Abstract Potential lethal diarrhoea caused by enterotoxigenic Escherichia coli strains is one of the most common diseases in young pigs. It can be cured by single-chain antibody fragments (scFv), which can be produced in recombinant microorganisms. Pichia pastoris, a methylotrophic yeast, is generally considered an interesting production system candidate, as it can secrete properly folded proteins. These proteins accumulate in high concentrations during fermentation, reducing the cost for product recovery. Strong inducible AOX1 promoter, widely used in P. pastoris for fast, inexpensive production, is typically induced by methanol. The high oxygen demand of methanol metabolism makes oxygen supply a major parameter in cultivations requiring special process design strategies. In standard fed-batch cultivation, dissolved oxygen concentration inside a bioreactor is kept at a certain level by pumping air and pure oxygen into the reactor. There are safety concerns over the handling of oxygen, especially at a large scale. Therefore, there is a need to develop a production process under oxygen-limited conditions. This dissertation studies the development of a cost-efficient production process of scFv in P. pastoris. Both methanol and oxygen parameters influence the production process and the objective was to find a robust production process. Fed-batch cultivations were performed in a 10 L scale bioreactor. The effects of lower oxygen level, methanol concentration, glycerol feeding duration and specific substrate-uptake rates on product formation were studied. A P. pastoris GS115 his4 strain under an AOX1 promoter system expressing scFv was used in this study. The fed-batch fermentations were carried out in a bioreactor with basal salt media. In this doctoral dissertation, a process was developed for a single-chain antibody fragment (scFv) production in P. pastoris. The product levels of 3.5 g L-1 scFv in culture supernatant were achieved and a production process was designed without additional need of pure oxygen, thus relieving safety requirements and lowering the amount of methanol. The process developed during this research may potentially be utilised by both academia and industry having interests in expressing proteins in P. pastoris. The methanol-uptake control strategy is beneficial for those products that suffer from degradation or modification during limited feeding of methanol. / Tiivistelmä Enterotoksigeenisten E.coli kantojen aiheuttama ripuli on porsaiden tavallisimpia tauteja, joka voi johtaa jopa kuolemaan. Tautia voidaan hoitaa yhdistelmä-DNA-tekniikalla tuotetuilla vasta-ainefragmenteilla (scFv). Metylotrofista Pichia pastoris hiivaa pidetään kiinnostavana vasta-ainefragmenttien tuottoisäntänä, koska se pystyy erittämään oikealla tavalla laskostuneita proteiineja. Näitä proteiineja kertyy fermentointiprosessissa solujen ulkopuolelle korkeina pitoisuuksina, mikä vähentää tuotteiden talteenottokustannuksia. Vahva metanolilla indusoituva AOX1-promoottori on laajassa käytössä P. pastoris tuottosysteemissä tuoton nopeuden ja alhaisten kustannusten ansiosta. Metanolin aineenvaihdunta vaatii paljon happea, joten riittävän tehokas hapen liuottaminen on tärkeimpiä fermentointiparametreja ja vaatii erityisiä prosessin toteutusstrategioita. Perinteisessä fed-batch-fermentoinnissa liuenneen hapen pitoisuus bioreaktorissa pidetään halutulla tasolla lisäämällä ilmaa ja puhdasta happea reaktoriin. Koska hapen käsittelyyn liittyy turvallisuusriskejä erityisesti teollisuusmittakaavassa, happirajoitteisissa olosuhteissa toimiva tuotantoprosessi olisi hyödyllinen. Tässä väitöstutkimuksessa kehitettiin kustannustehokasta prosessia scFv-:n tuottoon P. pastoris hiivalla. Metanoliin ja happeen liittyvät parametrit ovat olennaisia prosessiin vaikuttavia tekijöitä. Tavoite oli kehittää yksinkertainen ja käytännöllinen prosessi. Työssä tutkittiin alhaisen happitason, metanolin pitoisuuden, glyserolisyötön keston ja substraattien spesifisten kulutusnopeuksien vaikutuksia tuotteen muodostumiseen 10 litran bioreaktorissa. Isäntäkantana oli P. pastoris GS115 his4, jossa scFv-ekspressiota säädeltiin AOX1 promoottorilla. Fed-batch fermentointien kasvatusalustana käytettiin Basal Salt Medium alustaa (BSM). Väitöstyössä kehitettiin tavoitteiden mukainen vasta-ainefragmenttien tuottoprosessi P.pastoris hiivalle. Menetelmällä saavutettiin tuotepitoisuus 3,5 g L-1 kasvatusliemen supernatantissa ilman puhtaan hapen lisäystarvetta, ja siten metanolin kulutus väheni ja prosessiturvallisuus parani verrattuna perinteisiin prosesseihin. Kehitetty prosessi soveltuu käytettäväksi sekä akateemisessa tutkimuksessa että teollisuudessa tuotettaessa erilaisia proteiineja P. pastoris hiivalla. Metanolin kulutuksen säätöstrategia on erityisen hyödyllinen tuotteille, joilla ongelmana on proteolyysi tai muokkautuminen metanolirajoitteisessa fermentoinnissa.

Abstract Blackcurrants (Ribes nigrum L.) are widely consumed due to their favourable taste and health-promoting effects. The berries and extracts from different parts of the plant show anticarcinogenic, antioxidative and anti-inflammatory properties, and are effective in reducing the risk of cardiovascular disease and in promoting brain health. These health-promoting benefits are due to high concentrations of valuable compounds such as anthocyanins and flavonols in blackcurrants. However, these compounds are sensitive to heat and processing and some are lost when the berries are processed into products such as jams, purees and juices. Industrial processing of juices is a multistep process that typically includes enzyme treatment, pressing, pasteurisation, clarification and usually also thermal concentration. Alternative minimal processing technologies are required to preserve the health-promoting compounds in products by avoiding the use of high temperatures and extensive clarification. Integrated membrane technology, i.e. combined ultrafiltration and reverse osmosis, was used in this thesis for the production of blackcurrant juice concentrate. Pre-treatment methods, such as enzymatic treatment, ultrafiltration, enzymatic treatment combined with ultrafiltration and centrifugation to increase the filtration efficiency in reverse osmosis were evaluated. Processing was modelled to define the resistances, using the resistance-in-series model. The preservation and concentration of anthocyanins and flavonols were analysed. The results indicated that the main resistance in the reverse osmosis process was polarisation resistance, while membrane resistance was lower and fouling resistance was one order of magnitude lower than the other resistances. The filtration efficiency results showed that the highest flux was achieved by ultrafiltered blackcurrant juice, but that the resulting juices were substantially lower in anthocyanins and flavonols, which were retained on the ultrafiltration membrane. Therefore, replacing ultrafiltration with centrifugation as the clarification method for juices is recommended. Value-added processing of blackcurrant was conceptualised by valorisation of the marc left in the berry pressing process for extraction of anthocyanin compounds. Conventional extraction was compared with microwave-assisted extraction (MAE), with the latter optimised using response surface methodology to achieve maximum efficiency in extracting anthocyanins. The optimum parameters found for MAE were: microwave power 700 W, extraction time 10 minutes, pH 2 adjusted with hydrochloric acid and a solid to solvent ratio of 0.05. Conventional extraction showed the best results when carried out at 80 °C for 300 minutes in aqueous solution with pH 2 adjusted by hydrochloric acid. Under these conditions, recovery of anthocyanins was still 10% lower than with MAE for only 10 minutes of extraction time. / Tiivistelmä Mustaherukoita käytetään paljon niiden hyvän maun ja terveyttä edistävien vaikutusten ansiosta. Marjoilla ja marjakasvin eri osien uutteilla on osoitettu olevan antikarsinogeenisia, antioksidatiivisia ja tulehduksia estäviä ominaisuuksia ja ne ovat tehokkaita pienentämään sydän- ja verisuonisairauksia. Ne edistävät myös aivojen terveyttä. Marjojen arvokkailla yhdisteillä kuten antosyanideillä ja flavonoleilla on terveyttä edistäviä vaikutuksia. Mustaherukassa on runsaasti näitä yhdisteitä. Hillojen, soseiden ja mehujen prosessoinnissa menetetään näitä hyödyllisiä yhdisteistä, koska ne ovat herkkiä lämmölle ja prosessoinnin vaikutuksille. Mehujen prosessoinnissa käytetään entsyymikäsittelyjä, puristusta, pastörointia, selkeytystä ja usein myös lämpökonsentrointia. Tuotteiden terveyttä edistävien yhdisteiden säilyttämiseksi tarvitaan uudenlaisia hellävaraisia prosessointitekniikoita ilman korkeita lämpötiloja ja voimakasta selkeyttämistä. Tässä työssä tutkittiin yhdistettyjen kalvotekniikoiden kuten ultrasuodatuksen ja käänteisosmoosin käyttöä mustaherukkatiivistemehun prosessoinnissa. Esikäsittelymenetelmiä, mm. entsyymikäsittelyä, ultrasuodatusta, entsyymikäsittelyn ja ultrasuodatuksen yhdistelmää sekä sentrifugointia, arvioitiin käänteisosmoosin suodatustehokkuuden parantamisessa. Suodatusvastuksen määrittämiseksi prosessi mallinnettiin käyttäen sarja -vastus mallia. Antosyanidien ja flavonolien säilyminen ja konsentroituminen prosesseissa määritettiin. Tulokset osoittivat, että suurin vastus käänteisosmoosissa aiheutui polarisaatiovastuksesta, kun taas kalvon vastus oli pienempi. Mallinnus osoitti myös, että likaantumisen aiheuttama vastus oli yhtä magnitudia alhaisempi kuin muut vastukset. Suodatusteho osoitti, että suurin virtaus saavutettiin ultrasuodatetulla mustaherukkamehulla. Ultrasuodatetussa mehussa oli kuitenkin huomattavasti vähemmän antosyaniineja ja flavonoleja, mikä johtui näiden yhdisteiden tarttumisesta ultrasuodatuskalvoon. Näin ollen, tämän työn tulokset suosittelevat ultrasuodatuksen korvaamista sentrifugoinnilla mehun kirkastusprosessissa. Mustaherukkamehun tuotannossa muodostuu sivutuotteena ns. puristekakkua, joka sisältää runsaasti antosyaaneja. Työssä kehitettiin antosyaanien talteenottoa tästä sivutuotteesta vertaamalla tavanomaista uuttotekniikkaa mikroaaltoavusteiseen uuttoon. Prosessi optimoitiin vastepintamenetelmällä mahdollisimman suuren antosyaanien uuttotehokkuuden saavuttamiseksi. Optimaaliset parametrit saatiin mikroaaltoavusteisessa uutossa teholla 700 W, uuttoajalla 10 minuuttia, kiintoaines-liuotin -suhteella 0,05 pH-arvossa 2, mikä saavutettiin lisäämällä suolahappoa. Tavanomaisessa uutossa parhaat antosyaanisaannot saavutettiin suolahappo-vesiliuoksella pH-arvossa 2 uuttamalla 300 minuuttia lämpötilassa 80 °C. Antosyaanisaanto oli kuitenkin tavanomaisessa uutossa optimiolosuhteissa 10% pienempi kuin mikroaaltoavusteisessa uutossa 10 minuutin uuttoajalla.

Abstract Nowadays, construction projects are implemented in highly demanding and complex built environments that require multisectoral and multidisciplinary efforts and collaboration between the project stakeholders with divergent interests, objectives, and backgrounds. Successful collaboration is one of the most efficient ways to enhance project value creation and gain better results, especially when it integrates stakeholders with different kinds of expertise and contributions. However, stakeholder management, involvement, and integration have been seen as a difficult issue, particularly in the early project phases, and have frequently resulted in conflicts and partial failures due to the lack of practical tools for managing the stakeholders and understanding their roles. The purpose of this dissertation is to enhance the understanding of how value creation can be enhanced through early stakeholder involvement and integration in the context of construction. The research applies a qualitative research approach and utilizes the case study methodology. The data for this research was collected through a survey and semi-structured interviews. The results indicate that project value creation can be increased by early stakeholder involvement and integration. However, it demands systematic stakeholder management practices in order to identify the different project-specific stakeholders and their requirements for the project. The results also show that the salience of the stakeholders varies within a project and from project to project, and some of the stakeholders are always more important than others. Nevertheless, all the stakeholders usually have the change to impact on and contribute to the project, positively or negatively. To exploit the expertise of a project stakeholder or to avoid the problems caused by the stakeholders, the framework for stakeholder identification and classification was created in this dissertation. / Tiivistelmä Rakennusteollisuuden projektien sekä rakennetun ympäristön muuttuminen yhä dynaamisemmaksi ja monimutkaisemmaksi edellyttää projektin sidosryhmien yhä aktiivisempaa ja syvällisempää osallistamista, yhteistyötä sekä vaatimusten huomioimista projektien määrittelyvaiheesta alkaen. Muilla teollisuuden aloilla sidosryhmien aikaisella osallistamisella projektin alusta alkaen on huomattu olevan positiivinen vaikutus projektien parempaan arvontuottoon ja tavoitteiden saavuttamiseen. Osoitetuista hyödyistä ja joistain hyvistä kokemuksista huolimatta, sidosryhmien osallistaminen ja integroiminen on osoittautunut yleisesti ottaen erittäin vaikeaksi ja haasteelliseksi, erityisesti vaativien ja kompleksisien projektien osalta. Pääsääntöisesti ongelmat johtuvat puutteellisesta toimintavavoista sekä tottumattomuudesta sidosryhmien kokonaisvaltaiseen osallistamiseen ja johtamiseen, mikä on usein johtanut sidosryhmien välisiin ristiriitoihin ja hankkeiden, ainakin osittaiseen, epäonnistumiseen. Tämän väitöstutkimuksen tavoite on tutkia, että miten rakennusprojektien arvontuottoa voidaan parantaa sidosryhmien aikaisella osallistamisella ja integroinnilla. Tutkimus on laadullinen tapaustutkimus, jonka empiirinen aineisto on hankittu kyselyllä sekä haastatteluilla eri rakennusteollisuuden projekteista. Tulokset vahvistavat käsityksen, että sidosryhmien aikainen osallistaminen ja integroinnilla projektin arvontuottoa kaikille sidosryhmille voidaan tehostaa. Tämä kuitenkin vaati systemaattisia toimintatapoja ja prosesseja, jotta projektin kannalta keskeisimmät sidosryhmät ja heidän vaateensa kyetään tunnistamaan sekä osaaminen voidaan hyödyntää. Tulokset myös osoittavat, että projektin sidosryhmät eivät ole tasavertaisia keskenään ja heidän keskeisyytensä vaihtelee sekä projektin aikana että projektikohtaisesti. Tästä huolimatta, yleensä kaikki sidosryhmät voivat vaikuttaa, tavalla tai toisella, projektiin joko positiivisesti tai negatiivisesti. Jotta sidosryhmät voitaisiin osallistaa mahdollisimman tehokkaasti, ja näin ollen hyödyntää heidän osaaminen ja välttää ongelmat, luotiin tässä tutkimuksessa viitekehys sidosryhmien tunnistamiseksi, arvioimiseksi ja luokittelemiseksi.