A doença de Chagas é causada pelo Trypanosoma cruzi e acomete milhões de pessoas, principalmente as de baixa renda em países subdesenvolvidos. É considerada uma doença negligenciada, não existindo uma terapia eficaz contra os parasitas na fase crônica da doença. Estudos preliminares demonstraram que o ácido ursólico apresenta atividade tripanocida, entretanto, este fármaco possui baixa solubilidade em água, o que prejudica a sua biodisponibilidade. Com o intuito de viabilizar a terapia com ácido ursólico, as nanopartículas poliméricas são sistemas de liberação promissores, devido a sua capacidade de liberação modificada. Além disso, os sistemas nanoencapsulados destacam-se pela alta eficiência de encapsulação do fármaco, proteção contra degradação, e menor possibilidade de causar toxicidade. O objetivo deste trabalho foi o desenvolvimento e a caracterização de nanopartículas de policaprolactona para a veiculação de ácido ursólico, visando à otimização da terapia da Doença de Chagas. O estudo teve início com o desenvolvimento das nanopartículas poliméricas contendo ácido ursólico. A formulação obtida neste estudo pela técnica da nanoprecipitação apresentou menor valor de tamanho de partícula (173,17±4,20) e índice de polidispersividade (0,09±24,77), com perfil monomodal, potencial zeta de -36 mV e eficiência de encapsulação de 94,1±1,31%. O tamanho das partículas observado na microscopia eletrônica de varredura demonstrou ser compatível com os valores observados nas análises de espalhamento dinâmico de luz, embora tenha apresentado uma característica agregada e ligeiramente esférica. Através da determinação do coeficiente de partição do ácido ursólico foi possível avaliar a alta lipofilicidade do ácido ursólico. Na determinação do coeficiente de solubilidade do ácido ursólico, o lauril sulfato de sódio foi o tensoativo de escolha para o estudo in vitro do perfil de liberação, solubilizando aproximadamente 300 ?g.mL-1 de fármaco, mas não foi possível a realização do estudo in vitro do perfil de liberação, devido a sua característica altamente lipofílica. O estudo da citotoxicidade por ensaio de resazurina mostrou que a formulação escolhida não alterou a viabilidade celular de células LLCMK2, portanto sem toxicidade para o meio biológico, bem como evidenciou a capacidade das nanopartículas poliméricas contendo ácido ursólico de reduzir a viabilidade dos parasitas em aproximadamente 50%. A avaliação da atividade biológica do ácido ursólico em camundongo C57BL/6 infectados com a cepa Y do Trypanosoma cruzi apresentou uma redução acentuada (p<0,001) dos tripomastigotas quando comparados ao grupo I, sugerindo uma liberação sustentada do ácido ursólico nesse modelo de nanopartículas poliméricas. Como conclusão, as nanopartículas poliméricas contendo ácido ursólico podem ser propostas como uma abordagem quimioprofilática da doença de Chagas, considerando a necessidade dessa medida de segurança para pacientes que recebem transfusão sanguínea no Sistema Único de Saúde no Brasil. / Chagas disease is caused by parasite Trypanosoma cruzi and affects millions of lowincome in developing countries and because of that it is neglected by the pharmaceutical industry and there is no effective therapy against parasites in the chronic phase of the disease. Preliminary studies showed that ursolic acid presents tripanocidal activity, however, it has low water solubility, which reduces its bioavailability. Among the existing drug delivery systems, polymeric nanoparticles play a central role, due to their ability to sustain or control the release of drugs. Moreover, nanocoated systems are distinguished by high drug encapsulation efficiency, protection from degradation, and less likely to cause irritation. The aim of this work is development and characterization of the polymeric nanoparticles containing ursolic acid, aiming to optimize the treatment of Chagas disease. The study began with the development of polymeric nanoparticles containing ursolic acid. The formulation obtained in this study by the nanoprecipitation technique showed the lowest particle size (173.17 ± 4.20) and polydispersity index (0.09 ± 24.77), with monomodal profile, zeta potential of -36 mV and encapsulation efficiency was 94.1% ± 1.31. The size of the particles observed by scanning electron microscopy showed to be compatible with the values observed in the analysis of dynamic light scattering, although it had an aggregate and slightly spherical characteristic. By determining the coefficient of ursolic acid partition was possible to evaluate the high lipophilicity of ursolic acid. In determining the solubility coefficient of ursolic acid, sodium lauryl sulfate was the surfactant of choice for studying in vitro release profile, solubilizing approximately 300 ?g.mL-1 of the drug, but it has not been possible to conduct the study in vitro release profile, due to its highly lipophilic character. The study of resazurin cytotoxicity assay showed that the formulation did not alter the cell viability of LLCMK2 cells, and therefore, without toxicity to the biological environment and demonstrated the ability of the polymeric nanoparticles containing ursolic acid to reduce the viability of parasites in approximately 50 %. The evaluation of biological activity of ursolic acid in mice C57BL/6 mice infected with the Y strain of Trypanosoma cruzi showed a marked reduction (p<0.001) of trypomastigotes when compared to group I, suggesting a sustained release of ursolic acid in polymeric nanoparticles model. In conclusion, polymeric nanoparticles containing ursolic acid may be proposed as a chemoprophylactic approach of Chagas disease, considering the need for this safety measure for patients receiving blood transfusion Health System in Brazil.

Esta tese alia dois enfoques principais dentro da Química Farmacêutica. Por um lado, busca explorar uma nova fonte de insumos naturais, cascas de Malus  domestica, com vistas a obtenção dos triterpenos ácidos ursólico (AU) e betulínico (AB); e por outro lado, estuda a relação dos derivados triterpênicos semissintéticos obtidos com a proteína-alvo (PfATP6) destacada atualmente na literatura da terapia da malária com vistas ao planejamento de novos antimaláricos. O primeiro Capítulo inclui o desenvolvimento de um método eficiente, fácil e extremamente rápido onde são combinadas as técnicas de extração por ultrassom (UAE) e análise por Cromatografia Líquida de Alta Eficiência Acoplada a Detector de Espectroscopia de Massas (LC-MS), para identificação e doseamento dos ácidos ursólico (AU) e betulínico (BA) em extratos de cascas frescas de maçã de cinco clones das cultivares Gala e Fuji (“Baigent”, “Fuji Mishima”, “Fuji Suprema”, “Fuji Select” and “Maxi Gala”) oriundas da Região Sul do Brasil. Os parâmetros cromatográficos do método analítico incluem: ionização por eletro spray em modo positivo (ESI+), fluxo de 1,0 mL/min, em modo de eluição isocrático, consistindo de 80% acetonitrila e 20% acetato de amônio 10 mM em pH 6,0 e temperatura ambiente. O método desenvolvido foi validado e mostrou ser seletivo, sensível (LOD e LOQ de 0,087 e 0,266 μg/mL para BA, e 0,398 e 2,117 μg/ mL para UA), coeficiente de regressão linear (r >0.99), preciso, exato e robusto para os analitos de interesse. A otimização do método combinado de UAE com LC-MS permitiu concluir os procedimentos de extração e análise em tempo inferior a 4 h, uma vez que o método não requer a secagem da amostra, etapa que demanda longos tempos de processamento. Este método foi aplicado e forneceu a primeira caracterização fitoquímica dos cinco clones de maçã estudados. Os resultados demonstraram que o método combinado de UAE-LC-MS é adequado às práticas do controle de qualidade. O segundo Capítulo apresenta o estudo da interação dos ligantes semissintéticos derivados dos AU e AB, sintetizados pelo nosso grupo de pesquisa, com a proteína Ca2+-ATPase do Plasmodium falciparum (PfATP6), através do emprego da técnica de Docking Molecular. A PfATP6 é descrita como um importante alvo para novos antimaláricos como Artemisinina (ART), cujo mecanismo de ação inclui, dentre outros, a modulação da homeostasia do cálcio intracelular. Investigações conduziram à hipótese do extravasamento do cálcio, do interior do retículo sarco-endoplasmático como mecanismo plausível para ação dos derivados triterpênicos do AU e AB. Os escores de energia determinados no Docking, de cada um dos nove ligantes (derivados triterpênicos) e quatro compostos de controle (ácidos ursólico e betulínico, artemisinina (ART) e tapsigargina (TPG) foram determinados (análises realizadas em triplicata) e correlacionados com os valores de IC50, para a atividade antimalárica. Os resultados mostraram excelente correlação entre os escores de energia (com a PfATP6) e os valores de IC50, superior a 80% (r > 0,83360). O estudo fornece fortes evidências de que a PfATP6 pode constituir um alvo para os derivados pentacíclicos do estudo, bem como permitiu identificar o perfil conformacional dos ligantes e os principais resíduos do sítio de ligação (SL) da PfATP6 envolvidos nas interações; bem como, contribuiu para a melhor compreensão das propriedades envolvidas na interação do ligante com o receptor e mecanismo de ação. O terceiro Capítulo faz uso de Métodos Clássicos e Quânticos para descrever as mudanças conformacionais da proteína PfATP6. As simulações de Dinâmica Molecular do receptor na forma isolada e complexada com os ligantes foram realizadas durante 10 ns. As conformações finais obtidas para os receptores foram avaliadas em termos RMSD, efeito da presença dos ligantes no sítio de ligação e tipos de interações estabelecidas entre o ligante e o receptor. Os resultados mostraram que as proteínas PfATP6 e SERCA tendem a manter sua conformação nativa e que o modelo utilizado é adequado aos propósitos do estudo. O monitoramento dos resíduos da região citoplasmática das proteínas permitiu evidenciar o efeito alostérico da presença dos ligantes AU e ART no SL, sobre os domínios A e N, da PfATP6. Esse efeito reproduz as conformações E1 e E2, bem estabelecidas para PfATP6, na presença e ausência de Ca2+. As análises de Dinâmica Molecular corroboram os achados do Capítulo II ao evidenciarem o estabelecimento de interações de hidrogênio com os resíduos importantes do SL da PfATP6. Esses resultados fundamentam os indícios de que as bombas de Ca2+-ATPase (SERCA), possam ser de fato, um alvo para os derivados triterpênicos dos AU e AB. / This thesis combines two main focuses within Pharmaceutical Chemistry. On the one hand, it seeks to explore a new source of natural inputs, bark of Malus domestica, in order to obtain ursolic (UA) and betulinic acid (BA) triterpenes. On the other hand, it studies the relation of the semi-synthetic triterpenic derivatives obtained with the target proteins (PfATP6), currently highlighted in the literature on malaria therapy with a view to planning new antimalarial drugs. The first chapter includes the development of an efficient, easy and extremely fast method where ultrasonic extraction techniques (UAE) and high-performance liquid chromatography coupled to mass spectroscopy (LC-MS) are combined for identification and assay of ursolic acid (UA) and betulinic acid (BA) in fresh apple peel extracts from five clones of the Gala and Fuji cultivars (Baigent, Fuji Mishima, Fuji Suprema, Fuji Select and Maxi Gala ") in the Southern Region of Brazil. Chromatographic parameters of the analytical method include: electrospray ionization (ESI +), flow rate of 1.0 mL/min in isocratic elution mode, consisting of 80% acetonitrile and 20% 10 mM ammonium acetate at pH 6.0 and room temperature. The method was validated and proved to be selective, sensitive (LOD and LOQ of 0.087 and 0.266 μg/mL for BA, and 0.398 and 2.117 μg/mL for UA), linear regression coefficient (r> 0.99), accurate, robust for analytes of interest. The optimization of the combined method of UAE with LC-MS allowed to complete the procedures of extraction and analysis in less than 4 h, since the method does not require drying the sample, a stage that demands long processing times. This method was applied and provided the first phytochemical characterization of the five apple clones studied. The results demonstrated that the combined UAE-LC-MS method is suitable for quality control practices. The second chapter presents the study of the interaction of the semi-synthetic ligands derived from the UA and BA, synthesized by our research group, with the Plasmodium falciparum Ca2+-ATPase protein (PfATP6), using the Molecular Docking technique. PfATP6 is described as an important target for new antimalarials such as Artemisinin (ART), whose action mechanism includes, among others, the modulation of intracellular calcium homeostasis. Investigations led to the hypothesis of extravasation of calcium from the interior of the sarco-endoplasmic reticulum as a plausible mechanism for the action of the triterpenic derivatives of UA and BA. The Docking energy scores (binding energy) of each of the nine ligands (triterpenic derivatives) and four control compounds (ursolic and betulinic acids, artemisinin (ART) and tapsigargine (TPG)) with PfATP6, were calculated (analyses performed in triplicate) and correlated with its antimalarial IC50 value. The results showed an excellent correlation between energy scores (with PfATP6) and IC50 values, higher than 80% (r > 0.83360). The study supplies strong evidence that PfATP6 may be a target for the pentacyclic derivatives of the study, and also allowed identifying the conformational profile of the ligands and the main residues of the PfATP6 binding site (BS) involved in the interactions. It further contributed to a better understanding of the properties involved in the interaction of the ligand with the receptor and its action mechanism. The third chapter uses Classical and Quantum Methods to describe the conformational changes of the PfATP6 protein. The Molecular Dynamics simulations of the receptor in the isolated and complexed form with the ligands were performed for 10 ns. The final conformations obtained for the receptors were evaluated in RMSD terms, effect of the presence of ligands at the binding site and types of interactions established between the ligand and the receptor. The results showed that the PfATP6 and SERCA proteins tend to maintain their native conformations and that the model used is adequate for the purposes of the study. The monitoring of the residues of the cytoplasmic region of the proteins allowed evidencing the allosteric effect of the presence of UA and ART ligands in BS, on the A- and N-domains of PfATP6. This effect reproduces the well-established E1 and E2 conformations for PfATP6, in the presence and absence of Ca2+, respectively. Molecular Dynamics analyses corroborate the findings of Chapter II, by showing the possibility of establishing hydrogen interactions with the important residues of PfATP6 BS. These results support the evidence that Ca2+-ATPase (SERCA) pumps may be a target for the triterpenic derivatives of UA and BA.

Esta tese alia dois enfoques principais dentro da Química Farmacêutica. Por um lado, busca explorar uma nova fonte de insumos naturais, cascas de Malus  domestica, com vistas a obtenção dos triterpenos ácidos ursólico (AU) e betulínico (AB); e por outro lado, estuda a relação dos derivados triterpênicos semissintéticos obtidos com a proteína-alvo (PfATP6) destacada atualmente na literatura da terapia da malária com vistas ao planejamento de novos antimaláricos. O primeiro Capítulo inclui o desenvolvimento de um método eficiente, fácil e extremamente rápido onde são combinadas as técnicas de extração por ultrassom (UAE) e análise por Cromatografia Líquida de Alta Eficiência Acoplada a Detector de Espectroscopia de Massas (LC-MS), para identificação e doseamento dos ácidos ursólico (AU) e betulínico (BA) em extratos de cascas frescas de maçã de cinco clones das cultivares Gala e Fuji (“Baigent”, “Fuji Mishima”, “Fuji Suprema”, “Fuji Select” and “Maxi Gala”) oriundas da Região Sul do Brasil. Os parâmetros cromatográficos do método analítico incluem: ionização por eletro spray em modo positivo (ESI+), fluxo de 1,0 mL/min, em modo de eluição isocrático, consistindo de 80% acetonitrila e 20% acetato de amônio 10 mM em pH 6,0 e temperatura ambiente. O método desenvolvido foi validado e mostrou ser seletivo, sensível (LOD e LOQ de 0,087 e 0,266 μg/mL para BA, e 0,398 e 2,117 μg/ mL para UA), coeficiente de regressão linear (r >0.99), preciso, exato e robusto para os analitos de interesse. A otimização do método combinado de UAE com LC-MS permitiu concluir os procedimentos de extração e análise em tempo inferior a 4 h, uma vez que o método não requer a secagem da amostra, etapa que demanda longos tempos de processamento. Este método foi aplicado e forneceu a primeira caracterização fitoquímica dos cinco clones de maçã estudados. Os resultados demonstraram que o método combinado de UAE-LC-MS é adequado às práticas do controle de qualidade. O segundo Capítulo apresenta o estudo da interação dos ligantes semissintéticos derivados dos AU e AB, sintetizados pelo nosso grupo de pesquisa, com a proteína Ca2+-ATPase do Plasmodium falciparum (PfATP6), através do emprego da técnica de Docking Molecular. A PfATP6 é descrita como um importante alvo para novos antimaláricos como Artemisinina (ART), cujo mecanismo de ação inclui, dentre outros, a modulação da homeostasia do cálcio intracelular. Investigações conduziram à hipótese do extravasamento do cálcio, do interior do retículo sarco-endoplasmático como mecanismo plausível para ação dos derivados triterpênicos do AU e AB. Os escores de energia determinados no Docking, de cada um dos nove ligantes (derivados triterpênicos) e quatro compostos de controle (ácidos ursólico e betulínico, artemisinina (ART) e tapsigargina (TPG) foram determinados (análises realizadas em triplicata) e correlacionados com os valores de IC50, para a atividade antimalárica. Os resultados mostraram excelente correlação entre os escores de energia (com a PfATP6) e os valores de IC50, superior a 80% (r > 0,83360). O estudo fornece fortes evidências de que a PfATP6 pode constituir um alvo para os derivados pentacíclicos do estudo, bem como permitiu identificar o perfil conformacional dos ligantes e os principais resíduos do sítio de ligação (SL) da PfATP6 envolvidos nas interações; bem como, contribuiu para a melhor compreensão das propriedades envolvidas na interação do ligante com o receptor e mecanismo de ação. O terceiro Capítulo faz uso de Métodos Clássicos e Quânticos para descrever as mudanças conformacionais da proteína PfATP6. As simulações de Dinâmica Molecular do receptor na forma isolada e complexada com os ligantes foram realizadas durante 10 ns. As conformações finais obtidas para os receptores foram avaliadas em termos RMSD, efeito da presença dos ligantes no sítio de ligação e tipos de interações estabelecidas entre o ligante e o receptor. Os resultados mostraram que as proteínas PfATP6 e SERCA tendem a manter sua conformação nativa e que o modelo utilizado é adequado aos propósitos do estudo. O monitoramento dos resíduos da região citoplasmática das proteínas permitiu evidenciar o efeito alostérico da presença dos ligantes AU e ART no SL, sobre os domínios A e N, da PfATP6. Esse efeito reproduz as conformações E1 e E2, bem estabelecidas para PfATP6, na presença e ausência de Ca2+. As análises de Dinâmica Molecular corroboram os achados do Capítulo II ao evidenciarem o estabelecimento de interações de hidrogênio com os resíduos importantes do SL da PfATP6. Esses resultados fundamentam os indícios de que as bombas de Ca2+-ATPase (SERCA), possam ser de fato, um alvo para os derivados triterpênicos dos AU e AB. / This thesis combines two main focuses within Pharmaceutical Chemistry. On the one hand, it seeks to explore a new source of natural inputs, bark of Malus domestica, in order to obtain ursolic (UA) and betulinic acid (BA) triterpenes. On the other hand, it studies the relation of the semi-synthetic triterpenic derivatives obtained with the target proteins (PfATP6), currently highlighted in the literature on malaria therapy with a view to planning new antimalarial drugs. The first chapter includes the development of an efficient, easy and extremely fast method where ultrasonic extraction techniques (UAE) and high-performance liquid chromatography coupled to mass spectroscopy (LC-MS) are combined for identification and assay of ursolic acid (UA) and betulinic acid (BA) in fresh apple peel extracts from five clones of the Gala and Fuji cultivars (Baigent, Fuji Mishima, Fuji Suprema, Fuji Select and Maxi Gala ") in the Southern Region of Brazil. Chromatographic parameters of the analytical method include: electrospray ionization (ESI +), flow rate of 1.0 mL/min in isocratic elution mode, consisting of 80% acetonitrile and 20% 10 mM ammonium acetate at pH 6.0 and room temperature. The method was validated and proved to be selective, sensitive (LOD and LOQ of 0.087 and 0.266 μg/mL for BA, and 0.398 and 2.117 μg/mL for UA), linear regression coefficient (r> 0.99), accurate, robust for analytes of interest. The optimization of the combined method of UAE with LC-MS allowed to complete the procedures of extraction and analysis in less than 4 h, since the method does not require drying the sample, a stage that demands long processing times. This method was applied and provided the first phytochemical characterization of the five apple clones studied. The results demonstrated that the combined UAE-LC-MS method is suitable for quality control practices. The second chapter presents the study of the interaction of the semi-synthetic ligands derived from the UA and BA, synthesized by our research group, with the Plasmodium falciparum Ca2+-ATPase protein (PfATP6), using the Molecular Docking technique. PfATP6 is described as an important target for new antimalarials such as Artemisinin (ART), whose action mechanism includes, among others, the modulation of intracellular calcium homeostasis. Investigations led to the hypothesis of extravasation of calcium from the interior of the sarco-endoplasmic reticulum as a plausible mechanism for the action of the triterpenic derivatives of UA and BA. The Docking energy scores (binding energy) of each of the nine ligands (triterpenic derivatives) and four control compounds (ursolic and betulinic acids, artemisinin (ART) and tapsigargine (TPG)) with PfATP6, were calculated (analyses performed in triplicate) and correlated with its antimalarial IC50 value. The results showed an excellent correlation between energy scores (with PfATP6) and IC50 values, higher than 80% (r > 0.83360). The study supplies strong evidence that PfATP6 may be a target for the pentacyclic derivatives of the study, and also allowed identifying the conformational profile of the ligands and the main residues of the PfATP6 binding site (BS) involved in the interactions. It further contributed to a better understanding of the properties involved in the interaction of the ligand with the receptor and its action mechanism. The third chapter uses Classical and Quantum Methods to describe the conformational changes of the PfATP6 protein. The Molecular Dynamics simulations of the receptor in the isolated and complexed form with the ligands were performed for 10 ns. The final conformations obtained for the receptors were evaluated in RMSD terms, effect of the presence of ligands at the binding site and types of interactions established between the ligand and the receptor. The results showed that the PfATP6 and SERCA proteins tend to maintain their native conformations and that the model used is adequate for the purposes of the study. The monitoring of the residues of the cytoplasmic region of the proteins allowed evidencing the allosteric effect of the presence of UA and ART ligands in BS, on the A- and N-domains of PfATP6. This effect reproduces the well-established E1 and E2 conformations for PfATP6, in the presence and absence of Ca2+, respectively. Molecular Dynamics analyses corroborate the findings of Chapter II, by showing the possibility of establishing hydrogen interactions with the important residues of PfATP6 BS. These results support the evidence that Ca2+-ATPase (SERCA) pumps may be a target for the triterpenic derivatives of UA and BA.

A doença de Chagas é causada pelo Trypanosoma cruzi e acomete milhões de pessoas, principalmente as de baixa renda em países subdesenvolvidos. É considerada uma doença negligenciada, não existindo uma terapia eficaz contra os parasitas na fase crônica da doença. Estudos preliminares demonstraram que o ácido ursólico apresenta atividade tripanocida, entretanto, este fármaco possui baixa solubilidade em água, o que prejudica a sua biodisponibilidade. Com o intuito de viabilizar a terapia com ácido ursólico, as nanopartículas poliméricas são sistemas de liberação promissores, devido a sua capacidade de liberação modificada. Além disso, os sistemas nanoencapsulados destacam-se pela alta eficiência de encapsulação do fármaco, proteção contra degradação, e menor possibilidade de causar toxicidade. O objetivo deste trabalho foi o desenvolvimento e a caracterização de nanopartículas de policaprolactona para a veiculação de ácido ursólico, visando à otimização da terapia da Doença de Chagas. O estudo teve início com o desenvolvimento das nanopartículas poliméricas contendo ácido ursólico. A formulação obtida neste estudo pela técnica da nanoprecipitação apresentou menor valor de tamanho de partícula (173,17±4,20) e índice de polidispersividade (0,09±24,77), com perfil monomodal, potencial zeta de -36 mV e eficiência de encapsulação de 94,1±1,31%. O tamanho das partículas observado na microscopia eletrônica de varredura demonstrou ser compatível com os valores observados nas análises de espalhamento dinâmico de luz, embora tenha apresentado uma característica agregada e ligeiramente esférica. Através da determinação do coeficiente de partição do ácido ursólico foi possível avaliar a alta lipofilicidade do ácido ursólico. Na determinação do coeficiente de solubilidade do ácido ursólico, o lauril sulfato de sódio foi o tensoativo de escolha para o estudo in vitro do perfil de liberação, solubilizando aproximadamente 300 ?g.mL-1 de fármaco, mas não foi possível a realização do estudo in vitro do perfil de liberação, devido a sua característica altamente lipofílica. O estudo da citotoxicidade por ensaio de resazurina mostrou que a formulação escolhida não alterou a viabilidade celular de células LLCMK2, portanto sem toxicidade para o meio biológico, bem como evidenciou a capacidade das nanopartículas poliméricas contendo ácido ursólico de reduzir a viabilidade dos parasitas em aproximadamente 50%. A avaliação da atividade biológica do ácido ursólico em camundongo C57BL/6 infectados com a cepa Y do Trypanosoma cruzi apresentou uma redução acentuada (p<0,001) dos tripomastigotas quando comparados ao grupo I, sugerindo uma liberação sustentada do ácido ursólico nesse modelo de nanopartículas poliméricas. Como conclusão, as nanopartículas poliméricas contendo ácido ursólico podem ser propostas como uma abordagem quimioprofilática da doença de Chagas, considerando a necessidade dessa medida de segurança para pacientes que recebem transfusão sanguínea no Sistema Único de Saúde no Brasil. / Chagas disease is caused by parasite Trypanosoma cruzi and affects millions of lowincome in developing countries and because of that it is neglected by the pharmaceutical industry and there is no effective therapy against parasites in the chronic phase of the disease. Preliminary studies showed that ursolic acid presents tripanocidal activity, however, it has low water solubility, which reduces its bioavailability. Among the existing drug delivery systems, polymeric nanoparticles play a central role, due to their ability to sustain or control the release of drugs. Moreover, nanocoated systems are distinguished by high drug encapsulation efficiency, protection from degradation, and less likely to cause irritation. The aim of this work is development and characterization of the polymeric nanoparticles containing ursolic acid, aiming to optimize the treatment of Chagas disease. The study began with the development of polymeric nanoparticles containing ursolic acid. The formulation obtained in this study by the nanoprecipitation technique showed the lowest particle size (173.17 ± 4.20) and polydispersity index (0.09 ± 24.77), with monomodal profile, zeta potential of -36 mV and encapsulation efficiency was 94.1% ± 1.31. The size of the particles observed by scanning electron microscopy showed to be compatible with the values observed in the analysis of dynamic light scattering, although it had an aggregate and slightly spherical characteristic. By determining the coefficient of ursolic acid partition was possible to evaluate the high lipophilicity of ursolic acid. In determining the solubility coefficient of ursolic acid, sodium lauryl sulfate was the surfactant of choice for studying in vitro release profile, solubilizing approximately 300 ?g.mL-1 of the drug, but it has not been possible to conduct the study in vitro release profile, due to its highly lipophilic character. The study of resazurin cytotoxicity assay showed that the formulation did not alter the cell viability of LLCMK2 cells, and therefore, without toxicity to the biological environment and demonstrated the ability of the polymeric nanoparticles containing ursolic acid to reduce the viability of parasites in approximately 50 %. The evaluation of biological activity of ursolic acid in mice C57BL/6 mice infected with the Y strain of Trypanosoma cruzi showed a marked reduction (p<0.001) of trypomastigotes when compared to group I, suggesting a sustained release of ursolic acid in polymeric nanoparticles model. In conclusion, polymeric nanoparticles containing ursolic acid may be proposed as a chemoprophylactic approach of Chagas disease, considering the need for this safety measure for patients receiving blood transfusion Health System in Brazil.

Toxoplasma gondii é um protozoário pertencente ao filo Apicomplexa, de distribuição mundial, e que infecta diversas espécies hospedeiros, como mamíferos e aves, possuindo como hospedeiros definitivos o gato e outros felídeos, enquanto o homem e outros animais são os seus hospedeiros intermediários. O tratamento é feito, na maioria das vezes, com uma combinação de sulfadiazina e pirimetamina, agindo na via metabólica do ácido fólico, o qual é necessário para a biossíntese de purinas, pirimidinas e certos aminoácidos. Propusemos estabelecer um protocolo de avaliação sobre esse protozoário, assim como padronizarmos uma metodologia por espectroscopia para uma rápida avaliação ou triagem de substâncias potencialmente ativas contra o parasito. Verificamos a atividade das substâncias ácido ursólico e ácido oleanóico, as quais já demonstraram atividade biológica sobre outras espécies de protozoários, como Plasmodium, Trypanosoma cruzi e Leishmania sp. em sistemas in vitro e in vivo. A metodologia colorimétrica pelo MTT, pelo Alamar Blue®, do kit CyQUANT® NF e a contagem manual em meio líquido das formas taquizoítas do parasito em ensaios biológicos in vitro mostram-se inviáveis, pois há grande dificuldade em manter a integridade do parasita em meio de cultura líquido, o qual se mostra sensível à adição de qualquer outro componente que não aqueles necessários para manter sua viabilidade em ambiente extracelular. O ácido ursólico mostrou-se potencialmente ativo in vitro sobre formas intracelulares de T. gondii. Entretanto, o contato de células infectadas com as substâncias avaliadas por um período de 48 horas não resultou em diminuição mais acentuada na porcentagem de células infectadas do que a ocorrida no tratamento de 24 horas. A comparação dos resultados do tratamento pós infecção celular por 24 horas e do pré-tratamento das formas taquizoítas houve diferenças significativas, indicando principalmente maior ação do pré-tratamento sobre T. gondii. Quando administrado na dose de 7 mg/kg/ dia a camundongos infectados, o ácido ursólico não apresentou atividade sobre o parasita. / Toxoplasma gondii is an Apicomplexa protozoan, of worldwide distribution, that infects several species, from mammalians to birds; its definitive hosts are the cats and other felines, while man and other animals are considered as intermediate hosts. Treatment is, generally, a combination of sulfadiazine and pyrimethamine, triggering the metabolic pathway of folic acid, which is necessary for certain purines, pirimidines and aminoacids biosynthesis. We have proposed an evaluation protocol on this protozoan, and also to establish a methodology by spectroscopy for rapid evaluation of pottentialy bioactive substances against the parasite. The ursolic acid and oleanoic acid bioactivity were tested. These substances have already demonstrated to be effective on another protozoan species, like Plasmodium, Trypanosoma cruzi e Leishmania sp., either in vitro or in vivo. The colorimetric methodology by MTT, Alamar Blue®, CyQUANT® NF kit and manual counting of tachyzoite forms in liquid culture medium showed to be unviable, because there is a great difficult to maintain the parasite viability in liquid culture medium, wich one is sensible to addition of any other component different of that necessary for its survival in extracelular ambient. Ursolic acid was pottentialy active on T. gondii intracellular forms. However, the infected cells in contact with the tested substances for a period of 48 hours did not show a statistical greater reduction as compared to infected cells which underwent treatment for 24 hours. Significant results were observed when comparing pre-treatment of tachyzoite forms and treatment for 24 hours post-cellular infection. Our data pointed in the direction that pre-treatment exerted a higher effectiveness. Any parasiticidal activity was observed when ursolic acid on a concentration of 7 mg/kg/day was administered to infected mice.

A doença de Chagas é um problema de saúde pública, com dados preocupantes referentes ao número de pessoas contaminadas e daquelas que ainda permanecem expostas ao risco de infecção. A dificuldade do combate a Trypanosoma cruzi, agente etiológico da doença, está intimamente relacionada às interações existentes entre o parasito e o hospedeiro, sendo que até o momento, nenhum medicamento ou substância tem demonstrado real eficácia ao combate ao parasito. Em estudos recentes realizados por nosso grupo de pesquisa, os ácidos ursólico e oleanólico demonstraram um bom potencial tripanocida, além de um efeito imunomodulatório, promovendo a inibição da produção de IFN-? quando de suas utilizações por via intraperitoneal em elevadas concentrações. Considerando essas evidências encontradas em relação a essas substâncias e os efeitos promovidos no processo de avaliação biológica, propusemos como objetivo avaliar o potencial terapêutico dos triterpenos ácido ursólico e ácido oleanólico na fase crônica da infecção chagásica e suas associações ao benzonidazol, fármaco referência indicado ao tratamento da parasitose, verificando a possibilidade de geração de benefícios sobre a patogênese da infecção crônica experimental. A quantificação de linfócitos T CD4+ e T CD8+, e das citocinas IL-2, IL-10, IL-12, IFN-? e TNF-??pela técnica de citometria de fluxo, utilizando o kit BD Cytometric Bead Array®, indicaram que essas substâncias não apresentam efeitos imunomodulatórios significativos sobre a resposta Th1 e Th2 nessa fase da doença, na comparação entre grupos infectados e tratados e aquele que recebeu apenas solvente. O parasitismo tecidual determinado por Real Time PCR e as observações realizadas em cortes histológicos, mostraram, respectivamente, baixo número de cópias de DNA de T. cruzi, e ausência de ninhos amastigotas, porém, com marcante presença de infiltrado inflamatório em todos os grupos. Assim, os dados obtidos levam à conclusão de que apesar da atividade apresentada pelos triterpenos ácidos em estudo na fase aguda da doença de Chagas, o mesmo não ocorre na fase crônica, como seria desejável para favorecer uma melhora do quadro patológico, mesmo não havendo a cura da doença, considerando as conseqüências da infecção de longo prazo. / Chagas disease is a public health problem, with disturbing data about the number of infected people and those who remain at risk of infection. The difficulty of eliminating Trypanosoma cruzi, etiologic agent of the disease is closely related to the interactions between the parasite and the host, and until now, no medicine or substance has demonstrated real effectiveness against the parasite. In recent studies by our research group, the ursolic and oleanolic acids revealed considerable trypanocidal activity, and an immunomodulatory effect, promoting the inhibition of IFN-? with intraperitoneal administration in high concentrations. Considering these evidences and the effects observed during the biological evaluation, our objective was to evaluate the biological potential of the triterpenoids ursolic acid and oleanolic acid in the chronic phase of chagasic infection and their associations to benznidazole, the reference drug indicated for the treatment of this disease, verifying the possibility of benefits on the pathogenesis of experimental chronic infection. Quantification of T CD4+ and T CD8+ cells and of the cytokines IL-2, IL-10, IL-12, IFN-? and TNF-? by flow cytometry using the kit BD cytometric Bead Array®, indicated that these substances do not exhibit significant immunomodulatory effects on Th1 and Th2 responses in this stage of the disease, comparing infected and treated groups and that who received only solvent. The tissue parasitism determined by Real Time PCR and in histological observations showed, respectively, low copy number of T. cruzi DNA, and absence of amastigote nests, however, with marked inflammatory infiltration in all groups. Thus, our data lead to the conclusion that despite the activity presented by the triterpene acids studied in the acute phase of Chagas disease, the same does not occur in the chronic phase, as would be desirable to the reduction of the pathological conditions, even if there is no cure of the disease, considering the consequences of long term infection.

In part one, betulinic acid (1) was isolated from the American Sycamore (Platanus occidentalis) in 1.6% yield, while ursolic acid (3) was isolated from Fuji and McIntosh apple peels in 1.0% and 0.8% crude yields, respectively. Oleanolic (4) and dehydrocanophyllic (6) acids were previously available, along with several analogs. Additional analogs of 1, 3 and 4 were prepared, including 9 new compounds, for a total of 51 compounds. Compounds were initially screened for cortisol lowering properties in vitro using a fish head kidney cell assay. Platanic acid (43) was selected for in vivo study in rats, along with 1 and a blend of Platanus occidentalis and Souroubea sympetela. No significant cortisol lowering was observed in vivo. In part two, β-ionone-d6 (75) was synthesized in 6.5% yield from ethyl 2-oxo-cyclohexane carboxylate (77). Total deuterium incorporation was 99.85%, with 0.03% d0 analog. 75 was converted to retinoic acid-d6 (93) in 2.2% yield.

Since ancient times, natural products are used as source of medicines to prevent and treat disease. Currently, high cost and time taken for analysis of natural products have been significantly reduced by the use of modern approaches such as chemometric analysis, which gives flexibility to the process of development of new products. This study aimed to chemometric analysis of the ethanol extract, fraction in chloroform and subfractions of the crude extract of leaves Zeyheria tuberculosa (Veil) Bureau (Bignoniaceae), for Nuclear Magnetic Resonance, with the characterization and quantification of the major compounds present in these, as well as construction of a model to select potentially promising extracts, serving as a guide for further isolation of the substances of interest, enabling the discovery of bioactive compounds. The fraction in chloroform which concentrated almost all the ethanol extract metabolites, showed 100% inhibitory activity lymphocyte proliferation at a concentration of 100 gg.m1:1, and is therefore chosen for characterization and quantification of the major compounds present. The NMR spectral analysis of the fraction in chloroform, including 1D experiments (1H, 13C, DEPT 90 °, DEPT135 °) and 2D (J-Resolved, HSQC and HMBC) allowed the detailed structural elucidation of two major compounds, ursolic and oleanolic acids, both identified for the first time in this species. Due to the importance of these acids in the treatment of skin diseases and various cancers, measurements were determined for these triterpenes in ethanol extract (ZTB), fraction in chloroform (ZTP2) and the subfractions, using techniques for this purpose NMR and chemometric tools (Matlab programs, AMIX and SIMCA). All spectra were processed and analyzed using the program topspin (BRUKER). The qualitative and quantitative results of the chemometrics analysis for NMR of the ethanol extract, fraction in chloroform and subfractions of Zeyheria tuberculosa showed that fractions ZTF3 (evaluated in MTT as being non-cytotoxic at concentrations of 10, 50 and 100 pg.mL-1) and ZTF6 (measured in MTT as being non-cytotoxic at the concentration of 10 pg.mL-1 and cytotoxic at concentrations of 50 and 100 pg.mL-1) are the richest of oleanolic and ursolic acids, respectively, and so are more promising for the isolation of these triterpenes. The fraction ZTF4 was second richer fraction both as oleanolic acid and ursolic acid, the most promising for the isolation of these two acids together, also considering that this fraction was evaluated in MTT as non-cytotoxic at concentrations of 10 and 50 g .mL-1, and only the cytotoxic concentration of 100 pg.mL-1. The ursolic and oleanolic acids have a range of therapeutic properties and a high commercial value, being highly relevant the qualitative and quantitative results obtained in this study, referring to these triterpenes found in the leaves of the species Zeyheria tuberculosa. The model proposed in this work was efficient, as indicated by the values of the Q parameter, and suitable for the classification of samples into groups and subgroups according to the presence of ursolic and oleanolic acids (chemical composition) and the concentration of these in the samples, and it may be useful in the identification of potentially promising extracts, serving as a guide for subsequent isolation of the substance of interest. / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Desde os tempos antigos, os produtos naturais são utilizados como fonte de medicamentos, para prevenir e tratar doenças. Atualmente, o alto custo e o tempo despendido para as análises de produtos naturais têm sido significativamente reduzidos pelo uso de abordagens modernas, como a análise quimiométrica, que dão agilidade ao processo de desenvolvimento de novos produtos. Este trabalho teve como objetivo a análise quimiométrica do extrato etanólico, da fração em clorofórmio e subfrações do extrato bruto das folhas de Zeyheria tuberculosa (Vell) Bureau (Bignoniaceae), por Ressonância Magnética Nuclear, com a caracterização e quantificação dos compostos majoritários presentes nestes, além da construção de um modelo capaz de selecionar extratos potencialmente promissores, servindo como guia para um posterior isolamento das substâncias de interesse, viabilizando a descoberta de compostos bioativos. A fração em clorofórmio que concentrou a quase totalidade dos metabólitos do extrato bruto, apresentou 100 % de atividade inibitória da linfoproliferação, sendo por isso escolhida para caracterização e quantificação dos compostos majoritários presentes. A análise espectral de RMN da fração em clorofórmio, incluindo experimentos 1D (1H, 13C, DEPT 90°, DEPT 135°) e 2D (J-Resolvido, HSQC e HMBC) permitiu a elucidação estrutural detalhada de dois compostos majoritários, os Ácidos Ursólico e Oleanólico, ambos identificados pela primeira vez nesta espécie. Devido à importância desses ácidos no tratamento de doenças da pele e vários tipos de câncer, foram determinadas as quantificações relativas destes triterpenos no extrato bruto (ZTB), na fração em clorofórmio (ZTP2) e nas subfrações, utilizando-se para este fim técnicas de RMN e ferramentas quimiométricas (programas Matlab, AMIX e SIMCA). Todos os espectros foram processados e analisados utilizando o programa TOPSPIN (BRUKER). Os resultados quantitativos e qualitativos da análise quimiométrica por RMN do extrato bruto, fração clorofórmica e subfrações de Z. tuberculosa mostraram que as frações ZTF3 (avaliada no teste MTT como sendo átoxica nas concentrações de 10, 50 e 100 pg.mL-1) e ZTF6 (avaliada no teste MTT como sendo atóxica na concentração de 10 pg.mL-1 e citotóxica nas concentrações de 50 e 100 pg.mL-1) são as mais ricas dos ácidos oleanólico e ursólico, respectivamente, e por isso são as mais promissoras para o isolamento destes triterpenos. Já a fração ZTF4 foi a segunda fração mais rica tanto em ácido ursólico como em ácido oleanólico, sendo a mais promissora para o isolamento destes dois ácidos juntos, considerando ainda que esta fração foi avaliada no teste MTT como atóxica nas concentrações de 10 e 50 pg.mL-1, e citotóxica apenas na concentração de 100 pg.mL-1. Os ácidos ursólico e oleanólico possuem uma gama de propriedades terapêuticas e um alto valor comercial, sendo de grande relevância os resultados qualitativos e quantitativos, obtidos neste trabalho, referentes a esses triterpenos encontrados nas folhas da espécie Zeyheria tuberculosa. O modelo proposto neste trabalho foi eficiente, conforme indicado pelos valores do parâmetro Q, e satisfatório para a classificação das amostras em grupos e subgrupos, segundo a presença dos ácidos ursólico e oleanólico (composição química) e a concentração destes nas amostras, podendo ser de grande utilidade na identificação de extratos potencialmente promissores, servindo como guia para um posterior isolamento da(s) substância(s) de interesse.

A doença de Chagas é um problema de saúde pública, com dados preocupantes referentes ao número de pessoas contaminadas e daquelas que ainda permanecem expostas ao risco de infecção. A dificuldade do combate a Trypanosoma cruzi, agente etiológico da doença, está intimamente relacionada às interações existentes entre o parasito e o hospedeiro, sendo que até o momento, nenhum medicamento ou substância tem demonstrado real eficácia ao combate ao parasito. Em estudos recentes realizados por nosso grupo de pesquisa, os ácidos ursólico e oleanólico demonstraram um bom potencial tripanocida, além de um efeito imunomodulatório, promovendo a inibição da produção de IFN-? quando de suas utilizações por via intraperitoneal em elevadas concentrações. Considerando essas evidências encontradas em relação a essas substâncias e os efeitos promovidos no processo de avaliação biológica, propusemos como objetivo avaliar o potencial terapêutico dos triterpenos ácido ursólico e ácido oleanólico na fase crônica da infecção chagásica e suas associações ao benzonidazol, fármaco referência indicado ao tratamento da parasitose, verificando a possibilidade de geração de benefícios sobre a patogênese da infecção crônica experimental. A quantificação de linfócitos T CD4+ e T CD8+, e das citocinas IL-2, IL-10, IL-12, IFN-? e TNF-??pela técnica de citometria de fluxo, utilizando o kit BD Cytometric Bead Array®, indicaram que essas substâncias não apresentam efeitos imunomodulatórios significativos sobre a resposta Th1 e Th2 nessa fase da doença, na comparação entre grupos infectados e tratados e aquele que recebeu apenas solvente. O parasitismo tecidual determinado por Real Time PCR e as observações realizadas em cortes histológicos, mostraram, respectivamente, baixo número de cópias de DNA de T. cruzi, e ausência de ninhos amastigotas, porém, com marcante presença de infiltrado inflamatório em todos os grupos. Assim, os dados obtidos levam à conclusão de que apesar da atividade apresentada pelos triterpenos ácidos em estudo na fase aguda da doença de Chagas, o mesmo não ocorre na fase crônica, como seria desejável para favorecer uma melhora do quadro patológico, mesmo não havendo a cura da doença, considerando as conseqüências da infecção de longo prazo. / Chagas disease is a public health problem, with disturbing data about the number of infected people and those who remain at risk of infection. The difficulty of eliminating Trypanosoma cruzi, etiologic agent of the disease is closely related to the interactions between the parasite and the host, and until now, no medicine or substance has demonstrated real effectiveness against the parasite. In recent studies by our research group, the ursolic and oleanolic acids revealed considerable trypanocidal activity, and an immunomodulatory effect, promoting the inhibition of IFN-? with intraperitoneal administration in high concentrations. Considering these evidences and the effects observed during the biological evaluation, our objective was to evaluate the biological potential of the triterpenoids ursolic acid and oleanolic acid in the chronic phase of chagasic infection and their associations to benznidazole, the reference drug indicated for the treatment of this disease, verifying the possibility of benefits on the pathogenesis of experimental chronic infection. Quantification of T CD4+ and T CD8+ cells and of the cytokines IL-2, IL-10, IL-12, IFN-? and TNF-? by flow cytometry using the kit BD cytometric Bead Array®, indicated that these substances do not exhibit significant immunomodulatory effects on Th1 and Th2 responses in this stage of the disease, comparing infected and treated groups and that who received only solvent. The tissue parasitism determined by Real Time PCR and in histological observations showed, respectively, low copy number of T. cruzi DNA, and absence of amastigote nests, however, with marked inflammatory infiltration in all groups. Thus, our data lead to the conclusion that despite the activity presented by the triterpene acids studied in the acute phase of Chagas disease, the same does not occur in the chronic phase, as would be desirable to the reduction of the pathological conditions, even if there is no cure of the disease, considering the consequences of long term infection.

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Estudos preliminares relataram que a planta apresenta atividade antimicrobiana, leishmanicida e antioxidante, e tem como principais constituintes alcaloides, quinonas, flavonoides, terpenos e esteroides. Com o intuito de dar continuidade aos estudos envolvendo esta espécie, este trabalho teve como objetivos avaliar sua toxidade e seu potencial farmacológico, bem como e isolar e caracterizar suas substâncias bioativas. Do extrato metanólico das partes aéreas de M. frigidus (MFM) foram isolados os triterpenos ácido ursólico e ursolato de metila, e a naftoquinona psicorubrina. Os flavonoides rutina e campferol também foram identificados. Utilizando essas substâncias como marcadores, MFM foi padronizado e avaliado para as atividades esquistossomicida, anti-inflamatória, laxativa e citotóxica. Além disso, sua toxidade aguda (DL50) e subcrônica foram avaliadas. O potencial biológico e a composição química do extrato em hexano e do óleo essencial da espécie também foram analisados. MFM apresentou atividade esquistossomicida tanto in vitro quanto in vivo com considerável redução da carga parasitária. Também foi observada atividade anti-inflamatória aguda e crônica para os modelos testados, sendo a resposta aguda mais expressiva. MFM inibiu o processo de migração celular mediado pela inflamação e também diminuiu o processo oxidativo do organismo, evidenciado pela baixa concentração de MDA, catalase e mieloperoxidase. Em relação à expressão de ciclooxigenases, MFM inibiu COX-2. Atividade citotóxica contra células leucêmicas, HL60 e Jurkat, sem indução de apoptose também foi observada. Além disso, MFM induziu aumento do peristaltismo intestinal e da produção de fezes, o que pode estar relacionado com a presença de antraquinonas identificadas em MFM. A partir do estudo toxicológico agudo e subcrônico de MFM foi possível verificar que a planta tem baixa toxidade (DL50 > 2000 mg/Kg) e que não provocou alterações bioquímicas e hematológicas durante 42 dias de experimento. As substâncias ácido ursólico, ursolato de metila e psicorubrina, isoladas de MFM, apresentaram atividade citotóxica para células tumorais e para diferentes espécies de Leishmania. Da mesma forma, o extrato em hexano apresentou atividade antimicrobiana e leishmanicida, com especificidade e seletividade para formas intracelulares (amastigotas). O óleo essencial apresentou atividade antifúngica e leishmanicida. Linalol e acetato de eugenol foram identificados como as substâncias majoritárias. A partir deste trabalho, foi possível concluir que a espécie M. frigidus, que não possui relatos de uso na medicina popular, pode ser uma fonte alternativa de estudos para o tratamento de diversas doenças, como as provocadas por fungos, bactérias e parasitas, além de patologias relacionadas a processos inflamatórios. / Mitracarpus frigidus (Willd. ex Schult Reem.) K. Schum. (Rubiaceae) is a native species, widely distributed throughout the Brazilian territory, with few reports in the literature on its chemical-biological potential. Previous studies reported that the plant has antimicrobial, antioxidant and leishmanicidal, and that its main constituents are alkaloids, quinones, flavonoids, terpenes and steroids. In order to continue the studies involving this species, this work aimed to evaluate its toxicity and pharmacological potential, as well as to isolate and characterize its bioactive compounds. From the methanolic extract of the aerial parts of M. frigidus (MFM) the triterpenes ursolic acid and methyl ursolate, and the naphthoquinone psycorubrin were isolated. The flavonoids rutin and kaempferol were also identified. Using these compounds as markers, MFM was standardized and evaluated for schistosomicidal, anti-inflammatory, laxative and cytotoxic activity. Moreover, its acute (LD50) and subchronic toxicity were evaluated. The biological potential and chemical composition of the hexane extract and the essential oil of this species were also analyzed. MFM showed both in vitro and in vivo schistosomicidal activity with considerable reduction in parasite burden. Antiinflammatory activity was also observed for the acute and chronic models tested, with a more proeminent acute response. Those results demonstrated that MFM inhibited the inflammation cell mediated migration and also decreased the oxidative process of the organism, as evidenced by the observed low concentration of MDA, catalase and myeloperoxidase. Regarding the expression of cyclooxygenase, MFM inhibited COX 2. Cytotoxic activity against leukemia cells, HL60 and Jurkat, without apoptosis induction was also observed. Furthermore, MFM induced increase of intestinal peristalsis and production of faeces, which can be related to the presence of the anthraquinones identified in MFM. From the acute and subchronic toxicity study of MFM it was possible to verify that the plant has low toxicity (LD50 > 2000 mg/kg) and caused no hematological and biochemical changes during 42 days of experiment. The compounds ursolic acid, methyl ursolate and psycorubrin, isolated from MFM, showed cytotoxicity against different tumor cells and species of Leishmania. Likewise, the hexane extract showed antibacterial and antileishmanial properties, with specificity and selectivity for intracellular forms (amastigotes). The essential oil showed antifungal and leishmanicidal activity. Linalool and eugenol acetate were identified as its major compounds. In conclusion, the species M. frigidus, which has no reports on its use in traditional medicine, could be an alternative source of study for the treatment of various diseases such as those caused by fungi, bacteria and parasites, and pathologies related to inflammatory processes.