Esta tese foi dividida em três capítulos. O capítulo I descreve o desenvolvimento do método Column switching UHPLC-MS/MS para a determinação simultaneamente de fármacos psicotrópicos em amostras de plasma de pacientes esquizofrênicos. A politerapia é uma prática comum no tratamento da esquizofrenia. Portanto, a monitorização terapêutica destes fármacos tem sido realizada para o ajuste das doses e individualização da terapia farmacológica. O método Column switching UHPLC-MS/MS apresentou linearidade na faixa de concentração de 0,025 a 1,25 ng mL-1 com R2 acima de 0,9950 e a falta de teste de ajuste (p > 0,05); precisão com coeficientes de variação inferiores a 12% e exatidão com erro padrão relativo inferior a 14%. Este método foi aplicado com sucesso para determinação de fármacos em amostras de plasma de pacientes esquizofrênicos para fins de monitorização terapêutica. No capítulo II, o desempenho cromatográfico de colunas C18 superficialmente e totalmente porosas com diferentes tamanhos de partícula foi avaliado para a análise de fármacos psicotrópicos por LC-MS/MS e LC-DAD. Com o sistema LC-MS/MS foram avaliados os seguintes parâmetros cromatográficos: altura do prato reduzido vs velocidade linear reduzida, impedância vs velocidade linear reduzida, tempo da corrida cromatográfica vs vazão, pressão vs vazão, resolução, capacidade de pico, assimetria e fator de retenção. Já com o sistema LC-DAD foram avaliados a hidrofobicidade, atividade silanol e impurezas metálicas também foram avaliadas. As colunas com superfície carregada apresentaram maior eficiência cromatográfica para os fármacos em sua forma ionizada. Já as colunas com partículas menores que 2 µm (Cortecs 1,6 µm, Acquity 1,7 µm, e Kinetex 1,7 µm) apresentaram maior eficiência cromatográfica para os fármacos na forma parcialmente ionizada. Os modelos matemáticos gerados foram capazes de prever a pressão e o tempo da corrida cromatográfica em diferentes vazões para todas as colunas. Considerando a eficiência, impedância, resolução, capacidade de pico, fator de retenção e hidrofobicidade, as colunas Cortecs 1,6 µm e Acquity 1,7 µm apresentaram melhor desempenho durante a análise dos fármacos em amostra de plasma. O capítulo III descreve o desenvolvimento e validação dos métodos SPME-UHPLC-MS/MS e Bio-SPME-Nano-ESI-MS/MS para a determinação dos endocanabinóides (AEA e 2-AG) em amostras biológicas. Para a otimização do processo SPME foram avaliadas as fases SPME (C18, C30 e HLB) e os solventes para dessorção (metanol, acetonitrila e isopropanol). Os aditivos modificadores de matriz, como cloridrato de guanidina, ácido trifluoroacético e acetonitrila foram avaliados por planejamento experimental. Os métodos SPME-UHPLC-MS/MS e Bio-SPME-Nano-ESI-MS/MS, com a fase HLB biocompatível, apresentaram para ambos endocanabinóides valores de LOQs de 1 ng mL-1 e 50 ng mL-1, respectivamente. O método Bio-SPME-Nano-ESI-MS/MS permitiu o direto acoplamento da fibra SPME ao espectrômetro de massas via dessorção/ionização nanoeletrospray que resultou em rápida determinação quantitativa dos endocanabinóides em amostras biológicas. / This thesis is divided into three chapters. Chapter I describes the development of a column switching UHPLCMS/MS method to determine psychotropic drugs in schizophrenic patients plasma samples simultaneously. Polytherapy is a common practice in schizophrenia treatment. Therefore, therapeutic drug monitoring has been applied to adjust doses and to customize pharmacological therapy. The column switching UHPLCMS/MS method developed here is linear at concentrations ranging from 0.025 to 1.25 ng mL-1 with R2 above 0.9950 and presents lack of fit test (p > 0.05), precision with coefficients of variation lower than 12%, and accuracy with relative standard error lower than 14%. This method was successfully applied to determine drugs in schizophrenic patients plasma samples for therapeutic drug monitoring. In chapter II, the chromatographic performance of C18 superficially porous columns and of C18 fully porous columns with different particle sizes were evaluated for analysis of psychotropic drugs by LC-MS/MS and LC-DAD. Within the LC-MS/MS system, the following chromatographic parameters were assessed: reduced plate height vs reduced linear velocity, impedance vs reduced linear velocity, chromatographic run time vs flow rate, backpressure vs flow rate, resolution, peak capacity, asymmetry, and retention factor. Within the LC-DAD system, hydrophobicity, silanol activity, and metal impurities were also examined. Columns with charged surface displayed improved chromatographic efficiency for drugs in the ionized form. Columns with particles smaller than 2 µm (Cortecs 1.6 µm, Acquity 1.7 µm, and Kinetex 1.7 µm) presented higher chromatographic efficiency for the drugs, which were in their partially ionized form. The generated mathematical models were able to predict the backpressure and the chromatographic run time at different flow rates for all the columns. Considering efficiency, impedance, resolution, peak capacity, retention factor, and hydrophobicity, columns Cortecs 1.6 µm and Acquity 1.7 µm provided the best performance during analysis of drugs in plasma samples. Chapter III describes the development and validation of the SPME-UHPLC-MS/MS and the Bio-SPME-Nano-ESI-MS/MS methods for determination of endocannabinoids (AEA and 2-AG) in biological samples. To optimize the SPME process, SPME coatings (C18, C30, and HLB) and solvents for desorption (methanol, acetonitrile, and isopropanol) were evaluated. Matrix modifier additives, such as guanidine hydrochloride, trifluoroacetic acid, and acetonitrile, were assessed by experimental design. The SPME-UHPC-MS/MS and the Bio-SPME-Nano-ESI-MS/MS methods with HLB biocompatible coating provided LOQ values of 1 ng mL-1 and 50 ng mL-1, respectively, for both endocannabinoids. The Bio-SPME-Nano-ESI-MS/MS method allowed direct coupling of SPME fibers to the mass spectrometer by desorption/ionization nanoelectrospray, which resulted in rapid quantitative determinations of endocannabinoids in biological samples.

Esta tese foi dividida em três capítulos. O capítulo I descreve o desenvolvimento do método Column switching UHPLC-MS/MS para a determinação simultaneamente de fármacos psicotrópicos em amostras de plasma de pacientes esquizofrênicos. A politerapia é uma prática comum no tratamento da esquizofrenia. Portanto, a monitorização terapêutica destes fármacos tem sido realizada para o ajuste das doses e individualização da terapia farmacológica. O método Column switching UHPLC-MS/MS apresentou linearidade na faixa de concentração de 0,025 a 1,25 ng mL-1 com R2 acima de 0,9950 e a falta de teste de ajuste (p > 0,05); precisão com coeficientes de variação inferiores a 12% e exatidão com erro padrão relativo inferior a 14%. Este método foi aplicado com sucesso para determinação de fármacos em amostras de plasma de pacientes esquizofrênicos para fins de monitorização terapêutica. No capítulo II, o desempenho cromatográfico de colunas C18 superficialmente e totalmente porosas com diferentes tamanhos de partícula foi avaliado para a análise de fármacos psicotrópicos por LC-MS/MS e LC-DAD. Com o sistema LC-MS/MS foram avaliados os seguintes parâmetros cromatográficos: altura do prato reduzido vs velocidade linear reduzida, impedância vs velocidade linear reduzida, tempo da corrida cromatográfica vs vazão, pressão vs vazão, resolução, capacidade de pico, assimetria e fator de retenção. Já com o sistema LC-DAD foram avaliados a hidrofobicidade, atividade silanol e impurezas metálicas também foram avaliadas. As colunas com superfície carregada apresentaram maior eficiência cromatográfica para os fármacos em sua forma ionizada. Já as colunas com partículas menores que 2 µm (Cortecs 1,6 µm, Acquity 1,7 µm, e Kinetex 1,7 µm) apresentaram maior eficiência cromatográfica para os fármacos na forma parcialmente ionizada. Os modelos matemáticos gerados foram capazes de prever a pressão e o tempo da corrida cromatográfica em diferentes vazões para todas as colunas. Considerando a eficiência, impedância, resolução, capacidade de pico, fator de retenção e hidrofobicidade, as colunas Cortecs 1,6 µm e Acquity 1,7 µm apresentaram melhor desempenho durante a análise dos fármacos em amostra de plasma. O capítulo III descreve o desenvolvimento e validação dos métodos SPME-UHPLC-MS/MS e Bio-SPME-Nano-ESI-MS/MS para a determinação dos endocanabinóides (AEA e 2-AG) em amostras biológicas. Para a otimização do processo SPME foram avaliadas as fases SPME (C18, C30 e HLB) e os solventes para dessorção (metanol, acetonitrila e isopropanol). Os aditivos modificadores de matriz, como cloridrato de guanidina, ácido trifluoroacético e acetonitrila foram avaliados por planejamento experimental. Os métodos SPME-UHPLC-MS/MS e Bio-SPME-Nano-ESI-MS/MS, com a fase HLB biocompatível, apresentaram para ambos endocanabinóides valores de LOQs de 1 ng mL-1 e 50 ng mL-1, respectivamente. O método Bio-SPME-Nano-ESI-MS/MS permitiu o direto acoplamento da fibra SPME ao espectrômetro de massas via dessorção/ionização nanoeletrospray que resultou em rápida determinação quantitativa dos endocanabinóides em amostras biológicas. / This thesis is divided into three chapters. Chapter I describes the development of a column switching UHPLCMS/MS method to determine psychotropic drugs in schizophrenic patients plasma samples simultaneously. Polytherapy is a common practice in schizophrenia treatment. Therefore, therapeutic drug monitoring has been applied to adjust doses and to customize pharmacological therapy. The column switching UHPLCMS/MS method developed here is linear at concentrations ranging from 0.025 to 1.25 ng mL-1 with R2 above 0.9950 and presents lack of fit test (p > 0.05), precision with coefficients of variation lower than 12%, and accuracy with relative standard error lower than 14%. This method was successfully applied to determine drugs in schizophrenic patients plasma samples for therapeutic drug monitoring. In chapter II, the chromatographic performance of C18 superficially porous columns and of C18 fully porous columns with different particle sizes were evaluated for analysis of psychotropic drugs by LC-MS/MS and LC-DAD. Within the LC-MS/MS system, the following chromatographic parameters were assessed: reduced plate height vs reduced linear velocity, impedance vs reduced linear velocity, chromatographic run time vs flow rate, backpressure vs flow rate, resolution, peak capacity, asymmetry, and retention factor. Within the LC-DAD system, hydrophobicity, silanol activity, and metal impurities were also examined. Columns with charged surface displayed improved chromatographic efficiency for drugs in the ionized form. Columns with particles smaller than 2 µm (Cortecs 1.6 µm, Acquity 1.7 µm, and Kinetex 1.7 µm) presented higher chromatographic efficiency for the drugs, which were in their partially ionized form. The generated mathematical models were able to predict the backpressure and the chromatographic run time at different flow rates for all the columns. Considering efficiency, impedance, resolution, peak capacity, retention factor, and hydrophobicity, columns Cortecs 1.6 µm and Acquity 1.7 µm provided the best performance during analysis of drugs in plasma samples. Chapter III describes the development and validation of the SPME-UHPLC-MS/MS and the Bio-SPME-Nano-ESI-MS/MS methods for determination of endocannabinoids (AEA and 2-AG) in biological samples. To optimize the SPME process, SPME coatings (C18, C30, and HLB) and solvents for desorption (methanol, acetonitrile, and isopropanol) were evaluated. Matrix modifier additives, such as guanidine hydrochloride, trifluoroacetic acid, and acetonitrile, were assessed by experimental design. The SPME-UHPC-MS/MS and the Bio-SPME-Nano-ESI-MS/MS methods with HLB biocompatible coating provided LOQ values of 1 ng mL-1 and 50 ng mL-1, respectively, for both endocannabinoids. The Bio-SPME-Nano-ESI-MS/MS method allowed direct coupling of SPME fibers to the mass spectrometer by desorption/ionization nanoelectrospray, which resulted in rapid quantitative determinations of endocannabinoids in biological samples.

An acetonitrile based protein extraction method was developed that demonstrated high efficient and effective removal of high abundant proteins from both human and murine serum. The protein content of the extract was characterised using gel electrophoresis, the Bradford assay and liquid chromatography tandem mass spectrometry (LC-MS/MS) with database searching. Selected reaction monitoring (SRM) analysis was used to quantify the levels of high abundant serum proteins to further validate the extraction methodology. The ACN depletion method, in combination with artificial neural networks (ANNs) data mining software, was applied to a murine growth hormone (GH) gene doping study with the aim of identifying biomarker ions capable of detecting gene doping. The LC-MS and ANNs analysis approach failed to conclusively identify a biomarker to gene doping in the mouse model. However, the application of the same technique to serum from a rhGH administration study in humans, returned models capable of discriminating between rhGH treated placebo states. The ion identified as being the most discriminatory was characterised using mass spectrometry, and was derived from the protein leucine-rich a-2-glycoprotein (LRG). Multiple LRG related tryptic peptides were identified as being up-regulated upon dosing with recombinant human GH (rhGH). A high throughput LC-MS/MS and SRM approach was developed to quantify proteins in human serum. The approach was validated by comparison of LC-MS/MS derived APO A1 concentrations with those obtained using established clinical analyser technologies. The LC-MS/MS methodology was applied to a large cohort of 257 serum samples from two rhGH administration studies performed at Royal Free Hospital . The two administrations included serum samples from 15 individuals who had been dosed daily with rhGH. Serum concentrations of the established rhGH biomarker insulin-like growth factor-I (IGF-I) were quantified by LC-MS/MS and compared well with those determined using two different immunoassay-based methodologies. Serum concentrations of the LRG protein were measured simultaneously with IGF-I and appeared to increase in 14 of the 15 rhGH dosed individuals. Combining the LRG and IGF-I data further increased the separation of rhGH treated and placebo states within each individual, and the application of ANNs analysis showed that the combination of the two proteins increased the discrimination characteristics over using IGF-I alone. The murine equivalent of the LRG protein was identified and SRM transitions for a tryptically derived peptide were developed, along with transitions for monitoring a peptide from the murine IGF-I protein. These transitions were used to quantify the two proteins in the remaining aliquots from a murine GH gene doping experiment, however neither protein appeared to increase in the GH +ve plasmid samples that were analysed.

Chez les Vibrio spp., le QS est impliqué dans de nombreuses fonctions comme la colonisation de niche écologiques, les stratégies de survie ou encore la virulence. Cependant, pour la majorité des espèces de Vibrio, la diversité des AHLs produites reste largement sous-estimée et l'étude du QS est encore limitée à quelques espèces modèles ou pathogènes. Toutefois, dans les environnements aquatiques, ces espèces sont minoritaires et les espèces les plus abondantes ne sont que très peu étudiées. Nos résultats ont révélé une importante diversité d'AHLs mais aussi, de façon surprenante, une hétérogénéité dans les phénotypes de production d'AHL au sein d'une même espèce de Vibrio. Pour la première fois, nous avons mis en évidence qu'une même souche de Vibrio pouvait présenter des phénotypes de production d'AHLs différent au cours du temps et une approche statistique a révélé l'implication de certains déterminants biotiques et abiotiques dans ces variations temporelles. Par ailleurs, une approche à micro-échelle a révélé une structuration des populations de Vibrio en unités fonctionnelles constituées de souches phylogénétiquement proches qui partagent des niches écologiques spécifiques et des comportements sociaux. Nos résultats ont mis en évidence que les modalités de communication pouvaient être hétérogènes suggérant l'absence d'un langage commun au sein de ces unités fonctionnelles. En conclusion, ce travail de thèse a permis d'apporter de nouvelles connaissances sur le QS chez les Vibrio dans l'environnement marin, de la souche à la population, et propose une vision intégrée des mécanismes de régulation de la production d'AHLs dans l'environnement. / Quorum sensing is an important mechanism among Vibrio species and is involved in many vital functions such as niche colonization, survival strategies or virulence. However, AHL diversity still largely underestimated for the majority of Vibrio species and the current knowledge on AHL-mediated QS is limited to a few pathogenic or bioluminescent species. Nonetheless, these species are weakly abundant in seawater while dominant species in the environment are poorly studied. Our results revealed a unexpected diversity of AHL molecules but also a quite surprising intra-species diversity of AHL production phenotypes. For the first time, we showed that different isolates of a single genotype switched between different AHL production phenotypes among time and we revealed the potential involvement of abiotic and biotic parameters in these variations. However, it appears that when studied at a microscale, Vibrio populations are showing a functional structuration in ecological units consisting of phylogenetically close strains sharing habitat and social traits. In this context, it was necessary to determine if these different AHL production phenotypes were associated to different micro-habitats in the water column. We did not demonstrate that a common language was spoken within ecological populations. This thesis work provide new insights on AHL-mediated QS among a broader range of species and among Vibrio populations and depicts the potential impact of multiple aspects of marine environments on AHL production.

The foci of this dissertation are on advanced liquid chromatography (LC) separation and mass spectrometry (MS) techniques for the analysis of small bioactive molecules. In addition to discussing general aspects of such techniques the results from analyses of polyphenols (PPs), alkaloids and amino acids published in five appended studies are presented and discussed. High efficiency and well understood principles make LC the method of choice for separating analytes in many kinds of scientific investigations. Moreover, when LC is coupled to an MS instrument, analytes are separated in two stages: firstly they are separated and pre-concentrated in narrow bands using LC and then separated according to their mass-to-charge (m/z) ratios in the MS instrument. Some MS instruments can provide highly accurate molecular weight measurements and mass resolution allowing identification of unknown compounds based purely on MS data, thus making prior separation unnecessary. However, prior separation is essential for analyzing substances in most complex matrices – especially useful is the ultra-high performance LC (UHPLC). The advantages of using UHPLC rather than HPLC for the analysis of PPs in tea and wine were evaluated in one of the studies this thesis is based upon. The phenolic composition of red wine was also examined, using a novel LDI technique, following solid phase extraction (SPE). A class of small aromatic molecules (medicinally important alkaloids) also proved to be amenable to straightforward analysis, by thin layer chromatography (TLC) work-up followed by LDI-MS. Finally, a LC-MS method for monitoring neurotoxins (β-N-methyl-amino-L-alanine and 2,3-diaminobutyric acid) in complex biological matrices was developed and applied. Overall, the studies show that careful attention to the physicochemical properties of analytes can provide insights that can greatly facilitate the development of alternative methods to analyze them, e.g. by LDI. / <p>At the time of the doctoral defense, the following papers were unpublished and had a status as follows: Paper 4: In press. Paper 5: Manuscript.</p>

Proteínas presentes no plasma seminal (PS) vêm sendo estudadas em relação a níveis reprodutivos de fertilidade ou infertilidade, em várias espécies de mamíferos, particularmente em animais domésticos. As proteínas do plasma seminal equino 1 (HSP-1) e 2 (HSP-2) são as proteínas mais abundantes nesta espécie. O objetivo deste estudo foi investigar a concentração das proteínas HSP-1/2 presentes no plasma seminal bem como o conteúdo de proteína total, em garanhões adultos durante a estação reprodutiva e fora dela, para determinar se essas concentrações estão relacionadas com a fertilidade. O PS foi obtido a partir de 42 ejaculados de 11 garanhões adultos (3-25 anos). Os animais foram alocados em dois grupos (alta e baixa fertilidade) de acordo com as taxas de prenhez de éguas e dos dados de viabilidade do sêmen avaliados no primeiro dia de coleta. As concentrações das HSP-1/2 (mg/mL) foram medidas e analisadas por um sistema de Cromatografia Líquida de Ultra Eficiência utilizando uma coluna UHPLC. Houve diferença significativa (P<0,05) na concentração de proteínas totais e das proteínas HSP-1/2 (mg/mL, média ± DP) entre os ejaculados de animais de alta e baixa fertilidade. Não houve diferença na concentração das HSP-1/2 no primeiro e segundo ejaculados de garanhões de alta fertilidade, tanto dentro ou fora da estação reprodutiva. O PS de animais classificados no grupo de baixa fertilidade apresentou diferença significativa (P<0,05) na concentração das HSP-1/2 entre o primeiro e segundo ejaculado, tanto no período da estação reprodutiva quanto fora dele. Em conclusão, a concentração das principais proteínas do plasma seminal em garanhões, as HSP-1/2, foi maior em ejaculados de garanhões de baixa fertilidade, o que não parece ser influenciado pelo período de coleta, podendo assim, ser indicada como biomarcador da baixa fertilidade em garanhões. / Seminal plasma (SP) proteins have been assessed in relation to reproductive fertility levels or infertility, in several species of mammals, particularly domestic animals. Horse seminal plasma proteins 1 (HSP-1) and 2 (HSP-2) are the most abundant proteins in equine seminal plasma. The aim of this study was to investigate in adult stallions the concentrations of seminal plasma HSP-1/2 and total protein in the breeding season and non-breeding season and to determine if these concentrations were related with fertility. SP was obtained from 42 ejaculates of 11 adult stallions (3-25 yrs). Stallions were allocated into two groups (good and poor fertility) according to pregnancy rates of mares, and to their semen viability data in the first collection day. Seminal plasma HSP- 1/2 concentrations (mg/mL) were measured and analyzed by an Ultra High Performance Liquid Chromatography using a UHPLC column. There were significant differences (P<0.05) in total protein and HSP-1/2 concentration (mg/mL, mean ± SD) in the ejaculates from good and poor fertility stallions. The HSP-1/2 concentration did not show differences in the first and second ejaculates of good fertility stallions in both the non-breeding and breeding season. SP of stallions classified as poor fertility showed significant difference (P<0.05) in HSP-1/2 concentration between the first and second ejaculate in both the non-breeding and breeding season. In conclusion, the concentration of the major proteins of stallion seminal plasma HSP-1/2 was higher in ejaculates from stallions with poor fertility, is not influenced by the season and could serve as biomarker for poor fertility in stallions.

In recent years, the indiscriminate use of pesticides and a lack of adoption of good agricultural practices have been evidenced by the results of analyzes of residues of pesticides in food. Thus, the goal of this work was to develop and validate two methods for determination of pesticide residues in plum, apple, pear and peach, with analysis by ultra high performance liquid chromatography coupled to tandem mass spectrometry (UHPLC-MS/MS). In the development of the QuEChERS method, different conditions of the extract clean-up were tested. In the validation results, the linear range of the method was 5 to 200 μg kg-1 with recoveries were between 70 and 120% and RSD ≤20%. The practical limit of quantification (LOQ) for 161 compounds was 10 μg kg-1. In MSPD optimization, different sorbents (C18, florisil®, PSA, alumina, amino, silica, chitosan, Oasis® HLB, StrataTM-X and fluoridated) were tested as solid support in different proportions with the sample. The homogenization was carried out with metallic spheres and extraction with acetonitrile and ultrasound. Accuracy and precision results obtained by MSPD were adequate for 131 pesticides residues studied, with recovery results ranging between 70 and 120%, with RSD ≤ 20%. The studied compounds presented practical LOQ of 10 μg kg-1. In the analysis of 100 samples of the studied fruits, different pesticides residues were found in concentrations ranging from <LOQ to 2.334,6 μg kg-1. / Nos últimos anos, o uso indiscriminado de agrotóxicos e a não adoção das boas práticas agrícolas têm sido evidenciados pelos resultados de análises de resíduos de agrotóxicos em alimentos. Assim, este trabalho teve como objetivo desenvolver e validar dois métodos para determinação de resíduos de agrotóxicos em ameixa, maçã, pera e pêssego, com análise por cromatografia líquida de ultra eficiência acoplada à espectrometria de massas em série (UHPLC-MS/MS). No desenvolvimento do método QuEChERS, diferentes condições da limpeza do extrato foram testadas. Nos resultados de validação, o intervalo linear do método foi de 5 a 200 μg kg-1, com recuperações entre 70 e 120% e RSD ≤ 20%. O limite de quantificação prático (LOQ) para 161 compostos foi de 10 μg kg-1. No desenvolvimento da técnica MSPD foram testados diferentes sorventes (C18, florisil®, PSA, alumina, amino, sílica, quitosana, Oasis® HLB, StrataTM-X e fase fluorada) como suporte sólido em diferentes proporções com a amostra. A homogeneização foi realizada com auxílio de esferas metálicas e a extração com acetonitrila e ultrassom. Os resultados de exatidão e precisão obtidos por MSPD foram adequados para resíduos de 131 agrotóxicos, com resultados de recuperação entre 70 e 120%, with RSD ≤ 20%. Os compostos estudados apresentaram LOQ prático de 10 μg kg-1. Na análise de 100 amostras das frutas estudadas, foram quantificados resíduos de diferentes agrotóxicos em concentrações entre <LOQ e 2.334,6 μg kg-1.

Proteínas presentes no plasma seminal (PS) vêm sendo estudadas em relação a níveis reprodutivos de fertilidade ou infertilidade, em várias espécies de mamíferos, particularmente em animais domésticos. As proteínas do plasma seminal equino 1 (HSP-1) e 2 (HSP-2) são as proteínas mais abundantes nesta espécie. O objetivo deste estudo foi investigar a concentração das proteínas HSP-1/2 presentes no plasma seminal bem como o conteúdo de proteína total, em garanhões adultos durante a estação reprodutiva e fora dela, para determinar se essas concentrações estão relacionadas com a fertilidade. O PS foi obtido a partir de 42 ejaculados de 11 garanhões adultos (3-25 anos). Os animais foram alocados em dois grupos (alta e baixa fertilidade) de acordo com as taxas de prenhez de éguas e dos dados de viabilidade do sêmen avaliados no primeiro dia de coleta. As concentrações das HSP-1/2 (mg/mL) foram medidas e analisadas por um sistema de Cromatografia Líquida de Ultra Eficiência utilizando uma coluna UHPLC. Houve diferença significativa (P<0,05) na concentração de proteínas totais e das proteínas HSP-1/2 (mg/mL, média ± DP) entre os ejaculados de animais de alta e baixa fertilidade. Não houve diferença na concentração das HSP-1/2 no primeiro e segundo ejaculados de garanhões de alta fertilidade, tanto dentro ou fora da estação reprodutiva. O PS de animais classificados no grupo de baixa fertilidade apresentou diferença significativa (P<0,05) na concentração das HSP-1/2 entre o primeiro e segundo ejaculado, tanto no período da estação reprodutiva quanto fora dele. Em conclusão, a concentração das principais proteínas do plasma seminal em garanhões, as HSP-1/2, foi maior em ejaculados de garanhões de baixa fertilidade, o que não parece ser influenciado pelo período de coleta, podendo assim, ser indicada como biomarcador da baixa fertilidade em garanhões. / Seminal plasma (SP) proteins have been assessed in relation to reproductive fertility levels or infertility, in several species of mammals, particularly domestic animals. Horse seminal plasma proteins 1 (HSP-1) and 2 (HSP-2) are the most abundant proteins in equine seminal plasma. The aim of this study was to investigate in adult stallions the concentrations of seminal plasma HSP-1/2 and total protein in the breeding season and non-breeding season and to determine if these concentrations were related with fertility. SP was obtained from 42 ejaculates of 11 adult stallions (3-25 yrs). Stallions were allocated into two groups (good and poor fertility) according to pregnancy rates of mares, and to their semen viability data in the first collection day. Seminal plasma HSP- 1/2 concentrations (mg/mL) were measured and analyzed by an Ultra High Performance Liquid Chromatography using a UHPLC column. There were significant differences (P<0.05) in total protein and HSP-1/2 concentration (mg/mL, mean ± SD) in the ejaculates from good and poor fertility stallions. The HSP-1/2 concentration did not show differences in the first and second ejaculates of good fertility stallions in both the non-breeding and breeding season. SP of stallions classified as poor fertility showed significant difference (P<0.05) in HSP-1/2 concentration between the first and second ejaculate in both the non-breeding and breeding season. In conclusion, the concentration of the major proteins of stallion seminal plasma HSP-1/2 was higher in ejaculates from stallions with poor fertility, is not influenced by the season and could serve as biomarker for poor fertility in stallions.

Proteínas presentes no plasma seminal (PS) vêm sendo estudadas em relação a níveis reprodutivos de fertilidade ou infertilidade, em várias espécies de mamíferos, particularmente em animais domésticos. As proteínas do plasma seminal equino 1 (HSP-1) e 2 (HSP-2) são as proteínas mais abundantes nesta espécie. O objetivo deste estudo foi investigar a concentração das proteínas HSP-1/2 presentes no plasma seminal bem como o conteúdo de proteína total, em garanhões adultos durante a estação reprodutiva e fora dela, para determinar se essas concentrações estão relacionadas com a fertilidade. O PS foi obtido a partir de 42 ejaculados de 11 garanhões adultos (3-25 anos). Os animais foram alocados em dois grupos (alta e baixa fertilidade) de acordo com as taxas de prenhez de éguas e dos dados de viabilidade do sêmen avaliados no primeiro dia de coleta. As concentrações das HSP-1/2 (mg/mL) foram medidas e analisadas por um sistema de Cromatografia Líquida de Ultra Eficiência utilizando uma coluna UHPLC. Houve diferença significativa (P<0,05) na concentração de proteínas totais e das proteínas HSP-1/2 (mg/mL, média ± DP) entre os ejaculados de animais de alta e baixa fertilidade. Não houve diferença na concentração das HSP-1/2 no primeiro e segundo ejaculados de garanhões de alta fertilidade, tanto dentro ou fora da estação reprodutiva. O PS de animais classificados no grupo de baixa fertilidade apresentou diferença significativa (P<0,05) na concentração das HSP-1/2 entre o primeiro e segundo ejaculado, tanto no período da estação reprodutiva quanto fora dele. Em conclusão, a concentração das principais proteínas do plasma seminal em garanhões, as HSP-1/2, foi maior em ejaculados de garanhões de baixa fertilidade, o que não parece ser influenciado pelo período de coleta, podendo assim, ser indicada como biomarcador da baixa fertilidade em garanhões. / Seminal plasma (SP) proteins have been assessed in relation to reproductive fertility levels or infertility, in several species of mammals, particularly domestic animals. Horse seminal plasma proteins 1 (HSP-1) and 2 (HSP-2) are the most abundant proteins in equine seminal plasma. The aim of this study was to investigate in adult stallions the concentrations of seminal plasma HSP-1/2 and total protein in the breeding season and non-breeding season and to determine if these concentrations were related with fertility. SP was obtained from 42 ejaculates of 11 adult stallions (3-25 yrs). Stallions were allocated into two groups (good and poor fertility) according to pregnancy rates of mares, and to their semen viability data in the first collection day. Seminal plasma HSP- 1/2 concentrations (mg/mL) were measured and analyzed by an Ultra High Performance Liquid Chromatography using a UHPLC column. There were significant differences (P<0.05) in total protein and HSP-1/2 concentration (mg/mL, mean ± SD) in the ejaculates from good and poor fertility stallions. The HSP-1/2 concentration did not show differences in the first and second ejaculates of good fertility stallions in both the non-breeding and breeding season. SP of stallions classified as poor fertility showed significant difference (P<0.05) in HSP-1/2 concentration between the first and second ejaculate in both the non-breeding and breeding season. In conclusion, the concentration of the major proteins of stallion seminal plasma HSP-1/2 was higher in ejaculates from stallions with poor fertility, is not influenced by the season and could serve as biomarker for poor fertility in stallions.

Orientador: Carla Beatriz Grespan Bottoli / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Química / Made available in DSpace on 2018-08-26T16:02:57Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Andre_MarceloFabiano_D.pdf: 2661780 bytes, checksum: 3f8c06d00ddf653d50feed242ea04514 (MD5) Previous issue date: 2014 / Resumo: Antioxidantes naturais são metabólitos secundários presentes em uma gama variada de plantas medicinais com propriedades específicas. Podem apresentar ação tranqüilizante, analgésica, antiinflamatória, citotóxica, anticoncepcional, antimicrobiana, antiviral e fungicida.Vários metabólitos secundários são conhecidos. Os três principais grupos são os terpenos, os polifenóis (flavonóides) e os alcalóides. A carqueja foi escolhida por apresentar em sua composição vários compostos fenólicos (antioxidantes), tais como a quercetrina, a rutina e o canferol. Estes flavonóides de origem natural são fisiologicamente ativos, isto é, apresentam propriedades anti-inflamatórias, antifragilidade capilar e antitumoral, respectivamente, além de serem antioxidantes. O trabalho foi realizado em duas etapas, a saber, a primeira etapa foi realizada no Brasil, e teve como objetivo, o desenvolvimento e validação de métodos para determinação de compostos fenólicos (ácidos fenólicos e flavonóides) em extrato de carqueja empregando técnicas cromatográficas e eletroforéticas e análise de algumas amostras comerciais de diferentes regiões. A segunda etapa foi realizada na Espanha, tendo como objetivos o desenvolvimento e validação do método empregando eletroforese capilar acoplada a um espectrômetro de massas (CE-ESI-TOF), utilizando a técnica de extração com líquido pressurizado (PLE), considerada avançada e verde. Também na Espanha, foi realizada a determinação de fenóis totais e atividade antioxidante empregando os ensaios de Folin e DPPH, respectivamente. O desenvolvimento e preparo de amostra incluiu a otimização das etapas de extração e hidrólise dos compostos fenólicos presentes na carqueja. A quantificação pelas técnicas cromatográficas foi realizada empregando coluna com fase estacionária C-18 e eluição por gradiente, para as técnicas eletroforéticas foi utilizado meio tamponante (tetraborato de potássio, pH 10) com 10% de modificador orgânico. Os métodos foram validados segundo orientações da ANVISA. Foram analisadas amostras comerciais de três estados, a saber, São Paulo, Minas Gerais e Bahia. A amostra do Estado da Bahia apresentou o maior teor de concetração dos compostos fenólicos estudados, excetuando o ácido gálico que está em maior teor de concentração na amostra do Estado de Minas Gerais. Comparando a concentração destes compostos nas diferentes amostras, através da determinação do teor por UHPLC-MS/MS e HPLC-UV, ao nível de 5% de significância, não houve diferença significativa entre as técnicas / Abstract: Natural antioxidants are secondary metabolites in a wide range of medicinal plants with specific properties. May present action tranquilizer, analgesic, anti-inflammatory, cytotoxic, contraceptive, antimicrobial, antiviral and fungicida.Vários secondary metabolites are known. The three main groups are terpenes, polyphenols (flavonoids) and alkaloids. Carqueja was chosen because it has in its composition various phenolic compounds (antioxidants), such as quercetrin, rutin and kaempferol. These flavonoids are naturally occurring physiologically active, i.e., exhibit anti-inflammatory, antitumor and antifragilidade capillary, respectively, and are antioxidants. The work was carried out in two stages, namely, the first step was made in Brazil, and aimed to the development and validation of methods for the determination of phenolic compounds (phenolic acids and flavonoids) in gorse extract using chromatographic and electrophoretic techniques and analysis of some commercial samples of different regions. The second stage was conducted in Spain, having as objective the development and validation of the method using capillary electrophoresis coupled to mass spectrometry (CE-ESI-TOF) using the technique of pressurized liquid extraction (PLE), considered advanced and green . The determination of total phenols and antioxidant activity assays employing Folin and DPPH, respectively was also in Spain held. The development and sample preparation steps included the optimization of the extraction and hydrolysis of phenolic compounds present in the gorse. Quantification was performed by chromatographic techniques employing column with stationary phase C-18 and gradient elution, electrophoretic techniques for buffering medium was used (potassium tetraborate, pH 10) with 10% organic modifier. The methods were validated according to guidelines of ANVISA. Commercial samples were analyzed three states, namely São Paulo, Minas Gerais and Bahia. The sample of Bahia presented the highest level of averaged concentration of phenolic compounds studied, except gallic acid content is greater concentration in the sample of the state of Minas Gerais. Comparing the concentration of these compounds in different samples by determining the content by UHPLC-MS / MS and HPLC-UV at the 5% level of significance, there was no significant difference between the techniques / Doutorado / Quimica Analitica / Doutor em Ciências