Thesis (Ph. D.)--University of Virginia, 2000. / Spine title: Synaptic role of TYR-phosphatases. Includes bibliographical references (p. 135-172). Also available online through Digital Dissertations.

Orientador: Mario Jose Abdalla Saad / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciencias Medicas / Made available in DSpace on 2018-08-10T08:45:52Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Picardi_PatyKaroll_D.pdf: 1259568 bytes, checksum: e2ac94c827fe0b12673c8e88c5f9f7d7 (MD5) Previous issue date: 2007 / Resumo: A proteína tirosina fosfatase (PTP1B) tem sido implicada na regulação negativa da sinalização da insulina e leptina. Camundongos knockout para PTP1B são mais sensíveis à insulina e leptina e resistentes à obesidade quando alimentados com uma dieta rica em gordura. Investigamos também a função da PTP1B hipotalâmica na regulação da ingestão alimentar ações da insulina e leptina e sinalização em ratos através de um seletivo decréscimo na expressão da PTP1B. Geramos uma redução seletiva e transiente redução da PTP1B através da infusão de um oligonucleotídeo antisense, para bloquear a expressão da PTPT1B em áreas hipotalâmicas de ratos ao redor do terceiro ventrículo, em ratos-controle e obesos. A diminuição seletiva da PTP1B hipotalâmica resultou em diminuição da ingestão alimentar, redução do peso corporal, da adiposidade, dos níveis de leptina após uma alimentação rica em gordura. Ainda melhorou a ação e sinalização da leptina e insulina no hipotálamo e também a ação da insulina em fígado e músculo. Nossos resultados mostram que a redução da PTPT1B hipotalâmica pode ser suficiente para promover redução apreciável do peso corporal, melhora na sensibilidade e sinalização da insulina e leptina e na homeostase da glicose em ratos DIO / Abstract: Protein tyrosine phosphatase (PTP1B) has been implicated in the negative regulation of insulin and leptin signaling. PTP1B knockout mice are hypersensitive to insulin and leptin and resistant to obesity when fed a high-fat diet. We investigated the role of hypothalamic PTP1B in the regulation of food intake, insulin and leptin actions and signaling in rats through selective decreases in PTP1B expression in discrete hypothalamic nuclei. We generated a selective, transient reduction in PTP1B by infusion of an antisense oligonucleotide designed to blunt the expression of PTP1B in rat hypothalamic areas surrounding the third ventricle, in control and obese rats. The selective decrease in hypothalamic PTP1B resulted in decreased food intake, reduced body weight, reduced adiposity and reduced leptin levels after high-fat feeding, improved leptin and insulin action and signaling in hypothalamus and also in insulin action in liver and muscle. Our results show that hypothalamic PTP1B reduction should be sufficient to promote appreciable weight reduction and improve insulin and leptin sensitivity and signaling and glucose homeostasis in DIO rats / Doutorado / Clinica Medica / Doutor em Clínica Médica

SHP2, a protein-tyrosine phosphatase (PTP), is a key signaling regulator in multiple cell signaling processes including the Ras/MAPK pathway. This has led to SHP2 being identified as a therapeutic target in multiple types of cancers and autoimmune disorders. However, the role that the C-terminal residues play when they interact with other SHP2 domains remains unknown. This study presents data to illustrate that the C-terminal residues interact intramolecularly with other domains to inhibit PTP activity. Additionally, the identification of a specific and potent SHP2 inhibitor has proven difficult because of the high homology and positive nature of the PTP active site. This study presents the data from a high throughput fragment screen identifying several promising HIT compounds that may be further developed into potent and selective SHP2 inhibitors. Furthermore, data supporting the development of a selective SHP2 covalent inhibitor from a nonselective core molecule is presented.

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La résistance à l'insuline et le diabète de type 2 ont maintenant atteint des proportions épidémiques dans notre société. Plusieurs facteurs peuvent en déterminer le développement de même que la progression et il est primordial de bien connaître les mécanismes impliqués, de façon à pouvoir prévenir ou traiter ces complications. Les études qui sont présentées dans cette thèse nous permettent de mieux comprendre l'implication de deux nouveaux modulateurs, SHP-1 et CEACAM1, dans la régulation de la sensibilité à l'insuline et du métabolisme lipidique. Dans la première étude, nous avons identifié que la protéine tyrosine phosphatase SHP-1 était un modulateur négatif de l'action de l'insuline dans le foie et le muscle squelettique. Des modèles animaux d'inactivation spécifique de l'enzyme présentent une sensibilité à l'insuline accrue grâce à une amélioration de la voie de signalisation PI3-kinase/Akt. Par ailleurs, nous avons également observé que SHP-1 joue un rôle dans la clairance hépatique de l'insuline, et que CEACAM1, un modulateur de l'internalisation et de la dégradation de l'insuline, est un substrat de SHP-1. Dans la seconde étude, nous avons analysé les conséquences métaboliques d'une invalidation génétique de CEACAM1 chez la souris (modèle Cc1'A). Ces animaux présentent une intolérance au glucose et un défaut au niveau de la clairance hépatique de l'insuline lorsqu'on les compare à leurs contrôles. Nous avons pu observer que les souris Cc1'A sont prédisposées au développement de la stéatose hépatique et de la résistance à l'insuline, particulièrement lorsqu'on les expose de façon chronique à une alimentation riche en lipides. Ces défauts sont associés à une augmentation de l'expression d'enzymes clés impliquées dans la lipogénèse et la synthèse de cholestérol. Cette étude a permis de mettre en évidence un rôle pour CEACAM1 comme régulateur de la lipogénèse hépatique, en plus de sa fonction connue comme modulateur de la clairance de l'insuline par le foie. Ill Les résultats obtenus lors de la réalisation de ces études permettent d'améliorer nos connaissances sur la modulation complexe de la sensibilité à l'insuline et du métabolisme lipidique. Nos travaux ouvrent la porte à de nouvelles études plus spécifiques sur les rôles de SHP-1 et CEACAM1 dans la modulation du métabolisme chez l'humain, et identifient également ces protéines comme d'éventuelles cibles potentielles pour le développement d'agents thérapeutiques destinés à contrer la résistance à l'insuline, le diabète de type 2 et les désordres lipidiques.

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Three distinct families of PTPs, the conventional (cPTPs), low molecular weight (LMW PTPs), and Cdc25 PTPs, have converged upon a common catalytic mechanism and active site sequence, mainly, the phosphate-binding loop encompassing the PTP signature motif (H/V)<b>C</b>(X)₅<b>R</b>(S/T) and an essential Asp residue on a surface loop. There is little sequence similarity among the three families of phosphatases. All known LMW PTP remove phosphoryl groups esterified to the hydroxyl amino acid: tyrosine, whereas all members of the Cdc25 family are dual-specificity protein phosphatases that dephosphorylate all the hydroxyl amino acids: tyrosine, serine and threonine. The cPTP family primarily functions as tyrosine phosphatases, but it also includes dual-specific members. ORFs encoding potential cPTPs have been identified in five archaeal species: <i>Methanobacterium thermoautotrophicum</i>, <i>Methanococcus jannaschii</i>, <i>Thermococcus kodakaraensis</i>, <i>Pyrococcus horikoshii</i>, and <i>S. solfataricus</i>. Only one has been partially characterized, <i>Tk</i>-PTP from <i>T. kodakaraensis</i>. Hence, our current body of knowledge concerning the functional properties and physiological roles of these enzymes remains fragmented. The genome of <i>S. solfataricus</i> encodes a single conventional protein tyrosine phosphatase, SsoPTP. SsoPTP is the smallest known archaeal PTP (18.3 kDa) with a primary amino acid sequence that conforms to the cPTP protein tyrosine phosphatase paradigm, HCX₅R(S/T). Relatively little is known about its mode of action " whether it follows the conventional PTP mechanism or employs a different route for catalysis " or its physiological role. ORF <i>sso2453</i> from the genome of <i>Sulfolobus solfataricus</i>, encoding a protein tyrosine phosphatase, was cloned and its recombinant protein product, SsoPTP, was expressed in <i>E. coli</i> and purified by immobilized metal affinity chromatography. SsoPTP displayed the ability to dephosphorylate protein-bound phosphotyrosine as well as protein-bound phosphoserine/phosphothreonine. SsoPTP hydrolyzed both isomers of naphthyl phosphate, an indication of dual specificity. The four conserved residues within the presumed active site sequence: Asp⁶⁹, His⁹⁵, and Arg¹⁰², and the invariant Gln¹³⁹ residue were essential for catalysis, as it was predicted for the established members of the PTP family in both bacteria and eukaryotes. A substrate trapping protein variant, SsoPTP-C96S/D69A, was constructed to isolate possible SsoPTP substrates present in <i>S. solfataricus</i> cell lysates. Several potential substrates were isolated and identified by mass spectroscopy. / Ph. D.

La résistance à l'insuline associée à l'obésité est une condition qui favorise les troubles métaboliques tels que le diabète de type 2 (T2D) et la stéatose hépatique non alcoolique (NAFLD). Des altérations de l'homéostasie des lipides et du glucose, ainsi qu'une inflammation chronique de bas grade sont les caractéristiques du T2D et de la NAFLD. SHP-1 (codé par le gène *PTPN6*) est une tyrosine phosphatase avec deux domaines SH2 et est connu pour agir comme modulateur du métabolisme du glucose et des lipides. SHP-1 régule également la signalisation des cytokines et l'expression des gènes inflammatoires. En plus d'être localisé dans le cytoplasme, SHP-1 se trouve également dans le noyau des cellules épithéliales. La fonction de ce SHP-1 nucléaire reste inconnue. Ici, nous avons étudié les fonctions dépendantes et indépendantes de la tyrosine phosphatase de SHP-1 dans le contrôle des voies métaboliques. Des découvertes antérieures de notre laboratoire ont établi un lien entre SHP-1 et l'activité du récepteur activé par les proliférateurs de peroxysomes γ2 (PPARγ2). PPARγ2 est un facteur de transcription activé par des ligands et contrôle le métabolisme des lipides. Dans le chapitre II, nous avons constaté que SHP-1 interagit avec PPARγ2 principalement via son domaine SH2 en N-terminal et peut déphosphoryler PPARγ2 *in vitro*. Nos données suggèrent que PPARγ2 est phosphorylé sur le résidu tyrosine 78 (Y78) et que la déphosphorylation catalysée par SHP-1 est associée à la stabilité de PPARγ2. L'invalidation génétique de SHP-1 dans des cellules exprimant PPARγ2 augmente l'expression des cibles transcriptionnelles de PPARγ2 telles que *FABP4* et *CD36* en plus d'augmenter l'adipogenèse. Ces effets étaient atténués dans des cellules exprimant une forme mutée de PPARγ2 où la tyrosine 78 avait été remplacée par une phénylalanine ne pouvant être phosphorylée (Y78F). Collectivement, ces résultats indiquent que l'activité phosphatase de SHP-1 contrôle la stabilité de PPARγ2 et donc affecte l'adipogenèse. SHP-1 est un modulateur de la signalisation de l'insuline. L'invalidation génétique de SHP-1 spécifiquement dans les hépatocytes chez la souris (SHP-1 KO) est associée à une glycémie à jeun plus basse que celle de leurs congénères non transgéniques. Les souris SHP-1 KO présentaient également une diminution importante de la production hépatique de glucose, suggérant donc l'existence d'une autre fonction de SHP-1 sur l'homéostasie du glucose, possiblement indépendante de l'insuline. Dans le chapitre III, nous avons découvert que SHP-1 agit comme coactivateur pour contrôler la transcription du gène phosphoénolpyruvate carboxykinase 1 (PCK1) et donc régule la gluconéogenèse. SHP-1 est recruté à la région régulatrice du gène *PCK1*, le cite potentiel où il interagit avec l'ARN polymérase II (RNAPII). Le recrutement de SHP-1 à la chromatine est dépendant du facteur de transcription transducteur de signal et activateur de transcription 5 (STAT5). L'épuisement de STAT5 ainsi que SHP-1 résulte en une diminution du niveau de transcrit de *PCK1* et une réduction de la gluconéogenèse. Ensemble, ces résultats indiquent que nous avons découvert une nouvelle fonction de SHP-1 où la phosphatase agit comme un co-régulateur transcriptionnel clef du gène *PCK1* et exerce un contrôle sur la gluconéogenèse. / Insulin resistance coupled with obesity is a condition that promotes metabolic disorders such as type 2 diabetes (T2D) and non-alcoholic fatty liver disease (NAFLD). Alterations in lipid and glucose homeostasis, as well as low-grade chronic inflammation are the hallmarks of T2D and NAFLD. SHP-1 (encoded by the gene Protein Tyrosine Phosphatase Non-Receptor Type 6, *PTPN6*) is a tyrosine phosphatase with two SH2 domains and is known to act as a modulator of glucose and lipid metabolism. In addition, SHP-1 also regulates cytokine signaling and inflammatory gene expression. Besides being localized in the cytoplasm, SHP-1 is also found in the nucleus of epithelial cells. The function of this nuclear SHP-1 remains elusive. Here, we investigated tyrosine phosphatase dependent and independent functions of SHP-1 in controlling metabolic pathways. Previous findings from our laboratory established a link between SHP-1 and peroxisome proliferator-activated receptor γ2 (PPARγ2) activity. PPARγ2 is a ligand-activated transcription factor that controls lipid metabolism. In chapter II, we found that SHP-1 interacts with PPARγ2 mainly via its N-terminal SH2 domain and can dephosphorylate PPARγ2 *in vitro*. Our data suggest that PPARγ2 is tyrosine phosphorylated mainly on tyrosine residue 78 (Y78) and SHP-1-mediated dephosphorylation of PPARγ2 is associated with its stability. The knockdown of SHP-1 in PPARγ2 expressing cells resulted in enhanced expression of the classical PPARγ2 targets *FABP4* and *CD36* coupled with increased adipogenesis. These effects were blunted in cells expressing mutant PPARγ2 where tyrosine 78 has been replaced with the non-phosphorylatable phenylalanine (Y78F). Collectively, phosphatase activity of SHP-1 controls the stability of PPARγ2 thereby affecting lipid metabolism. SHP-1 is a modulator of insulin signaling. Hepatocyte-specific SHP-1 KO mice compared to their wild type control littermates exhibited lower fasting glucose and markedly decreased hepatic glucose production suggesting the existence of an additional insulin-independent effect of SHP-1 on glucose homeostasis. In Chapter III, we found that SHP-1 acts as a co-activator for controlling the transcription of the phosphoenolpyruvate carboxykinase 1 (*PCK1*) gene thereby regulating gluconeogenesis. SHP-1 is recruited to the regulatory region of the *PCK1* gene, the potential site where it interacts with RNA polymerase II (RNAPII). The recruitment of SHP-1 to the chromatin was mediated by the transcription factor signal transducer and activator of transcription 5 (STAT5). Depletion of STAT5 as well as SHP-1 resulted in a decrease in *PCK1* transcript levels and blunted gluconeogenesis. Taken together, we discovered a novel function of SHP-1 whereby it acts as a key transcriptional co-regulator of the *PCK1* gene and exerts control over gluconeogenesis. Collectively, findings from these studies provide novel functions of SHP-1 in controlling lipid and glucose metabolism.

La protéine PTP-BL possède, entre autres, 5 domaines PDZ dont deux ont été étudiés en détail. Il s'agit des domaines PDZ2 et PDZ3. Les signaux RMN de ces domaines, formant une chaîne de 252 acides aminés et possédant un poids moléculaire de 26,4 kDa, ont été attribués. L'attribution du squelette des deux domaines a été effectuée à 88%. De plus, les caractéristiques de liaison du domaine tandem PDZ2/3 ont été étudiées plus en profondeur. PDZ2 se lie, entre autres, à la protéine APC tandis que PDZ3 se lie à la protéine PRK2. Deux peptides dérivés de ces protéines ont été utilisés afin de titrer le domaine tandem PDZ2/3. Les deux domaines liaient les peptides choisis. Des perturbations ont été observées dans PDZ3 et dans le lieur lors de la titration du domaine tandem PDZ2/3 avec APC et d'autres perturbations ont été observées pour ce qui est de PDZ2 et du lieur lors de la titration avec le peptide dérivé de PRK2. Cela indiquerait une certaine coopérativité entre les deux domaines et le lieur lors de la liaison avec les peptides.