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Thesis (Ph. D.)--University of Washington, 1999. / Vita. Includes bibliographical references (leaves 83-108).

Submitted by Ana Maria Fiscina Sampaio (fiscina@bahia.fiocruz.br) on 2014-11-17T19:30:12Z No. of bitstreams: 1 Alene Vanessa Azevedo dos Santos. Reacoes de oxido reducao como alvo de quimioterapia triconomicida.pdf: 13103565 bytes, checksum: ad5cc355a7ef3d05b87bd59e85b6f9e0 (MD5) / Made available in DSpace on 2014-11-17T19:30:12Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Alene Vanessa Azevedo dos Santos. Reacoes de oxido reducao como alvo de quimioterapia triconomicida.pdf: 13103565 bytes, checksum: ad5cc355a7ef3d05b87bd59e85b6f9e0 (MD5) Previous issue date: 2008 / Fundação Oswaldo Cruz. Centro de Pesquisa Gonçalo Moniz. Salvador, BA, Brasil / Trichomonas vaginalis e Tritrichomonas foetus são os agentes etiológicos da tricomoníase humana e bovina, respectivamente. A primeira é uma parasitose de grande importância em saúde pública, sendo a principal doença sexualmente transmissível não viral e a segunda ocasiona extensos prejuízos econômicos na pecuária. A tricomoníase humana pode promover a incidência de câncer de colo de útero e a transmissão do HIV. Na infestação humana a droga de escolha é o metronidazol, mas não há um composto eficiente para o tratamento de bovinos. Como este fármaco é usado para outras parasitoses e infecções bacterianas desde a década de 60, tem sido documentado o surgimento de casos refratários e cepas resistentes. Além disso, o fármaco pode ter efeitos mutagênicos e carcinogênicos. Assim sendo a busca por novos compostos tricomonicidas constitui uma demanda premente. No presente estudo foram avaliados os efeitos do dietilditiocarbamato de sódio (DETC) sobre os protozoários parasitas T. vaginalis e T. foetus. Observamos que a adição de DETC inibiu significativamente a proliferação de T. vaginalis, produzindo uma IC50 de 269,7nM, enquanto o metronidazol teve uma IC50 de 523,1nM. Em T. foetus os valores de IC50 foram semelhantes, sendo 497,8 e 459,7nM para o DETC e para o metronidazol, respectivamente. Estes compostos não afetaram significativamente a incorporação de [3H]timidina por esplenócitos murinos em concentrações de até 1000M. A atividade mitocondrial de macrófagos peritoneais murinos também não foi afetada por DETC, mesmo em 200μM, sugerindo seletividade no modo de ação. Objetivando determinar a existência de sinergismo entre DETC e metronidazol, foram determinados os valores de FIC (concentração inibitória fracionada) para os dois protozoários. Os valores de FIC foram 0,3 e 0,7 para T. vaginalis e T. foetus, respectivamente. Esta observação indica que ocorre a interação sinergística no protozoário parasita de humanos. A fim de determinar se a incubação com DETC poderia afetar a expressão de grupos sulfidrila dos parasitos empregamos a reação de Ellman para dosar os grupamentos tiol totais de T. vaginalis antes e após a adição do composto. Observamos que o tratamento com DETC por 24h significativamente (p<0,01) reduziu a concentração de grupos tióis do parasito. A detecção de tióis livres pela sonda fluorescente orto-phthalaldeído (OPA) em T. foetus sugere a participação de sulfidrilas no mecanismo de ação do DETC, uma vez que este reduz marcadamente a marcação dos parasitos pelo OPA, mas este efeito foi revertido pela pré-incubação com cisteína. Vale salientar que o aminoácido reverte, ainda, os efeitos do composto na proliferação parasitária. A mensuração de radicais livres por quimioluminescência amplificada pelo luminol indicou que a geração de espécies reativas de oxigênio foi significativamente (p <0,05) aumentada por DETC em T. vaginalis, mas não em T. foetus. O estresse oxidativo sobre os parasitas foi avaliado pela medida de substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBARs). Observou-se que a combinação metronidazol-DETC significativamente aumenta a peroxidação lipídica em T. vaginalis (p <0,01) e T. foetus (p <0,05). A análise ultraestrutural por microscopia eletrônica de transmissão revelou que tanto DETC quanto o metronidazol produziram danos hidrogenossomais e desencadearam autofagia e esses efeitos foram mais acentuadas no parasitas incubados com a combinação de drogas. Tomados em conjunto, estes dados sugerem que a combinação metronidazol-DETC pode fornecer novas ferramentas para a efetiva quimioterapia da tricomoníase / Trichomonas vaginalis e Tritrichomonas foetus are the etiologic agents of the human and bovine trichomoniasis, respectively. The former is a parasitic disease of great relevance in public health – the major non-viral sexually-transmitted disease, whereas the latter causes remarkable losses in livestock productivity. Human trichomoniasis can promote the incidence of cervical cancer and HIV transmission. In human infestation the drug of choice is metronidazole, but there is no efficient compound for treating the cattle. Since the medication is also used for other parasitic and bacterial diseases, since the 60s, refractory cases and resistant strains have been documented. Besides, the drug may be mutagenic and carcinogenic. Therefore the search for new trichomonicidal compounds is required. In the present study we investigated the effects of sodium N,N-diethylthiolcarbamate (DETC) alone or combined with metronidazole upon the parasitic protozoa T. vaginalis and T. foetus. We notice that DETC significantly inhibited the T. vaginalis proliferation, producing an IC50 of 269.7nM, whereas metronidazole produced an IC50 of 523.1. In T. foetus the IC50 values were similar, being 497.8 and 459.7nM for DETC and metronidazole, respectively. These compounds did not significantly affect the incorporação de [3H]timidine incorporation by murine splenocytes in concentrations up to 1000μM. The mitochondrial activity of murine peritoneal macrophages was not affected by 200μM DETC, suggesting a selective mode of action. In order to determine whether there is synergism between DETC and metronidazole, we determined the fractional inhibitory concentrations (FIC) of these compounds upon both protozoa. The FIC values for T.vaginalis and T. foetus were 0.3 and 0.7, respectively. This observation indicates that synergistic interaction takes place only on the human pathogen. To determine whether the incubation with DETC could affect the expression of sulphydril groups of parasites we employed the Ellman’s reaction to measure the total thiol groups of T. vaginalis before and after the addition of the compound. We observed that treatment with DETC for 24h significantly (p <0.01) reduced the concentration of thiol groups of the parasite. The detection of free thiols by the fluorescent probe ortho- phthaldialdehyde (OPA) in T. foetus suggests the involvement of sulphydrils in the DETC mechanism of action, since it markedly reduces the OPA labeling of parasites, but this effect was reversed by cysteine preincubation with. It is noteworthy that the amino acid addition also reverts, the effects of the compound on the parasite proliferation. The measurement of free radicals by luminol-enhanced chemiluminescence indicated that reactive oxygen species generation was significantly (p <0.05) enhanced by DETC in T. vaginalis, but not T. foetus. The oxidative stress on the parasites was evaluated by measurement of the thiobarbituric acid-reactive substances (TBARs). We observed that the metronidazole-DETC combination significantly enhanced lipid peroxidation in T. vaginalis (p <0.01) and T. foetus (p <0.05). The ultrastructural analysis by transmission electron microscopy revealed that both DETC and metronidazole produced hydrogenosomal damage and triggered autophagy and these effects were more pronounced on the parasites incubated with the combined drugs. Taken together these data suggest that the metronidazole-DETC combination may furnish new tools in the effective chemotherapy of trichomoniasis.

In the anaerobic protozoon <i>Trichomonas vaginalis</i>, the oxidative decarboxylation of pyruvate is catalysed in a CoA-dependent reaction by pyruvate: ferredoxin oxidoreductase (PFOR). This enzyme has been identified as a potential target for the development of a relatively non-toxic anti-trichomonal agent. 1. <i>T. vaginalis</i> PFOR was localised in the hydrogenosomal membrane fraction, and could be solubilised by buffer of high ionic strength. A high salt concentration was required to prevent aggregation of PFOR. These results suggested that PFOR was either an extrinsic protein bound to the hydrogenosomal membrane or that the enzyme exists <i>in vivo</i> in the hydrogenosomal matrix in an aggregated state. PFOR was solubilised and purified to homogeneity, the most _ffective step being salting-out chromatography on Sepharose 4B. Low recoveries of active enzyme were caused by inactivation by oxygen and the irreversible loss of thiamin pyrophosphate (TPP). 2. PFOR is a dimeric enzyme of overall M<SUB>r</SUB>240000. The enzyme contains 0.5 mol of TPP per mol of dimer, and equivalent amounts of non-haem iron and acid-labile sulphur, consistent with the presence of two [4Fe-4S] centres per enzyme molecule. Flavin nucleotides and lipoic acid are absent. PFOR from <i>T. vaginalis</i> is therefore broadly similar to the 2-oxo acid:ferredoxin (flavodoxin) oxidoreductases purified from bacterial sources, and clearly different from the 2-oxo acid dehydrogenase multienzyme complexes which occur in aerobic organisms. 3. A steady-state kinetic analysis of purified PFOR demonstrated that the enzyme obeyed Bi Bi Ping Pong kinetics except at very high CoA concentrations, where substrate inhibition occurred. The inhibition produced by the product of acetyl-CoA, in the presence of saturating CoA, was competitive with respect to pyruvate. In the absence of CoA, stoichiometric amounts of pyruvate were decarboxylated by PFOR. These results suggest that decarboxylation, formation of the stable imtermediate and its reaction with CoA to form acetyl-CoA all take place at one active site. 4. Spectroscopic investigations using electron paramagnetic resonance indicated that the stable intermediate formed after pyruvate decarboxylation was a free-radical species. This substrate-based radical is proposed to arise by the transfer of a single electron from the initial decarboxylation product to a [4Fe-4S] centre. The free-radical signal was greatly diminished if the enzyme was subsequently incubated with CoA, suggesting that it represents a real catalytic intermediate. 5. <i>T. vaginalis</i> PFOR was inactivated by incubation with pyruvate alone, a reaction the enzyme has in common with the <i>E. coli</i> pyruvate dehydrogenase (PDH) complex and yeast pyruvate decarboxylase, suggesting similarities between these enzymes at least in the initial formation of the decarboxylated intermediate, presumed to be the enamine of hydroxyethyl-TPP. The conjugated 2-oxo acid, (E)-4-(-chorophenyl)-2-oxo-3-butenoic acid, was an irreversible inhibitor of <i>T. vaginalis</i> PFOR and yeast pyruvate decarboxylase, a result taken to reflect the initial formation of an enamine intermediate in each case. 6. 3-hydroxypyruvate was a potent irreversible inhibitor of <i>T. vaginalis</i> PFOR. The observation that 3-hydroxypyruvate was also an alternative substrate for pyruvate in the overall reaction suggested that it might be acting as a mechanism-based inactivator. 3-hydroxypyruvate was ineffective against <i>E. coli</i> PDH complex suggesting an interesting difference in active site geometry that might be exploited for potential drug design.

Lysosomes represent the central degradative compartment of eukaryote cells. Harboring a variety of acid hydrolases at acidic pH, this organelle is designed for the degradation and recycling of material for cellular homeostasis and sustenance. Studies on mammalian lysosomes have been extensive and revealed a long list of lysosomal proteins. While the function of most of these remains elusive, it is not surprising that a large subset have been found to be hydrolases. However, little is known about the biogenesis and function of this organelle in parasitic protists, and even less about its role in secretion. This work aimed to shed light on the (phago-)lysosomal proteome of the human parasite Trichomonas vaginalis, its protein targeting, and involvement in hydrolase secretion. Our studies revealed a lysosomal proteome of 462 proteins in 21 functional classes. Hydrolases represented the largest functional class and included proteases, lipases, phosphatases, and glycosidases. The identification of a large set of proteins involved in vesicular trafficking and cytoskeleton rearrangement indicates a dynamic phagolysosomal compartment. Our research, as well as the research of others, have identified several hydrolases also in the secretome, including the cysteine protease TvCP2. However, previously the mode...

Trichomonas vaginalis is the etiologic agent causing human trichomoniasis, a sexually transmitted infection found worldwide. In this study, subtilisin-like serine proteases (subtilases) were examined for their putative role in cell viability. Published data of other eukaryotic protozoan parasites confirm the importance of subtilases for adhesion and invasion. Serine protease inhibitor assays show that 3,4 DIC and TPCK inhibited cell growth from 79.6 to 98.4% respectively. To examine subtilases in more detail, a number of putative subtilases were cloned from T vaginalis. Two proteases were expressed recombinantly for antiserum production. TvSUB-12 (SP12) was localized to the posterior cell surface as using immunofluorescence and a kexin homolog called TvSUB-6 (SP6), revealed perinuclear staining. This study illustrated an essential role for subtilases in trichomonad cell viability and preliminary examination of two specific serine proteases revealing two different locations in the cell. To date, both of these proteases have never been characterized in this important human parasite.

Nos últimos anos, os metabólitos isolados de fungos marinhos vêm ganhando considerável atenção em razão de possuírem estruturas químicas únicas com diversas atividades biológicas já descritas, incentivando novas pesquisas na área. A tricomoníase é a doença sexualmente transmissível (DST) de origem não viral mais comum no mundo, estando associada a sérias consequências à saúde, sendo relatado um aumento no número de isolados clínicos resistentes ao tratamento de escolha. Infecções causadas por bactérias com diferentes mecanismos de resistência, representam um grande desafio para a saúde pública atual, acarretando em altas taxas de mortalidade e morbidade. As bactérias patogênicas dispõem de fatores de virulência, como a formação de biofilme, que agravam infecções tornando-as persistentes. Devido ao potencial biológico dos produtos de origem marinha e a importância dessas infecções, o objetivo deste estudo foi avaliar a atividade anti-T. vaginalis, antimicrobiana e antibiofilme de moléculas obtidas da fermentação de fungos associados a organismos marinhos. As 14 cepas fúngicas foram isoladas de esponjas e corais marinhos, obtidos da costa do estado de Alagoas, Brasil. Após produção do metabólito, o micélio foi separado do meio. O micélio foi extraído com metanol e o meio com acetato de etila. As frações foram submetidas aos ensaios de atividade anti-T.vaginalis, antimicrobiana e antibiofilme (inibição da formação e erradicação). As frações que demonstraram atividade foram submetidas ao ensaio de hemólise, avaliação da citotoxicidade (HMVII e Vero) e toxicidade em modelo de Galleria mellonella. A fração que demonstrou os melhores resultados nos ensaios de atividade foi submetida ao fracionamento bioguiado. As frações orgânicas dos fungos Aspergillus niger (FMPV 03) e complexo Trichoderma harzianum/Hypocrea lixii (FMPV 09) foram ativas frente ao T. vaginalis ATCC 30236, com valores de MIC de 2 mg/mL e 1 mg/mL, respectivamente. Quando investigadas, essas frações mantiveram a atividade frente ao isolado clínico resistente ao metronidazol (TV-LACM2R), apresentado os mesmo valores de MIC encontrados para o isolado ATCC. Para a atividade antimicrobiana, as frações orgânicas do Aspergillus niger (FMPV 03), Aspergillus tubingensis (FMPV 06), complexo Trichoderma harzianu/Hypocrea lixii (FMPV 09) e Aspergillus sydowii (FMPV 10) foram ativas contra S. epidermidis ATCC 35984. Ainda, frente a P. aeruginosa ATCC 27853 somente as frações orgânicas do Aspergillus niger (FMPV 03) e Aspergillus tubingensis (FMPV 06) demonstraram atividade. Neste ensaio, para ambas as bactérias, os valores de MIC não ultrapassaram 1,5 mg/mL. A atividade destas frações também foi observada frente às mesmas bactérias no ensaio de antiformação de biofilme, já que ocorreu a morte das células. A habilidade de erradicar biofilmes foi detectada somente para a fração orgânica do fungo Aspergillus flavus (FMPV 01), o qual foi capaz de remover 52% do biofilme já formado de S. epidermidis ATCC 35984. A ausência de hemólise dos eritrócitos foi observada em todas as frações ativas estudadas. Na avaliação da citotoxicidade in vitro frente às linhagens celulares HMVII e Vero, apenas a fração orgânica do Aspergillus niger (FMPV 03), não apresentou efeito citotóxico. No entanto, no ensaio de avaliação da toxicidade in vivo, nenhuma das amostras testadas causou redução na sobrevivência das larvas de Galleria mellonella. Então, a fração orgânica do fungo Aspergillus niger (FMPV 03) foi submetida ao fracionamento bioguiado utilizando coluna RP-18. Sete frações foram obtidas, sendo que a primeira (100% água), foi ativa contra T. vaginalis, S. epidermidis e P. aeruginosa. Quando submetida à Cromatografia em Camada Delgada (CCD), demonstrou quatro bandas que foram coradas com anisaldeído-ácido sulfúrico e ninhidrina. Além disso, a fração 100% água não demonstrou redução da sobrevivência das larvas de Galleria mellonella, nas três concentrações testadas. Portanto, a gama de atividades relatadas corrobora o potencial dos fungos marinhos na produção de moléculas bioativas. / In recent years, the isolated metabolites from marine fungi have been attracted considerable attention due to unique chemical structures with diverse biological activities, encouraging further research in the area. Trichomoniasis is the most prevalent non-viral sexually transmitted disease (STD) worldwide. This has been linked to serious health consequences and an increase in the number of clinical isolates resistant to the treatment of choice has been reported. Infections caused by bacteria with different resistance mechanisms represent a major challenge to the current public health, resulting in high rates of mortality and morbidity. Pathogenic bacteria present virulence factors, such as biofilm formation, which migth enhance the persistence of infections. Due to the biological potential of marine products and the importance of these infections, the aim of this study was to evaluate the anti-T. vaginalis, antimicrobial and antibiofilm activities of the obtained molecule from the fermentation of fungi associated with marine organism. The 14 fungal strains were isolated from sponges and corals marine obtained from the coast of Alagoas, Brazil. After production of the metabolite the mycelium was separated from the medium. The mycelium was extracted with methanol and the medium with ethyl acetate. The fractions were subjected to the assays anti-T. vaginalis, antimicrobial and antibiofilm (inhibition of the formation and eradication) activities. The fractions that showed activity were subjected to the assays of hemolysis, cytotoxicity evaluation (HMVII and Vero) and toxicity Galleria mellonella model. The fraction which showed the best results in activity assays was subjected to fractionation bioguided. The organic fraction of Aspergillus niger (FMPV 03) and Trichoderma harzianum/Hypocrea lixii complex (FMPV 09) were active against T. vaginalis ATCC 30236 with MIC values of 2 mg/mL and 1 mg/mL, respectively. When investigated, these fractions maintained activity against resistant clinical isolate to metronidazole (TV-LACM2R), presented the same MIC values found to isolate ATCC. For the antimicrobial activity, the organic fractions of Aspergillus niger (FMPV 03), Aspergillus tubingensis (FMPV 06), Trichoderma harzianum/Hypocrea lixii complex (FMPV 09) and Aspergillus sydowii (FMPV 10) were active against S. epidermidis ATCC 35984. Even, against P. aeruginosa ATCC 27853 only the organic fractions of Aspergillus niger (FMPV 03) and Aspergillus tubingensis (FMPV 06) demonstrated activity. In this test, for both bacteria, MIC values did not exceed 1.5 mg/mL. The activity of these fractions was also observed across the same bacteria in the antibiofilm formation assay, since cell death occurred. The ability to eradicate biofilms was detected only for the organic fraction of the fungus Aspergillus flavus (FMPV 01) which was able to remove 52% of the already formed biofilm of S. epidermidis ATCC 35984. The absence of hemolysis of red cells was observed in all active fractions studied. In the assessment of cytotoxicity in vitro against the cell lines HMVII and Vero, only the organic fraction of Aspergillus niger (FMPV 03), showed no cytotoxic effect. However, in the test evaluation of in vivo toxicity, none of the samples tested caused a reduction in the survival of the larvae of Galleria mellonella. Then, the organic fraction of the fungus Aspergillus niger (FMPV 03) was submitted to bioguided fractionation using RP-18 column. Seven fractions were obtained, of which the first (100% water), was active against T. vaginalis, S. epidermidis e P. aruginosa. When subjected to thin layer chromatography (TLC) showed four bands were stained with ninhydrin and anisaldehyde-sulfuric acid. In addition, 100% water fraction showed no reduction of the survival of larvae of Galleria mellonella at the three concentrations tested. Therefore, the range of activities reported corroborates the potential of marine fungi to produce bioactive molecules.

Nos últimos anos, os metabólitos isolados de fungos marinhos vêm ganhando considerável atenção em razão de possuírem estruturas químicas únicas com diversas atividades biológicas já descritas, incentivando novas pesquisas na área. A tricomoníase é a doença sexualmente transmissível (DST) de origem não viral mais comum no mundo, estando associada a sérias consequências à saúde, sendo relatado um aumento no número de isolados clínicos resistentes ao tratamento de escolha. Infecções causadas por bactérias com diferentes mecanismos de resistência, representam um grande desafio para a saúde pública atual, acarretando em altas taxas de mortalidade e morbidade. As bactérias patogênicas dispõem de fatores de virulência, como a formação de biofilme, que agravam infecções tornando-as persistentes. Devido ao potencial biológico dos produtos de origem marinha e a importância dessas infecções, o objetivo deste estudo foi avaliar a atividade anti-T. vaginalis, antimicrobiana e antibiofilme de moléculas obtidas da fermentação de fungos associados a organismos marinhos. As 14 cepas fúngicas foram isoladas de esponjas e corais marinhos, obtidos da costa do estado de Alagoas, Brasil. Após produção do metabólito, o micélio foi separado do meio. O micélio foi extraído com metanol e o meio com acetato de etila. As frações foram submetidas aos ensaios de atividade anti-T.vaginalis, antimicrobiana e antibiofilme (inibição da formação e erradicação). As frações que demonstraram atividade foram submetidas ao ensaio de hemólise, avaliação da citotoxicidade (HMVII e Vero) e toxicidade em modelo de Galleria mellonella. A fração que demonstrou os melhores resultados nos ensaios de atividade foi submetida ao fracionamento bioguiado. As frações orgânicas dos fungos Aspergillus niger (FMPV 03) e complexo Trichoderma harzianum/Hypocrea lixii (FMPV 09) foram ativas frente ao T. vaginalis ATCC 30236, com valores de MIC de 2 mg/mL e 1 mg/mL, respectivamente. Quando investigadas, essas frações mantiveram a atividade frente ao isolado clínico resistente ao metronidazol (TV-LACM2R), apresentado os mesmo valores de MIC encontrados para o isolado ATCC. Para a atividade antimicrobiana, as frações orgânicas do Aspergillus niger (FMPV 03), Aspergillus tubingensis (FMPV 06), complexo Trichoderma harzianu/Hypocrea lixii (FMPV 09) e Aspergillus sydowii (FMPV 10) foram ativas contra S. epidermidis ATCC 35984. Ainda, frente a P. aeruginosa ATCC 27853 somente as frações orgânicas do Aspergillus niger (FMPV 03) e Aspergillus tubingensis (FMPV 06) demonstraram atividade. Neste ensaio, para ambas as bactérias, os valores de MIC não ultrapassaram 1,5 mg/mL. A atividade destas frações também foi observada frente às mesmas bactérias no ensaio de antiformação de biofilme, já que ocorreu a morte das células. A habilidade de erradicar biofilmes foi detectada somente para a fração orgânica do fungo Aspergillus flavus (FMPV 01), o qual foi capaz de remover 52% do biofilme já formado de S. epidermidis ATCC 35984. A ausência de hemólise dos eritrócitos foi observada em todas as frações ativas estudadas. Na avaliação da citotoxicidade in vitro frente às linhagens celulares HMVII e Vero, apenas a fração orgânica do Aspergillus niger (FMPV 03), não apresentou efeito citotóxico. No entanto, no ensaio de avaliação da toxicidade in vivo, nenhuma das amostras testadas causou redução na sobrevivência das larvas de Galleria mellonella. Então, a fração orgânica do fungo Aspergillus niger (FMPV 03) foi submetida ao fracionamento bioguiado utilizando coluna RP-18. Sete frações foram obtidas, sendo que a primeira (100% água), foi ativa contra T. vaginalis, S. epidermidis e P. aeruginosa. Quando submetida à Cromatografia em Camada Delgada (CCD), demonstrou quatro bandas que foram coradas com anisaldeído-ácido sulfúrico e ninhidrina. Além disso, a fração 100% água não demonstrou redução da sobrevivência das larvas de Galleria mellonella, nas três concentrações testadas. Portanto, a gama de atividades relatadas corrobora o potencial dos fungos marinhos na produção de moléculas bioativas. / In recent years, the isolated metabolites from marine fungi have been attracted considerable attention due to unique chemical structures with diverse biological activities, encouraging further research in the area. Trichomoniasis is the most prevalent non-viral sexually transmitted disease (STD) worldwide. This has been linked to serious health consequences and an increase in the number of clinical isolates resistant to the treatment of choice has been reported. Infections caused by bacteria with different resistance mechanisms represent a major challenge to the current public health, resulting in high rates of mortality and morbidity. Pathogenic bacteria present virulence factors, such as biofilm formation, which migth enhance the persistence of infections. Due to the biological potential of marine products and the importance of these infections, the aim of this study was to evaluate the anti-T. vaginalis, antimicrobial and antibiofilm activities of the obtained molecule from the fermentation of fungi associated with marine organism. The 14 fungal strains were isolated from sponges and corals marine obtained from the coast of Alagoas, Brazil. After production of the metabolite the mycelium was separated from the medium. The mycelium was extracted with methanol and the medium with ethyl acetate. The fractions were subjected to the assays anti-T. vaginalis, antimicrobial and antibiofilm (inhibition of the formation and eradication) activities. The fractions that showed activity were subjected to the assays of hemolysis, cytotoxicity evaluation (HMVII and Vero) and toxicity Galleria mellonella model. The fraction which showed the best results in activity assays was subjected to fractionation bioguided. The organic fraction of Aspergillus niger (FMPV 03) and Trichoderma harzianum/Hypocrea lixii complex (FMPV 09) were active against T. vaginalis ATCC 30236 with MIC values of 2 mg/mL and 1 mg/mL, respectively. When investigated, these fractions maintained activity against resistant clinical isolate to metronidazole (TV-LACM2R), presented the same MIC values found to isolate ATCC. For the antimicrobial activity, the organic fractions of Aspergillus niger (FMPV 03), Aspergillus tubingensis (FMPV 06), Trichoderma harzianum/Hypocrea lixii complex (FMPV 09) and Aspergillus sydowii (FMPV 10) were active against S. epidermidis ATCC 35984. Even, against P. aeruginosa ATCC 27853 only the organic fractions of Aspergillus niger (FMPV 03) and Aspergillus tubingensis (FMPV 06) demonstrated activity. In this test, for both bacteria, MIC values did not exceed 1.5 mg/mL. The activity of these fractions was also observed across the same bacteria in the antibiofilm formation assay, since cell death occurred. The ability to eradicate biofilms was detected only for the organic fraction of the fungus Aspergillus flavus (FMPV 01) which was able to remove 52% of the already formed biofilm of S. epidermidis ATCC 35984. The absence of hemolysis of red cells was observed in all active fractions studied. In the assessment of cytotoxicity in vitro against the cell lines HMVII and Vero, only the organic fraction of Aspergillus niger (FMPV 03), showed no cytotoxic effect. However, in the test evaluation of in vivo toxicity, none of the samples tested caused a reduction in the survival of the larvae of Galleria mellonella. Then, the organic fraction of the fungus Aspergillus niger (FMPV 03) was submitted to bioguided fractionation using RP-18 column. Seven fractions were obtained, of which the first (100% water), was active against T. vaginalis, S. epidermidis e P. aruginosa. When subjected to thin layer chromatography (TLC) showed four bands were stained with ninhydrin and anisaldehyde-sulfuric acid. In addition, 100% water fraction showed no reduction of the survival of larvae of Galleria mellonella at the three concentrations tested. Therefore, the range of activities reported corroborates the potential of marine fungi to produce bioactive molecules.

Nos últimos anos, os metabólitos isolados de fungos marinhos vêm ganhando considerável atenção em razão de possuírem estruturas químicas únicas com diversas atividades biológicas já descritas, incentivando novas pesquisas na área. A tricomoníase é a doença sexualmente transmissível (DST) de origem não viral mais comum no mundo, estando associada a sérias consequências à saúde, sendo relatado um aumento no número de isolados clínicos resistentes ao tratamento de escolha. Infecções causadas por bactérias com diferentes mecanismos de resistência, representam um grande desafio para a saúde pública atual, acarretando em altas taxas de mortalidade e morbidade. As bactérias patogênicas dispõem de fatores de virulência, como a formação de biofilme, que agravam infecções tornando-as persistentes. Devido ao potencial biológico dos produtos de origem marinha e a importância dessas infecções, o objetivo deste estudo foi avaliar a atividade anti-T. vaginalis, antimicrobiana e antibiofilme de moléculas obtidas da fermentação de fungos associados a organismos marinhos. As 14 cepas fúngicas foram isoladas de esponjas e corais marinhos, obtidos da costa do estado de Alagoas, Brasil. Após produção do metabólito, o micélio foi separado do meio. O micélio foi extraído com metanol e o meio com acetato de etila. As frações foram submetidas aos ensaios de atividade anti-T.vaginalis, antimicrobiana e antibiofilme (inibição da formação e erradicação). As frações que demonstraram atividade foram submetidas ao ensaio de hemólise, avaliação da citotoxicidade (HMVII e Vero) e toxicidade em modelo de Galleria mellonella. A fração que demonstrou os melhores resultados nos ensaios de atividade foi submetida ao fracionamento bioguiado. As frações orgânicas dos fungos Aspergillus niger (FMPV 03) e complexo Trichoderma harzianum/Hypocrea lixii (FMPV 09) foram ativas frente ao T. vaginalis ATCC 30236, com valores de MIC de 2 mg/mL e 1 mg/mL, respectivamente. Quando investigadas, essas frações mantiveram a atividade frente ao isolado clínico resistente ao metronidazol (TV-LACM2R), apresentado os mesmo valores de MIC encontrados para o isolado ATCC. Para a atividade antimicrobiana, as frações orgânicas do Aspergillus niger (FMPV 03), Aspergillus tubingensis (FMPV 06), complexo Trichoderma harzianu/Hypocrea lixii (FMPV 09) e Aspergillus sydowii (FMPV 10) foram ativas contra S. epidermidis ATCC 35984. Ainda, frente a P. aeruginosa ATCC 27853 somente as frações orgânicas do Aspergillus niger (FMPV 03) e Aspergillus tubingensis (FMPV 06) demonstraram atividade. Neste ensaio, para ambas as bactérias, os valores de MIC não ultrapassaram 1,5 mg/mL. A atividade destas frações também foi observada frente às mesmas bactérias no ensaio de antiformação de biofilme, já que ocorreu a morte das células. A habilidade de erradicar biofilmes foi detectada somente para a fração orgânica do fungo Aspergillus flavus (FMPV 01), o qual foi capaz de remover 52% do biofilme já formado de S. epidermidis ATCC 35984. A ausência de hemólise dos eritrócitos foi observada em todas as frações ativas estudadas. Na avaliação da citotoxicidade in vitro frente às linhagens celulares HMVII e Vero, apenas a fração orgânica do Aspergillus niger (FMPV 03), não apresentou efeito citotóxico. No entanto, no ensaio de avaliação da toxicidade in vivo, nenhuma das amostras testadas causou redução na sobrevivência das larvas de Galleria mellonella. Então, a fração orgânica do fungo Aspergillus niger (FMPV 03) foi submetida ao fracionamento bioguiado utilizando coluna RP-18. Sete frações foram obtidas, sendo que a primeira (100% água), foi ativa contra T. vaginalis, S. epidermidis e P. aeruginosa. Quando submetida à Cromatografia em Camada Delgada (CCD), demonstrou quatro bandas que foram coradas com anisaldeído-ácido sulfúrico e ninhidrina. Além disso, a fração 100% água não demonstrou redução da sobrevivência das larvas de Galleria mellonella, nas três concentrações testadas. Portanto, a gama de atividades relatadas corrobora o potencial dos fungos marinhos na produção de moléculas bioativas. / In recent years, the isolated metabolites from marine fungi have been attracted considerable attention due to unique chemical structures with diverse biological activities, encouraging further research in the area. Trichomoniasis is the most prevalent non-viral sexually transmitted disease (STD) worldwide. This has been linked to serious health consequences and an increase in the number of clinical isolates resistant to the treatment of choice has been reported. Infections caused by bacteria with different resistance mechanisms represent a major challenge to the current public health, resulting in high rates of mortality and morbidity. Pathogenic bacteria present virulence factors, such as biofilm formation, which migth enhance the persistence of infections. Due to the biological potential of marine products and the importance of these infections, the aim of this study was to evaluate the anti-T. vaginalis, antimicrobial and antibiofilm activities of the obtained molecule from the fermentation of fungi associated with marine organism. The 14 fungal strains were isolated from sponges and corals marine obtained from the coast of Alagoas, Brazil. After production of the metabolite the mycelium was separated from the medium. The mycelium was extracted with methanol and the medium with ethyl acetate. The fractions were subjected to the assays anti-T. vaginalis, antimicrobial and antibiofilm (inhibition of the formation and eradication) activities. The fractions that showed activity were subjected to the assays of hemolysis, cytotoxicity evaluation (HMVII and Vero) and toxicity Galleria mellonella model. The fraction which showed the best results in activity assays was subjected to fractionation bioguided. The organic fraction of Aspergillus niger (FMPV 03) and Trichoderma harzianum/Hypocrea lixii complex (FMPV 09) were active against T. vaginalis ATCC 30236 with MIC values of 2 mg/mL and 1 mg/mL, respectively. When investigated, these fractions maintained activity against resistant clinical isolate to metronidazole (TV-LACM2R), presented the same MIC values found to isolate ATCC. For the antimicrobial activity, the organic fractions of Aspergillus niger (FMPV 03), Aspergillus tubingensis (FMPV 06), Trichoderma harzianum/Hypocrea lixii complex (FMPV 09) and Aspergillus sydowii (FMPV 10) were active against S. epidermidis ATCC 35984. Even, against P. aeruginosa ATCC 27853 only the organic fractions of Aspergillus niger (FMPV 03) and Aspergillus tubingensis (FMPV 06) demonstrated activity. In this test, for both bacteria, MIC values did not exceed 1.5 mg/mL. The activity of these fractions was also observed across the same bacteria in the antibiofilm formation assay, since cell death occurred. The ability to eradicate biofilms was detected only for the organic fraction of the fungus Aspergillus flavus (FMPV 01) which was able to remove 52% of the already formed biofilm of S. epidermidis ATCC 35984. The absence of hemolysis of red cells was observed in all active fractions studied. In the assessment of cytotoxicity in vitro against the cell lines HMVII and Vero, only the organic fraction of Aspergillus niger (FMPV 03), showed no cytotoxic effect. However, in the test evaluation of in vivo toxicity, none of the samples tested caused a reduction in the survival of the larvae of Galleria mellonella. Then, the organic fraction of the fungus Aspergillus niger (FMPV 03) was submitted to bioguided fractionation using RP-18 column. Seven fractions were obtained, of which the first (100% water), was active against T. vaginalis, S. epidermidis e P. aruginosa. When subjected to thin layer chromatography (TLC) showed four bands were stained with ninhydrin and anisaldehyde-sulfuric acid. In addition, 100% water fraction showed no reduction of the survival of larvae of Galleria mellonella at the three concentrations tested. Therefore, the range of activities reported corroborates the potential of marine fungi to produce bioactive molecules.

Dentro de las Enfermedades de Transmisión Sexual, la importancia de Trichomonas vaginalis es diversa. Esto debido al desconocimiento de la población de la existencia de este parásito y en muchos casos por no tener acceso a los servicios básicos de salud que permitan educar y al mismo tiempo evitar una posterior cadena de contagio. Es importante conocer cuales son las consecuencias que puede traer el padecer la infección y considerar que infectarse es innecesario, pues como en toda Enfermedad de Transmisión Sexual esta se puede y se debe prevenir. La importancia que se le da en nuestro país esta relacionada muchas veces con la disponibilidad de medios para realizar el diagnóstico, o del uso solamente de criterios clínicos en su identificación. La investigación llevada a cabo en los Servicios de Ginecología del Instituto Especializado Materno Perinatal entre los meses de Mayo a Julio del 2004 tiene como objetivo determinar la prevalencia de infección por Trichomonas vaginalis en gestantes en su primer trimestre de embarazo, que acuden a consulta externa del hospital. Con esta finalidad se realizó un estudio de tipo prospectivo,descriptivo, observacional, de corte transversal. El procedimiento se llevó a cabo luego que la paciente fue informada debidamente y firmó la hoja de consentimiento, de acuerdo a lo que reglamenta la Declaración de Helsinki. (Anexo 04) La toma de muestra de secresión vaginal, se realizó con ayuda del Gineco-Obstetra en los consultorios del hospital. La población tomada en cuenta para el estudio cumplía con los requisitos de: Encontrarse dentro del primer trimestre de embarazo, no haber tenido tratamiento contra Trichomonas vaginalis, no haber sido tratada con duchas o lavados vaginales previos al examen ginecológico. Tomada la muestra esta fue procesada dentro de los quince minutos de obtenida. Se utilizó para esto el medio de cultivo In Pouch TV, además se realizó el examen directo de la secreción, obteniéndose un resultado preliminar que en algunos casos no fué el mismo luego de ser cultivado. Las muestras fueron incubadas y leídas luego de 24, 48, 72 horas, cuarto y quinto día, llevándose un registro de los resultados que se obtenían luego de las lecturas. Se obtuvo muestras de un total de 105 pacientes, las que cumplían con los criterios de inclusión de nuestro estudio. De las 105 pacientes estudiadas, 6 presentaron resultados positivos al cultivo para Trichomonas vaginalis, lo que representa un 5,7% de infección en esta población. Las gestantes presentaron al mismo tiempo un rango de edad que fue de los 16 a los 40 años, período en el que muchas de ellas aún mantenían relaciones sexuales. Dentro de los signos y síntomas observados en las gestantes se encuentran el flujo vaginal anormal (abundante), mal olor, ardor y prurito. El flujo vaginal presentó características como el aspecto que varió de grumoso, cremoso, espeso, a líquido y mucoso que constituyó el flujo normal. En el color se observó una variedad de ellos que iban desde el transparente, blanco, blanco-amarillento, blanco-sanguinolento, amarillo, amarillo-verdoso y verde. Se hace también una comparación de los antecedentes de estas pacientes, en relación al uso o no de métodos anticonceptivos, uso de preservativos de la pareja y si compartían una o mas parejas sexuales; todo esto relacionado con la positividad al cultivo para Trichomonas vaginalis. Se evalúa también la importancia que existe entre el grado de instrucción de las gestantes y su ocupación, versus los cuadros de positividad al cultivo. Se concluye que es necesario hacer una evaluación mas completa de las pacientes gestantes que son atendidas, no solo en las etapas iniciales del embarazo, sino durante toda la gestación. Así mismo se debe utilizar métodos más sensibles de identificación para el diagnóstico de Trichomonas vaginalis; debido a que no solo se deben considerar criterios clínicos en el diagnóstico, pues esta demostrado que el mejor diagnóstico es la observación directa del parásito.