortalized cells. Thus, we concluded that the different steps of transformation provide a cellular and molecular context that acts in synergy with the CMS to promote TRAIL sensitivity. These observations emphasize the specific role of senescent cells and their secretory phenotype. We then studied the mechanisms activated inthe pre-transformed cells by the CMS, responsible for their sensitization to TRAIL. Our results suggest a key role of the Myc-FLIPL axis in signaling activated by the CMS.

Depuis son apparition la robotique chirurgicale s’avère bénéfique pour les patients et pour les praticiens car elle améliore la qualité des opérations. Ces travaux de thèse portent sur la conception, la modélisation et la planification de mouvements d’un système robotique destiné à réséquer une tumeur cérébrale. La définition des contraintes liées à la tâche de résection de tumeur (adaptabilité aux différentes formes de tumeurs et espace de travail restreint et évolutif) met en évidence la problématique liée à la conception du robot et à sa stratégie de résection. La conception modulaire retenue utilise des câbles et dispose de sept degrés de liberté. Une modélisation géométrique de la solution est proposée. La planification de trajectoire du robot redondant dans un environnement dynamique qui dépend de sa trajectoire est basée sur un principe de génération interactive. Elle utilise un découplage des degrés de liberté du robot et définit des procédures élémentaires qui pourront être choisies et assemblées par le neurochirurgien. Une méthode par discrétisation est proposée pour déterminer l’espace des procédures adaptées au robot et limiter le choix du chirurgien aux procédures effectivement réalisables. Une simulation montre que la solution robotique associée à la méthode interactive de génération de trajectoire permet de réséquer une grande partie d’une tumeur témoin, et la réalisation d’un démonstrateur offre des perspectives d’expérimentations en conditions simulées. / Since the beginning of surgical robotics, surgical robots continue to find their place in clinical routine. They improve the quality and safety of operations, and comfort for the surgeon. This work addresses the design, modeling and path planning of a robotic system for brain tumor resection. The characterization of the surgical task (adaptability to the high diversity of tumor shapes, limited and evolving workspace) points out the requirements for the robot design and resection path planning. A modular robot with seven degrees of freedom is selected (high dexterity) and is actuated by wires. A kinematic (geometric) model is built.Motion planning of the redundant robot in evolving and path depending workspace is based on an interactive path planning. The method uncouples the degrees of freedom and defines elementary procedures, which are assembled in an arbitrary sequence by the neurosurgeon.A discretization method allows computing the procedure space that presents the possible locations, orientations and sizes of resected areas with respect to the robot limitations to bound procedure choices. A simulation on a real tumor case reveals that the chosen robotic concept associated to the interactive motion planning method allows removing the tumor for the most part. A demonstrator is realized and will provide opportunities for experiments in simulated conditions.