Indiana University-Purdue University Indianapolis (IUPUI) / FMS-like tyrosine receptor kinase-internal tandem duplications (FLT3-ITDs) are the most frequent deleterious mutations found in acute myeloid leukemia (AML) and portend a poor prognosis. Currently, AML patients typically achieve disease remission, yet undergo high rates of disease relapse, implying a residual post-treatment reservoir of resistant malignancy-initiating cells. This begs for new therapeutic approaches to be discovered, and suggests that targeting multiple cellular compartments is needed for improved therapeutic approaches. We have shown that the protein tyrosine phosphatase, Shp2, associates physically FLT3-ITD at tyrosine 599 (Y599) and positively regulates aberrant STAT5 activation and leukemogenesis. We also demonstrated that genetic disruption of Ptpn11, the gene encoding Shp2, increased malignancy specific survival of animals transplanted with FLT3-ITD-transduced cells, suggesting that Shp2 may regulate the function of the malignancy-initiating cell. Taken together, I hypothesized that inhibiting Shp2 can target both FLT3-ITD+ AML tumor cells as well as FLT3-ITD-expressing hematopoietic stem cells. To study this hypothesis, I employed two validation models including genetic inhibition of Shp2 interaction with FLT3-ITD in 32D cells or genetic disruption of Shp2 in FLT3-ITD-expressing HSCs. Using FLT3-ITD-expressing 32D cells as an AML tumor model, I found that mutating the Shp2 binding site on FLT3-ITD (Y599) reduced proliferation in vitro and increased latency to leukemia onset in vivo. Further, pharmacologic inhibition of Shp2 preferentially reduced proliferation of FLT3-ITD+ primary AML samples compared to FLT3-ITD- samples, and cooperated with inhibition of the lipid kinase, phospho-inositol-3-kinase (PI3K), and of the tyrosine kinase, Syk, to reduce proliferation of both FLT3-ITD+ and FLT3-ITD- AML samples. To evaluate the stem cell compartment, I crossed a murine locus-specific knock-in of FLT3-ITD with Shp2flox/flox; Mx1-Cre mice to generate FLT3-ITD; Shp2+/- mice and found that Shp2 heterozygosity dramatically inhibits hematopoietic stem cell engraftment in competitive transplant assays. Further, I found that lineage negative cells from FLT3-ITD; Shp2+/- mice demonstrated increased senescence compared to control mice, suggesting that Shp2 may regulate senescence in FLT3-ITD-expressing hematopoietic stem cells. Together, these findings indicate a cooperative relationship between the tyrosine phosphatase, Shp2, and the kinases PI3K and Syk in AML tumor cells, and indicate that Shp2 plays a positive role in the stem cell compartment to promote stem cell function of the malignancy-initiating cell in AML. Therefore, targeting Shp2 may hold therapeutic benefit for patients with FLT3-ITD+ AML.

Alzheimer’s disease (AD) is the most prevalent neurodegenerative disorder amongst older adults. Features of this disease include accumulation of amyloid-β (Aβ) plaques, neurofibrillary tau tangles (NFT), neuroinflammation, and neurodegeneration. These result in a progressive decline in memory and executive function in patients. Anxiety-related behaviours are disparaging comorbidities of AD, but how they arise in patients remains elusive. Protein-tyrosine phosphatase 1B (PTP1B) has been associated with Aβ pathology and with anxiety in separate paradigms, but whether PTP1B is involved in anxiety-related behaviours in AD mouse models is unknown. The objective of this project was to compare anxiety-related behaviours between the hAPP-J20 (Aβ pathology) and PS19 (Tau pathology) mouse models of AD and determine whether PTP1B is involved in these behaviours. Another major objective of this project was to investigate the role of PTP1B in tau pathology in the PS19 mouse model in anxiety-related brain regions, since this has not been previously examined. Using key anxiety-testing paradigms such as the elevated plus maze (EPM) and the open field test (OF), an age-based dimorphism in the onset of an inappropriately lowered anxiety response in the J20 and PS19 mouse models was identified. Furthermore, it was shown that this abnormal anti-anxiety baseline phenotype could be normalized with selective PTP1B inhibition by the drug trodusquemine and by genetic neuronal ablation. Finally, in PS19 mice at 8 months of age, it was shown that PTP1B blockade has the therapeutic effect of relieving neurotoxic phospho-tau burden and neuroinflammation. Together, these findings suggest that unleashed PTP1B may serve as a potential therapeutic target, with a possible role in AD-associated anxiety-related behaviours and AD pathology.

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I evaluated the potential of isomers of the low molecular weight phosphomonoester naphthyl phosphate as general diagnostic substrates for differentiating between two families of protein phosphatases: the protein-tyrosine phosphatases [PTPs] and the dual-specificity protein phosphatases [DSPs]. Three PTPs, PTP-1B, Tc-PTPa, and PTP-H1, and three DSPs, Cdc-14, VHR, and IphP, were challenged in vitro with alpha-naphthyl phosphate and beta-naphthyl phosphate. Both the DSPs and PTPs readily hydrolyzed beta-naphthyl phosphate. As expected, the DSPs also hydrolyzed alpha-naphthyl phosphate at rates comparable to beta-naphthyl phosphate and two of the PTPs, PTP-1B and Tc-PTPa, hydrolyzed alpha-naphthyl phosphate at a rate one-tenth that of beta-naphthyl phosphate. However, PTP-H1 hydrolyzed both alpha- and beta- naphthyl phosphate at nearly equal rates. Intriguingly, when challenged with radiolabeled phosphoproteins, PTP-H1 was markedly less stringent, by a factor of 40- to 200- fold, than PTP-1B or Tc-PTPa in its selectivity for [32P]phosphotyrosyl- over [32P]phosphoseryl- proteins in vitro. The DSPs and PTPs listed above also were challenged in vitro with free phosphoserine. Each displayed little or no activity towards free phosphoserine. However, the addition of a hydrophobic "handle" to form N-(cyclohexane carboxyl)-O-phospho-L-serine produced a derivative that was hydrolyzed by IphP at rates comparable to that of the avid substrates p-nitrophenyl phosphate and beta-naphthyl phosphate. VHR also hydrolyzed N-(cyclohexane carboxyl)-O-phospho-L-serine, though at a lower rate than IphP. Cdc14 displayed little activity towards N-(cyclohexane carboxyl)-O-phospho-L-serine. The active site of VHR was mapped and amino acid residues potentially involved in binding N-(cyclohexane carboxyl)-O-phospho-L-serine were identified. The amino acid sequence of VHR was aligned with the amino acid sequences of IphP and Cdc14 to identify the nature of the corresponding residues in IphP and Cdcd14. Low molecular weight phosphomonoesters have proven to be effective in vitro indicators of protein phosphatase activity. They also have shown potential as diagnostic substrates for specific subclasses of protein phosphatases. However, neither alpha- and beta- naphthyl phosphate nor N-(cyclohexane carboxyl)-O-phospho-L-serine proved to be universal discriminatory substrates for the functional subgroups within the family of protein-tyrosine phosphatases. Indeed, the probability of identifying such a substrate would appear to be relatively low. / Master of Science

Les chimiokines sont parmi les premiers médiateurs de la réponse immunitaire inflammatoire. Le macrophage (M0) synthétise ces dernières et les relâche afin de recruter les leucocytes aux sites d'inflammation. L'expression des chimiokines est régulée principalement au niveau transcriptionnel. Un des facteurs reconnu comme étant impliqué dans leur régulation est le facteur de transcription AP-1. Cependant, aucun rôle dans l'induction des chimiokines n'a été identifié jusqu'à présent pour son co-activateur JABl. L'objectif des travaux présentés dans cette thèse était donc d'évaluer l'implication de JABl lors de l'expression des chimiokines par le M0, et d'étudier sa propre régulation cellulaire. Ainsi, nous avons démontré que l'induction de l'expression de chimiokines par le LPS (RANTES, MlP-la, MIP-lp, MIP-2, IP-10 et MCP-1) implique le facteur de transcripfion AP-1. De plus, il fut établi que 1'activation du M0 par le LPS induit la phosphorylation de JABl par les PKCa et p, et ce, principalement au niveau de son résidu serine en position 307. Enfin, puisqu'aucun régulateur de JABl ne fut identifié chez le M0 au repos jusqu'à présent, nous avons évalué la possibilité que la protéine tyrosine phosphatase (PTP) SHP-1 jouerait ce rôle, et ce, par le biais d'une interaction directe avec celui-ci. Il fut donc déterminé que chez le M0 au repos, la SHP-1 conserve l'activité de JABl à un niveau basai en s'y attachant. En absence de stimulation, cette interaction joue un rôle dans l'inhibition de l'expression de l'ARNm de quatre chimiokines (MlP-la, MIP-ip, MIP-2 et MCP-1) dépendante des cascades signalétiques des MAP kinases ERKl/2 et JNK, ainsi que de l'activité d'AP-1 et de JABl. Les travaux rapportés dans la thèse illustre donc le rôle de JABl dans l'expression des chimiokines essentielles lors de l'inflammation par le M0. Lors d'une stimulation au LPS, cette fonction semble être effectuée après sa propre phosphorylation par les PKC a et P, tandis qu'en absence de stimulation, l'expression indésirable de chimiokines par le M0 est en partie inhibée par l'interaction entre la PTP SHP-1 et JABl. Collectivement, ces résultats suggèrent un rôle positif pour JABl dans l'inflammation et révèlent deux nouveaux mécanismes pour sa propre régulation.

Résumé : Bien que l’hypoxie soit un puissant inducteur de l’angiogenèse, l’activation des facteurs de croissance est perturbée en hyperglycémie au niveau du pied et du cœur. Cette perturbation entraîne la perte de prolifération et de migration chez les cellules endothéliales, musculaires lisses vasculaires et péricytes empêchant la formation de nouveaux vaisseaux qui mènera à l’amputation des membres inférieurs chez les patients diabétiques. Une étude a démontré qu’une augmentation de la protéine tyrosine phosphatase Src homology-2 domain-containing phosphatase-1 (SHP-1) en condition hyperglycémique chez les péricytes entraînait l’inhibition de la signalisation du PDGF-BB, ce qui résultait en le développement d’une rétinopathie diabétique. Nous avons alors soulevé l’hypothèse que l’expression de SHP-1 dans les cellules musculaires lisses vasculaires affecte la prolifération et la migration cellulaire par l’inhibition de la signalisation de l’insuline et du PDGF-BB en condition diabétique. Nos expérimentations ont été effectuées principalement à l’aide d’une culture primaire de cellules musculaires lisses primaires provenant d’aortes bovines. Comparativement aux concentrations normales de glucose (NG : 5,6 mM), l’exposition à des concentrations élevées de glucose (HG : 25 mM) pendant 48 h a résulté en l’inhibition de la prolifération cellulaire par l’insuline et le PDGF-BB autant en normoxie (20% O2) qu’en hypoxie (24 dernières heures à 1% O2). Lors des essais de migration cellulaire, aucun effet de l’insuline n’a été observé alors que la migration par le PDGF-BB fut inhibée en HG autant en normoxie qu’en hypoxie. L’exposition en HG à mener à l’inhibition de la signalisation de la voie PI3K/Akt de l’insuline et du PDGF-BB en hypoxie. Aucune variation de l’expression de SHP-1 n’a été observée mais son activité phosphatase en hypoxie était fortement inhibée en NG contrairement en HG où on observait une augmentation de cette activité. Finalement, une association a été constatée entre SHP-1 et la sous-unité bêta du récepteur au PDGF. En conclusion, nous avons démontré que l’augmentation de l’activité phosphatase de SHP-1 en hypoxie cause l’inhibition des voies de l’insuline et du PDGF-BB réduisant les processus angiogéniques des cellules musculaires lisses vasculaires dans la maladie des artères périphériques. / Abstract : Even though hypoxia is a strong angiogenic inducer, pro-angiogenic factor signaling pathways in peripheral limb and heart are altered by hyperglycemia. This disruption leads to loss of endothelial cells, vascular smooth muscle cells and pericytes proliferation and migration preventing new blood vessel formation which results in amputation of lower extremities in diabetic patients. A study has shown that increase expression of the protein tyrosine phosphatase Src homology-2 domain-containing phosphatase-1 (SHP-1) in hyperglycemic condition in pericytes caused PDGF-BB signaling inhibition resulting in the development of diabetic retinopathy. Our hypothesis is that SHP-1 expression in vascular smooth muscle cells inhibits cell proliferation and migration induced by insulin and PDGF-BB in diabetic condition. Our experiments were performed using primary culture of vascular smooth muscle cells (SMC) from bovine aortas. As compared to normal glucose concentrations (NG:5,6 mM), high glucose level (HG: 25 mM) exposure for 48h inhibited SMC proliferation induced by insulin and PDGF-BB in both normoxia (20% O2) or hypoxia (1% O2 for the last 24h). During cell migration assays, no effect of insulin was observed while PDGF-BB action of SMC migration was reduced in HG in both normal and low oxygen concentrations. HG exposure lead to inhibition of insulin- and PDGF-BB-stimulated PI3K/Akt signaling pathway in hypoxia. No variation of SHP-1 expression was observed in HG condition. However, SHP-1 phosphatase activity was elevated in HG condition during hypoxia as compared to NG concentrations. Finally, our data showed an association between SHP-1 and the PDGF receptor beta subunit. In conclusion, our results demonstrated that the increase of SHP-1 phosphatase activity in hyperglycemia and hypoxia environment caused inhibition of insulin and PDGF-BB signaling pathways reducing angiogenic processes in vascular smooth muscle cells contributing to peripheral arterial disease in diabetes.

La scoliose est la déformation de la colonne vertébrale la plus répandue. Elle atteint 3 à 4% de la population pédiatrique et dans 85% des cas, aucune cause n’a été identifiée. Ces cas sont appelés idiopathiques et les symptômes apparaissent durant la puberté; d’où le terme de ‘scoliose idiopathique de l’adolescent (SIA). Cette pathologie atteint le plus souvent les jeunes filles, en nombre et en sévérité. Ces dernières années, plusieurs hypothèses ont été proposées afin d’élucider l’étiologie de cette pathologie. Celles-ci ont mis de l’avant différents facteurs génétiques, biochimiques, mécaniques, neurologiques, musculaires ou hormonaux. Plusieurs études ont rapporté des formes familiales de scoliose, soutenant la thèse d’une prédisposition génétique. Nous avons démontré que les patients souffrant de SIA présentent un défaut de signalisation cellulaire médiée par les protéines Gi et un taux élevé d’ostéopontine (OPN) circulante. En utilisant une approche de type ‘gène candidat’, nous avons montré que la protéine tyrosine phosphatase μ (PTPμ) régule l’activité du complexe d’intégrines α5/β1 (récepteur de l’OPN) via la protéine kinase PIPKIγ. Dans ce but, nous avons utilisé des cultures primaires d’ostéoblastes issues de biopsies de patients et de cas traumatiques comme sujets contrôles. Les biopsies osseuses de patients ont été obtenues lors de l’intervention chirurgicale à partir des vertèbres T3 à L4, selon les différentes procédures. Les biopsies issues de cas traumatiques proviennent d’autres types d’os (tibia, crête iliaque, fémur). Les profils d’expression du gène PTPRM (codant pour la protéine PTPμ) ont été étudiés par PCR quantitative (qPCR). Les taux de protéines PTPμ ont été analysés par immunoprécipitation suivi d’un western blot. Pour évaluer le rôle de cette protéine, nous avons bénéficié d’un modèle murin. Machida et al. ont démontré qu’il existe un taux plus élevé de scoliose parmi les souris C57Bl/6 bipèdes obtenues suite à l’amputation des membres supérieurs, sous anesthésie, cinq semaines après la naissance. Nous avons utilisé des cultures primaires d’ostéoblastes issues de la colonne ii vertébrale de souris C57Bl/6 bipèdes, délétées du gène PTPRM (souris dites ‘KO’), afin d’évaluer le niveau de signalisation cellulaire spécifique des protéines Gi par un test fonctionnel: la technique de spectroscopie cellulaire di-électrique (SCD). Selon nos données, 85% des souris bipédales ‘KO’ pour le géne PTPRM développent une scoliose (modérée à sévère) contre 55% des souris contrôles C57Bl6 bipèdes. De plus, les niveaux de PTPμ exprimée par les ostéoblastes de 34 patients SIA se trouvent diminués par comparaison à 17 sujets contrôles. Nos études de souris bipèdes ont montré que l’inactivation du gène PTPRM augmente l’incidence et la sévérité de la scoliose, sans pour autant affecter les taux circulant d’OPN ou l’expression de ses récepteurs. Par ailleurs, dans ce même contexte, nous avons remarqué une augmentation de l’interaction entre l’OPN et l’intégrine β1 en l’absence du gène PTPRM. Les cellules issues de ces souris bipèdes KO montrent une réduction dans leurs niveaux de signalisation cellulaire médiée par les protéines Gi après stimulation par l’OPN. Cette diminution est en grande partie récupérée après traitement des cellules par un siRNA spécifique de la protéine PIPK1γ, substrat de PTPμ qui favorise la fixation de ligands aux intégrines. Ces études apportent les premières indications que la perte d’expression de PTPμ est impliquée dans le développement de la SIA, en amplifiant probablement l’effet inhibiteur de l’OPN sur la signalisation cellulaire médiée par les protéines Gi. Ces études permettent une meilleure compréhension de l’étiologie de la SIA. Elles pourraient avoir une contribution importante dans le développement futur de méthodes diagnostique et thérapeuthique dans le but d'arrete l’apparition et l’évolution de la maladie chez les enfants atteints. / Adolescent idiopathic scoliosis (AIS) is the most common form of scoliosis that affects 3-4% of the global pediatric population. In more than 85% of cases, no specific cause can be identified. Such cases are called idiopathic and occur mostly during adolescence. AIS affects mainly females in number and severity. Over the past years, many hypotheses were proposed to explain the etiology of AIS, including genetic, biochemical, mechanics, neurological, muscular and hormonal factors. Several studies have reported a high incidence of scoliosis in some families, which argues for a genetic cause of this disease. We demonstrated that AIS patients have a Gi protein signaling defect and exhibit high levels of circulating Osteopontin (OPN). The goal of this thesis is to identify the mechanisms regulating OPN signaling activity in AIS patients. We have used a candidate gene driven approach and discovered that protein tyrosine phosphatase μ (PTP μ) regulates α5β1 integrin (a known OPN receptor) through phosphate kinase type 1 gamma (PIPK1γ). To achieve our goal, we have used primary osteoblast cell cultures derived from AIS patients and biopsies from control subjects. Bone specimens were obtained intraoperatively from vertebras (varying from T3 to L4 according to the surgical procedure performed) while with trauma cases used as non-scoliotic controls, bone specimens were obtained from other anatomical sites (tibia, femur or iliac crest). Expression profiles of the RPTPM gene (encoding for PTPμ) were studied by qPCR. On the other hand, PTPμ protein levels were determined by immunoprecipitation followed by western blot. To evaluate the role of this protein in AIS etiopathogenesis, we took advantage of an animal model exhibiting a higher scoliosis incidence when maintained in a bipedal state. [1], [2] Bipedal surgeries were performed on C57Bl/6 mice after weaning (5-weeks after birth) by amputation of the forelimbs and tail under anesthesia as reported by Oyama et al. (2006). [1] We used the same approach with PTPμ knockout mice and primary osteoblast culture were derived from the spine of these mice to assess Gi protein signaling through a functional assay termed Cellular Dielectric Spectroscopy (CDS). Bipedal PTPμ knockout mice develop scoliosis more often (85%) in number and severity, than control C57Bl/6 bipedal mice (55%). Interestingly, functional analysis of osteoblasts derived from PTPμ KO mice by CDS method showed a flaw in the transmission of Gi protein coupled receptor signaling similar to a specific AIS patient subgroup. Furthermore, the clinical relevance of PTPμ was strengthened by the fact that a decrease in the gene expression level of PTPμ was observed in 34 AIS patients when compared to 17 control subjects. Such a decrease was also confirmed at the protein level. We demonstrated that genetic deletion of PTPμ enhances the incidence and severity of scoliosis without affecting plasma levels of OPN or the expression of its receptors. In contrast, increased interaction of OPN with β1 integrin was noticed in cells depleted of PTPμ. Furthermore, reduction of Gi- protein coupled receptor GiPCR signaling by OPN was also enhanced in these cells, while their response to GiPCR stimulation was improved with siRNA of phosphatidylinositol-phosphate kinase type 1 gamma (PIPK1γ), a PTPμ substrate that favours ligand binding to integrins. These studies provide the first indication that the loss of PTPμ influences the nature of idiopathic scoliosis, possibly by amplifying the inhibitory effect of OPN on GiPCR signaling. This study allows a better understanding of AIS etiology and could have an impact for the future development of innovative diagnostic methods and eventual pharmacological approaches in order to prevent AIS and stop its progression in affected children.

Afin d'apporter une aide pour la chimiotaxonomie du genre Stereocaulon, les acides gras totaux de dix espèces de Stéréocaulon, de quelques cyanolichens et d'une cyanobactérie ont été étudiés. Les profils obtenus des acides gras saturés, insaturés et ramifiés ont été comparés par classification hiérarchique ascendante. Les acides gras iso et antéiso pourraient permettre de distinguer le genre Stereocaulon des cyanolichens à la différence des autres classes d'acides gras. Dans un deuxième temps, l'étude phytochimique du lichen S. evolutum récolté en Bretagne a permis d'isoler et de caractériser 22 métabolites secondaires. Parmi ces composés, deux sont nouveaux. Sept molécules possèdent une structure proche de l'atranorine, depside abondant et récurrent chez les Stéréocaulons. L'atranorine ayant montré lors d'un criblage une activité intéressante sur le virus de l'hépatite C, six molécules ainsi que deux dérivés hémisynthétiques ont alors été évalués. L'atranorine et le 4-O-déméthylbarbatate de méthyle ont présenté une bonne activité anti-VHC, le premier ciblant l'étape de pénétration et le deuxième l'étape de réplication. D'autres composés, deux depsidones et cinq diphényléthers, ont été testés sur l'enzyme Protéine Tyrosine Phosphatase 1B (PTP1B) qui est une cible d'intétêt dans le traitement du diabète de type 2 et le cancer du sein. Les deux depsidones (acide lobarique, acide norlobarique) et un diphényléther, l'anhydro-sakisacaulon A, ont montré une inhibition de PTP1B avec des CI₅₀ similaires au témoin acide ursolique. La modélisation de cette enzyme ayant été réalisée en parallèle, les études de docking ont permis de proposer des mécanismes d'interactions mis en jeu lors de l'inhibition de PTP1B par ces métabolites secondaires lichéniques et d'envisager l'optimisation structurale de ces composés en vue d'augmenter leur activité. / Total fatty acids (FA) of ten species of Stereocaulon in addition to cyanolichens and one cyanobacterium were studied. FA profiles based on saturated-, unsaturated- and branched chain-FAs were compared using a hierarchical ascendant classification. Cyanolichens differed from the Stereocaulon genus according iso- and anteiso-FAs profiles while no differences were seen according the other FAs families. The phytochemical study of Stereocaulon evolutum, harvested in Brittany, led to isolation and identification of 22 secondary metabolites. Two were new for lichens. Among the isolated compounds, seven compounds were structurally close to atranorin, a common and abundant depside in the Stereocaulon genus. In a previous screening, atranorin exhibited a noteworthy HCV inhibition, thus six lichen compounds and two synthetic molecules were also tested. Atranorin and methyl 4-O-demethylbarbatate were the most potent without any cytotoxicity, the first being active towards the virus penetration and the latter against the virus replication. Two depsidones and five diphenylethers were also isolated and were evaluated on the Protein Tyrosine Phosphatase 1B (PTP1B), a promising target for type 2 mellitus diabetis and breast cancer. Both depsidones (lobaric acid, norlobaric acid) and the diphenylether anhydrosakisacaulon A were as potent as the positive control ursolic acid. Simultaneously, a molecular docking study between PTP1B and the seven compounds suggested the most significant interactions to conceive possible more active compounds.

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