O lúpus eritematoso sistêmico (LES) é uma doença autoimune cuja fisiopatologia envolve mecanismos imunológicos, incluindo distúrbios nos processos de morte celular e nos mecanismos de eliminação de autoantígenos e de tolerância, acompanhados da formação de autoanticorpos patogênicos. Ele acomete principalmente mulheres jovens e a gestação nestas pacientes apresenta significativa morbimortalidade. Os achados clínicos e laboratoriais na nefrite lúpica são semelhantes àqueles encontrados em pacientes com pré-eclâmpsia (PE), especificamente hipertensão arterial, proteinúria e edema. Foi proposto o uso de fatores angiogênicos, como o fator de crescimento vascular endotelial (VEGF) e o fator de crescimento placentário (PlGF), e antiangiogênicos, como o receptor Fms-like tirosina quinase 1 solúvel (sFlt-1), para o diagnóstico diferencial entre estas duas condições, no entanto os dados disponíveis na literatura sobre estas citocinas em pacientes não gestantes com LES são inconsistentes. Este estudo foi desenhado para avaliar se existe diferença entre os níveis séricos de VEGF, PlGF e sFlt-1 em pacientes com LES com e sem atividade sistêmica da doença e se existe diferença nesses fatores quando comparamos pacientes com LES e mulheres saudáveis. Foram incluídas 54 mulheres com diagnóstico de LES em acompanhamento no ambulatório de Reumatologia do HUPE-UERJ, sem outra doença autoimune diagnosticada, e divididas de acordo com a atividade da doença. 30 pacientes tinham doença inativa (SLEDAI médio: 0,7) e 24 tinham doença ativa (SLEDAI médio: 11,6). 23 mulheres deste último grupo possuíam nefrite ativa, enquanto 20 das pacientes com doença em remissão já haviam apresentado nefrite ao longo da evolução do LES. O grupo controle foi formado por 34 mulheres hígidas atendidas no ambulatório de ginecologia da Policlínica Piquet Carneiro-UERJ. Considerando as três citocinas estudadas, as pacientes com LES apresentaram valores séricos médios superiores às mulheres do grupo controle (VEGF: 319,0 + 226,0 x 206,2 + 119,4, p=0,02; PlGF: 42,2 + 54,1 x 13,6 + 21,6, p=0,02; sFlt-1: 107,9 + 49,2 x 70,2 + 95,0, p=0,01). O grupo de pacientes com doença ativa também apresentou média superior ao controle nos três fatores (VEGF: 331,0 + 216,8 x 206,2 + 119,4, p=0,02; PlGF: 41,2 + 47,3 x 13,6 + 21,6, p=0,02; sFlt-1: 120,5 + 42,4 x 70,2 + 95,0, p=0,02), enquanto não foi encontrada diferença estatística entre o grupo de LES inativo e o controle. A média do sFlt-1 sérico foi maior nas pacientes com LES ativo do que a média das pacientes com a doença em remissão (120,5 + 54,9 x 97,8 + 42,4, p=0,02), mas não houve diferença significativa da média do VEGF e PlGF séricos entre os dois grupos. O melhor entendimento dos fatores angiogênicos e antiangiogênicos em pacientes com LES proporcionado por este estudo nos permite a análise dessas citocinas em gestantes com LES e, possivelmente, sua posterior aplicação como método diferencial entre nefrite lúpica e PE. / Systemic lupus erythematosus (SLE) is an autoimmune disease which pathophysiology involves immunological mechanisms including disturbances in the processes of cell death and mechanisms of elimination of autoantigens and tolerance, accompanied by formation of pathogenic autoantibodies. It mainly affects young women and pregnancy in these patients have significant morbidity and mortality. Clinical and laboratory findings in lupus nephritis are similar to those found in patients with preeclampsia (PE), specifically hypertension, proteinuria and edema. It has been proposed the use of angiogenic factors, such as vascular endothelial growth factor (VEGF) and placental growth factor (PlGF), and antiangiogenic factors, as soluble Fms-like tyrosine kinase-1 (sFlt-1), for the differential diagnosis between these two conditions, however available data in the literature about these cytokines in non-pregnant SLE patients are inconsistent. This study was designed to evaluate whether there are differences between serum levels of VEGF, PlGF and sFlt-1 in SLE patients with and without systemic disease activity and whether there are differences in these factors when comparing SLE patients with healthy women. 54 women with SLE followed at outpatient clinic of Rheumatology HUPE - UERJ were included. They had no other autoimmune disease diagnosed and were divided according to disease activity. 30 patients had inactive disease (mean SLEDAI: 0.7), and 24 had active disease (mean SLEDAI: 11.6). 23 women in this latter group had active nephritis, while 20 patients with inactive disease had history of lupus nephritis. The control group consisted of 34 healthy women who attended the Gynecology outpatient clinic at Policlínica Piquet Carneiro - UERJ. Considering the three studied cytokines, the SLE patients had higher mean serum levels than the control group (VEGF: 319.0 + 226.0 x 206.2 + 119.4, p=0.02; PlGF: 42.2 + 54.1 x 13.6 + 21.6, p=0.02; sFlt-1: 107.9 + 49.2 x 70.2 + 95.0, p=0.01). The group of patients with active disease also had higher mean levels of all three factors than controls (VEGF: 331.0 + 216.8 x 206.2 + 119.4, p=0.02; PlGF: 41.2 + 47.3 x 13.6 + 21.6, p=0.02; sFlt-1: 120.5 + 42.4 x 70.2 + 95.0, p=0.02), whereas no statistical difference was found between the group with inactive SLE and the control group. The mean sFlt-1 levels were higher in patients with active SLE than the mean levels of patients with inactive disease (120.5 + 54.9 x 97.8 + 42.4, p=0.02), but there was no significant difference in mean serum of VEGF and PlGF levels between these two groups. A better understanding of angiogenic and antiangiogenic factors in patients with SLE provided by this study allows the analysis of these cytokines in pregnant woman with SLE and possibly their subsequent application as differential method between PE and lupus nephritis.

O lúpus eritematoso sistêmico (LES) é uma doença autoimune cuja fisiopatologia envolve mecanismos imunológicos, incluindo distúrbios nos processos de morte celular e nos mecanismos de eliminação de autoantígenos e de tolerância, acompanhados da formação de autoanticorpos patogênicos. Ele acomete principalmente mulheres jovens e a gestação nestas pacientes apresenta significativa morbimortalidade. Os achados clínicos e laboratoriais na nefrite lúpica são semelhantes àqueles encontrados em pacientes com pré-eclâmpsia (PE), especificamente hipertensão arterial, proteinúria e edema. Foi proposto o uso de fatores angiogênicos, como o fator de crescimento vascular endotelial (VEGF) e o fator de crescimento placentário (PlGF), e antiangiogênicos, como o receptor Fms-like tirosina quinase 1 solúvel (sFlt-1), para o diagnóstico diferencial entre estas duas condições, no entanto os dados disponíveis na literatura sobre estas citocinas em pacientes não gestantes com LES são inconsistentes. Este estudo foi desenhado para avaliar se existe diferença entre os níveis séricos de VEGF, PlGF e sFlt-1 em pacientes com LES com e sem atividade sistêmica da doença e se existe diferença nesses fatores quando comparamos pacientes com LES e mulheres saudáveis. Foram incluídas 54 mulheres com diagnóstico de LES em acompanhamento no ambulatório de Reumatologia do HUPE-UERJ, sem outra doença autoimune diagnosticada, e divididas de acordo com a atividade da doença. 30 pacientes tinham doença inativa (SLEDAI médio: 0,7) e 24 tinham doença ativa (SLEDAI médio: 11,6). 23 mulheres deste último grupo possuíam nefrite ativa, enquanto 20 das pacientes com doença em remissão já haviam apresentado nefrite ao longo da evolução do LES. O grupo controle foi formado por 34 mulheres hígidas atendidas no ambulatório de ginecologia da Policlínica Piquet Carneiro-UERJ. Considerando as três citocinas estudadas, as pacientes com LES apresentaram valores séricos médios superiores às mulheres do grupo controle (VEGF: 319,0 + 226,0 x 206,2 + 119,4, p=0,02; PlGF: 42,2 + 54,1 x 13,6 + 21,6, p=0,02; sFlt-1: 107,9 + 49,2 x 70,2 + 95,0, p=0,01). O grupo de pacientes com doença ativa também apresentou média superior ao controle nos três fatores (VEGF: 331,0 + 216,8 x 206,2 + 119,4, p=0,02; PlGF: 41,2 + 47,3 x 13,6 + 21,6, p=0,02; sFlt-1: 120,5 + 42,4 x 70,2 + 95,0, p=0,02), enquanto não foi encontrada diferença estatística entre o grupo de LES inativo e o controle. A média do sFlt-1 sérico foi maior nas pacientes com LES ativo do que a média das pacientes com a doença em remissão (120,5 + 54,9 x 97,8 + 42,4, p=0,02), mas não houve diferença significativa da média do VEGF e PlGF séricos entre os dois grupos. O melhor entendimento dos fatores angiogênicos e antiangiogênicos em pacientes com LES proporcionado por este estudo nos permite a análise dessas citocinas em gestantes com LES e, possivelmente, sua posterior aplicação como método diferencial entre nefrite lúpica e PE. / Systemic lupus erythematosus (SLE) is an autoimmune disease which pathophysiology involves immunological mechanisms including disturbances in the processes of cell death and mechanisms of elimination of autoantigens and tolerance, accompanied by formation of pathogenic autoantibodies. It mainly affects young women and pregnancy in these patients have significant morbidity and mortality. Clinical and laboratory findings in lupus nephritis are similar to those found in patients with preeclampsia (PE), specifically hypertension, proteinuria and edema. It has been proposed the use of angiogenic factors, such as vascular endothelial growth factor (VEGF) and placental growth factor (PlGF), and antiangiogenic factors, as soluble Fms-like tyrosine kinase-1 (sFlt-1), for the differential diagnosis between these two conditions, however available data in the literature about these cytokines in non-pregnant SLE patients are inconsistent. This study was designed to evaluate whether there are differences between serum levels of VEGF, PlGF and sFlt-1 in SLE patients with and without systemic disease activity and whether there are differences in these factors when comparing SLE patients with healthy women. 54 women with SLE followed at outpatient clinic of Rheumatology HUPE - UERJ were included. They had no other autoimmune disease diagnosed and were divided according to disease activity. 30 patients had inactive disease (mean SLEDAI: 0.7), and 24 had active disease (mean SLEDAI: 11.6). 23 women in this latter group had active nephritis, while 20 patients with inactive disease had history of lupus nephritis. The control group consisted of 34 healthy women who attended the Gynecology outpatient clinic at Policlínica Piquet Carneiro - UERJ. Considering the three studied cytokines, the SLE patients had higher mean serum levels than the control group (VEGF: 319.0 + 226.0 x 206.2 + 119.4, p=0.02; PlGF: 42.2 + 54.1 x 13.6 + 21.6, p=0.02; sFlt-1: 107.9 + 49.2 x 70.2 + 95.0, p=0.01). The group of patients with active disease also had higher mean levels of all three factors than controls (VEGF: 331.0 + 216.8 x 206.2 + 119.4, p=0.02; PlGF: 41.2 + 47.3 x 13.6 + 21.6, p=0.02; sFlt-1: 120.5 + 42.4 x 70.2 + 95.0, p=0.02), whereas no statistical difference was found between the group with inactive SLE and the control group. The mean sFlt-1 levels were higher in patients with active SLE than the mean levels of patients with inactive disease (120.5 + 54.9 x 97.8 + 42.4, p=0.02), but there was no significant difference in mean serum of VEGF and PlGF levels between these two groups. A better understanding of angiogenic and antiangiogenic factors in patients with SLE provided by this study allows the analysis of these cytokines in pregnant woman with SLE and possibly their subsequent application as differential method between PE and lupus nephritis.

Au cours des dernières années, des thérapies anti-cancéreuses ciblant l'angiogenèse tumorale ont été développées et ont démontré un bénéfice en terme de survie globale pour les patients atteints de certains cancers métastatiques. Cependant, dans de nombreux cas, les tumeurs acquièrent des résistances échappent au traitement. Le développement de nouveaux composés anti-angiogène est donc une réelle nécessité pour être proposés en seconde ligne thérapeutique. Dans ce travail, notre objectif était d'identifier de nouvelles molécules anti-angiogènes par le criblage à haut débit, de la chimiothèque académique de l'Université de Grenoble. Nous avons adapté le test de blessure sur cellules endothéliales au format des plaques de 96 puits et avons identifié une famille de molécules qui inhibent spécifiquement leur fermeture. L'activité anti-angiogène de la molécule leader (COB223) a été confirmée dans des modèles d'angiogenèse tridimensionnels in vitro, et, chez la souris, dans un modèle d'angiogenèse sous-cutanée. Nous avons testé l'activité anti-tumorale de COB223 dans un modèle de xénogreffe chez la souris et observé une diminution significative de la taille des tumeurs dans les souris traitées. A la recherche de son mécanisme d'action, nous avons observé que COB223 inhibe la prolifération cellulaire et diminue les phosphorylations de MEK et Raf, de ERK1/2 induites par le VEGF-A dans les cellules endothéliales. Nous avons également montré que COB223 n'inhibe pas les phosphorylations du VEGFR2 et de PLC. D'après ces résultats, nous proposons que la cible de COB est localisée dans la voie de signalisation VEGF/ PLC /PKC/ERK entre PKC et Ras. / Several anti-tumoral therapies targeting angiogenesis have been developed over the recent years and have demonstrated benefits for several metastatic cancers. However, in many cases, resistances to these treatments appear over time, allowing tumor escape. The development of new anti-angiogenic compounds is thus dramatically urged in order to propose second-line anti-angiogenic treatments. In this work, our aim was to identify new anti-angiogenic compounds through high throughput screening of the academic library from the University of Grenoble. We adapted the endothelial cell scratch assay to 96-well plates. We identified a family of molecules that specifically inhibited endothelial cell migration. The anti-angiogenic activity of the leader molecule (COB223) was confirmed in vitro in 3D cellular models of angiogenesis and in vivo using a mouse model of subcutaneous sponge implantation. We tested the anti-tumoral activity of COB223 on a mouse xenograft model. We observed that tumor growth was significantly reduced in treated mice correlated with decreased microvessel density. In search for its mechanism of action, we observed that COB223 inhibits cell proliferation and reduces VEGF-A-induced phosphorylation of MEK and ERK1/2 in endothelial cells. We also showed that COB223 did not affect VEGFR2 and PLC phosphorylation but reduces Raf phosphorylation responsible for its activity. These results allow us to propose that the molecular site of action of COB223 is located in the VEGF/ PLC /PKC/ERK pathway, between PKC and MEK.

Os primeiros vasos sanguíneos do embrião de vertebrados, formados de novo a partir de células originadas da mesoderme, originam os vasos linfáticos em um processo denominado vasculogênese. Já no adulto, novos vasos são formados principalmente através da angiogênese (ou linfoangiogênese) a partir da vasculatura pré-existente. Em indivíduos saudáveis, a arquitetura vascular é relativamente estática, sendo que o excesso ou a insuficiência de vasos são comumente relacionados à angiogênese patológica, vinculada a diversas doenças, como câncer, degeneração macular relacionada à idade, isquemia de membros e muitas outras. Dessa forma, o controle local da densidade de vasos sanguíneos torna-se interessante para o tratamento de condições patológicas visando melhoria de prognóstico e cura. Dentre os diversos fatores de crescimento conhecidos, o fator de crescimento endotelial vascular, VEGF, destaca-se como o principal regulador do processo de angiogênese através de isoformas pró-angiogênicas (VEGFxxx) e antiangiogênicas (VEGFxxxb) do gene VEGF-A. Consequentemente, as proteínas codificadas por esse gene constituem um alvo com alto potencial terapêutico. No presente estudo, propusemos a produção das isoformas proteicas recombinantes rhVEGF165, rhVEGF165b e rhVEGF121, oriundas do gene VEGF-A humano, visando à geração de biofármacos que podem ser utilizados para terapia molecular e engenharia tecidual. As sequências codificadoras das isoformas rhVEGF165 e rhVEGF121 foram amplificadas a partir do cDNA total sintetizado de amostras de RNA total de pulmão humano, enquanto que a da isoforma rhVEGF165b foi gerada através da mutação sítio-dirigida da sequência de rhVEGF165. As sequências foram clonadas no vetor de clonagem pGEM®-T Easy, sendo em seguida subclonadas no vetor pLV-eGFP, um vetor plasmidial de transferência lentiviral, que permite a expressão de transgenes em células de mamíferos e, também, da proteína repórter eGFP. Células humanas HEK293 em cultura aderente foram independentemente cotransfectadas com cada uma das construções geradas (pLV-rhVEGF165, pLV-rhVEGF165b e pLV-rhVEGFl21) juntamente com o vetor pTK-Hyg na proporção de 40:1 (m/m), viabilizando a seleção dos transfectantes com o antibiótico higromicina B, além da detecção de eGFP. Os clones celulares superprodutores das proteínas de interesse foram avaliados quanto à cinética de expressão em meio carente de soro e adaptados para a cultura em suspensão estática na presença de meio na ausência de componentes derivados de animais, demostrando a capacidade de expressão das isoformas rhVEGFs nestas condições de cultivo. Para o nosso conhecimento, este é o primeiro trabalho a descrever a expressão de isoformas de VEGF-A em células HEK293 mantidas em suspensão. As isoformas rhVEGF165 e rhVEGF165b foram purificadas por cromatografia de afinidade a heparina, a partir do meio condicionado pelos clones superprodutores gerados. Ensaios in vitro, utilizando o AngioPhaseTM Kit, e in vivo, através do ensaio da membrana corioalantoide em embriões de galinha (CAM Assay), ambos próprios para avaliação da atividade pró- e antiangiogênica de diferentes compostos, demonstraram que a isoforma rhVEGF165 possui atividade biológica, enquanto a isoforma rhVEGF165b não apresentou a atividade esperada (inibição da angiogênese). Estas isoformas foram testadas em modelo murino de engenharia tecidual do intestino curto, com indícios de que poderiam contribuir para o uso terapêutico neste contexto. A purificação da isoforma rhVEGF121, bem como as análises estruturais das proteínas produzidas, estão em processo de otimização. / The first blood vessels of the vertebrate embryo are formed de novo from mesoderm-derived cells and give rise to lymph vessels in a process termed vasculogenesis. In the adult, new blood vessels are formed mainly through angiogenesis (or lymphangiogenesis) from the pre-existing vasculature. In healthy individuals, the vascular architecture is fairly static, and both the excess and the insufficiency of vessels comprise a pathological angiogenic state, to which is credited the onset and/or progression of several diseases such as cancer, age-related macular degeneration, limb ischemia, and many others. Therefore, locally controlling the blood vessel density becomes interesting for the treatment of pathological conditions aiming at prognosis improvement and cure. Among the various known growth factors, the vascular endothelial growth factor, VEGF, stands out as the major regulator of the angiogenic process. This process is mediated through the action of pro- (VEGFxxx) and antiangiogenic (VEGFxxxb) isoforms, which are derived from the VEGF-A gene. Consequently, the proteins encoded by this gene are potential therapeutic targets. In this work, we set out to produce the recombinant protein isoforms rhVEGF165, rhVEGF165b, and rhVEGF121, which originate from the human VEGF-A gene, with the aim of generating biopharmaceuticals to be used for molecular therapy and tissue engineering. The rhVEGF165 and rhVEGF121 coding sequences were amplified from total cDNA sythesized from human lung total RNA. Conversely, the rhVEGF165b coding sequence was generated by site-directed mutagenesis of the rhVEGF165 sequence. The sequences were cloned into the pGEM®-T Easy cloning vector. These cDNAs were then subcloned into pLV-eGFP, a plasmid lentiviral transfer vector that allows for expression of transgenes and the eGFP reporter protein in mammalian cells. Human HEK293 cells cultivated under adherent conditions were independently co-transfected with each of the obtained constructs (pLV-rhVEGF165, pLV-rhVEGF165b, and pLV-rhVEGF121) and the pTK-Hyg vector at a proportion of 40:1 (m/m), enabling for the selection of transfectants with hygromycin B, apart from the detection of eGFP. The cell clones overexpressing the proteins of interest were evaluated for expression kinetics in serum-deprived conditioned media and adapted to static suspension culture in medium free of animal-derived components, demonstrating that expression of the protein isoforms was possible in these culture conditions. To the best of our knowledge, this is the first work that describes the expression of VEGF-A isoforms in HEK293 cells in suspension culture. The rhVEGF165 and rhVEGF165b isoforms were purified by affinity chromatography from media previously conditioned by the overexpressing cell clones. The biological activity of rhVEGF165 was demonstrated in vitro, by the AngioPhaseTM Kit assay, and in vivo with the CAM (chorioallantoic membrane) assay, both of which are suitable for evaluating the pro- and antiangiogenic activity of different compounds. The rhVEGF165b did not show the expected antiangiogenic activity. These isoforms were tested in a model of murine tissue-engineered small intestine, indicating a possible contribution to therapeutic use in this context. The purification of rhVEGF121, as well as the structural analysis of all three proteins, are in the process of being optimized.

Submitted by Viviane Lima da Cunha (viviane@biblioteca.ufpb.br) on 2017-06-16T12:44:17Z No. of bitstreams: 1 arquivototal.pdf: 1568113 bytes, checksum: 143c994d6a632a3c81bc4c4e5d8557f6 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-06-16T12:44:17Z (GMT). No. of bitstreams: 1 arquivototal.pdf: 1568113 bytes, checksum: 143c994d6a632a3c81bc4c4e5d8557f6 (MD5) Previous issue date: 2017-02-24 / Diabetic macular edema (DME) is the main cause of visual impairment in patients with diabetes mellitus. The most widely used treatment today is intravitreal injection (IIV) of anti-VEGF (vascular endothelial growth factor). Optical coherence tomography (OCT) is the gold-standard diagnostic test, however it is expensive and inaccessible. Some risk factors are strongly associated with development of DME and its response to treatment. There is few surveys that analyzes the impact and risk percentages of these factors in the probability of developing EMD and, therefore, in the necessity of early therapeutic intervention, which motivated the accomplishment of this research. This study aimed to achieve a Predictive Model to guide the decision in the early treatment with intravitreal injection in patients with EMD, by quantifying and ranking the risk factors impact on the chance of a diabetic patient need this therapy. It is a cross-sectional, observational, descriptive and analytical study. The data were collected at the Ophthalmology Department of the Lauro Wanderley University Hospital - UFPB and at the Hospital Visão, both in João Pessoa, and at the Genival Barbosa de Lucena Vision Center, located in Guarabira-PB, from July 2015 to September 2016. Individuals with type 1 or 2 diabetes and older than 18 years were included, after signing the informed consent form. The logistic regression model was used to obtain and adapt the predictive model and all the data were analyzed in statistical software R®, version 3.2.0. Eighty diabetic patients were evaluated: 57.5% had no indication of IIV and 42.5% needed this treatment. Of those who had EMD and needed anti-VEGF injection, the mean age was 60.65 years, 47.05% male and 52.94% female. In the group without macular edema, the mean age was 58.02 years, 26.06% male and 73.91% female. Among the individuals who had no indication of intravitreal injection of anti-VEGF, most had no mild retinopathy or non-proliferative diabetic retinopathy (NPDR) (69.56%). Among the patients who needed the treatment, the majority had severe NPDR or proliferative retinopathy (79.41%). Were identified as risk factors to EMD and intravitreal anti-VEGF: be retired (OR = 5.22, p-value0.05), had a personal history of diabetic retinopathy (OR = 20.27; P-value 0.006) and positive history for previous treatment with anti-VEGF (OR = 23.23; p-value 0.002). From the results of this study, we conclude that a diabetic individual has low visual acuity and presents these three factors, should be referred as soon as possible to the specialist, since he has a risk of presenting DME with need for anti-VEGF IIV, with 91.17% of accuracy. In summary, an evaluative and predictive model was proposed to serve as a supporting tool in therapeutic decision, mainly to the non-retinal physician, to refer to the specialist the patients with diabetic retinopathy and its main cause of low visual acuity - diabetic macular edema - to early diagnosis and treatment, which may be decisive to preventing irreversible visual loss in these patients. / A injeção intravítrea (IIV) de anti-VEGF (fator de crescimento vascular endotelial) constitui a modalidade terapêutica mais utilizada nos dias de hoje para o tratamento do edema macular diabético (EMD), sendo esta a principal causa de baixa visual em pacientes portadores de diabetes mellitus. O exame padrão – ouro para o diagnóstico é a tomografia de coerência óptica (TCO) da mácula, no entanto possui alto custo e difícil acesso. O desenvolvimento de EMD e a resposta ao tratamento são fortemente associados a determinados fatores de risco. Na literatura especializada há uma escassez de estudos que estabeleçam uma quantificação dos percentuais de risco desses fatores, a fim de verificar aqueles que possuem maior impacto na probabilidade de desenvolver EMD e, portanto, na necessidade de intervenção terapêutica precoce, o que motivou a realização desta pesquisa. O estudo teve por objetivo a propositura de um Modelo Preditivo para auxiliar na decisão de realização de uma injeção intravítrea de anti-VEGF, a partir da quantificação e hierarquização dos fatores de risco que compõem o perfil dos indivíduos adultos diabéticos. Trata-se de um estudo transversal, observacional, descritivo e inferencial. Os dados foram coletados na Unidade da Visão do Hospital Universitário Lauro Wanderley – UFPB e no Hospital Visão, ambos em João Pessoa, e no Centro da Visão Genival Barbosa de Lucena, localizado na cidade de Guarabira-PB, no período de julho de 2015 a setembro de 2016. Foram incluídos indivíduos com diabetes tipo 1 ou 2 e idade acima de 18 anos, após assinatura do termo de consentimento livre e esclarecido. O modelo de regressão logística foi utilizado para obtenção e adequação do modelo preditivo e todos os dados foram analisados no software estatístico R®, versão 3.2.0. Foram avaliados 80 pacientes diabéticos, dos quais 57,5% não tiveram indicação de IIV e 42,5% receberam indicação do tratamento em questão. Dos que tiveram EMD e indicação do tratamento com injeção de anti-VEGF, a média de idade foi de 60,65 anos, sendo 47,05% do sexo masculino e 52,94% do sexo feminino. Em relação àqueles sem edema macular, a média de idade foi de 58,02 anos, sendo 26,06% do sexo masculino e 73,91% do sexo feminino. Dentre os indivíduos que não tiveram indicação de injeção intravítrea de anti-VEGF, a maioria apresentou ausência de retinopatia ou retinopatia diabética não- proliferativa (RDNP) leve (69,56%). Já dentre os pacientes que necessitaram do tratamento, a maioria apresentou RDNP severa ou retinopatia proliferativa (79,41%). Foram identificados como fatores de risco para o edema macular diabético e, portanto, necessidade de IIV, o indivíduo ser aposentado (OR=5,22; p-valor0,05), ter histórico pessoal de retinopatia diabética (OR=20,27; p-valor 0,006) e histórico positivo para tratamento prévio com anti-VEGF (OR=23,23; p-valor 0,002). Concluímos, a partir dos resultados desta pesquisa, que um indivíduo diabético tenha baixa visual e apresente esses três fatores, deve ser encaminhado o quanto antes ao especialista, pois possui risco de apresentar EMD com necessidade de IIV de anti-VEGF, com 91,17% de acerto. Em suma, foi proposto um modelo de avaliação e de predição para servir como ferramenta coadjuvante na tomada de decisão, sobretudo do médico não-retinólogo, a fim de encaminhar para o diagnóstico e tratamento precoces os pacientes com retinopatia diabética e sua principal causa de baixa acuidade visual – o edema macular diabético –, o que pode ser decisivo na prevenção da perda visual irreversível nesses pacientes.

O fator de crescimento vascular endotelial (VEGF) desempenha um papel importante na angiogênese, induzindo a proliferação da célula endotelial, migração e sobrevivência. Com o intuito de promover a formação de novos vasos, e obter uma melhora na circulação colateral, VEGF tem sido utilizado para o tratamento de áreas de isquemia cardíaca, na doença cardiovascular. A manutenção da vitalidade pulpar com VEGF pode melhorar o prognóstico dos dentes que sofreram avulsão, prevenindo a perda precoce do dente. O propósito deste estudo foi desenvolver um modelo para se estudar o processo de revascularização da polpa dentária e avaliar o efeito do VEGF- 165 na angiogênese da polpa humana e na apoptose. Fatias de dente humano foram mantidas in vitro (cultura) com e sem VEGF (50ng/ml) durante 7 dias. Coloração de imuno-histoquímica para o Fator de Von Willebrand (Fator VIII) foi utilizada para quantificar o número de vasos sangüíneos no tecido pulpar. O número de vasos sangüíneos foi significantemente mais alto no grupo do VEGF (média -67.87) comparado ao grupo controle (média- 46.25, p< .05). O teste do Tunel foi usado para determinar o número de células apoptóticas nos grupos com e sem VEGF. Análises da expressão de VEGFR-2 por RT-PCR foram realizadas nas células endoteliais da microvasculatura da derme humana (HDMECs), células pulpares indiferenciadas (OD-21), células tipo odontoblasto de camundongo (MDPC-23) e macrófagos. A expressão de VEGFR-2 foi detectada nas HDMECs, mas não nas outras 3 linhas celulares. Quatro fatias de dente humano por camundongo imunodeprimido foram implantadas na região dorsal, subcutaneamente, pelo período de 7 dias. A vitalidade pulpar foi determinada pelas análises microscópica e imuno-histoquímica. O teste do Tunel foi usado para determinar o número de células apoptóticas. O modelo de angiogênese pulpar utilizando camundongos imunodeprimidos (SCID mouse model of pulp angiogenese) demonstrou ser um modelo viável para se estudar o processo de revascularização da polpa dentária humana. Levando-se em consideração os resultados obtidos neste estudo, sugere-se que o VEGF possa ter um efeito positivo na revascularização de dentes avulsionados. E que o modelo de angiogênese pulpar desenvolvido nesta pesquisa possa ser útil para responder a inúmeras novas questões experimentais na área de Endodontia. / The Vascular endothelial growth factor (VEGF) plays na important role in angiogenesis by inducing endothelial cell proliferation, migration, and survival. To promote new vessel formation and improve collateral circulation, VEGF has been used to treat ischemic heart areas in cardiovascular disease. Maintenance of pulp vitality with VEGF may improve the outcomes of avulsed teeth, preventing premature tooth loss. The purpose of this study was to develop a model system to study the process of dental pulp revascularization, and assess the effect of VEGF-165 in the human pulp angiogenesis and apoptosis. Human tooth slices were maintained in vitro for 7 days +/- VEGF (50ng/mL). Immunohistochemistry staining for Von Willebrand?s factor (Factor VIII) was used to quantify the number of vessels in pulp tissues. There was a significantly higher number of blood vessels in the VEGF group (67.8 Mean) compared to the control group (46.2 Mean, p<0.05). Tunel Assay was used to determine the number of apoptotic cells in +/- VEGF groups. RTPCR analyses of VEGFR-2 transcripts were used on human dermal microvascular endothelial cells (HDMECs), undifferentiated pulp cells (OD-21), mouse odontoblast-like cells (MDPC-23), and macrophages. VEGFR-2 expression was detected in HDMECs but not in the other 3 cell lines. Four tooth slices per mouse were subcutaneously implanted in the dorsal region for 7 days. Pulp vitality was determined by histological and immunohistochemical analysis. Also, Tunel Assay was used to determine the number of apoptotic cells. SCID mouse model of pulp angiogenesis demonstrated to be a good model system to study revascularization of human dental pulps. Taking into account the findings of this study, it is suggested that VEGF could have a positive effect in the revascularization of avulsed teeth. It is hoped that this pulp angiogenesis model be useful to answer a number of new experimental questions in the area of Endodontics.

A angiogênese é um processo essencial para a formação placentária. Dentre os muitos fatores envolvidos neste evento biológico, destaca-se de forma preponderante o Fator de Crescimento Endotelial Vascular (VEGF), cuja produção é controlada por genes, que podem apresentar variantes polimórficas diversas. As conseqüências funcionais destas variações não estão ainda completamente elucidadas, embora algumas tenham sido já associadas a um comprometimento da angiogênese em diversos sistemas biológicos. Por outro lado, alterações morfológicas na formação, distribuição e arranjo dos vasos placentários foram descritas na placenta de gestantes com distúrbios hiperglicêmicos como a Diabete mellitus e a hiperglicemia moderada. Particularmente nos casos de hiperglicemia moderada, a adaptação vascular observada parece estar relacionada à manutenção da capacidade funcional placentária. Na diabete, este achado foi correlacionado à expressão protéica e gênica atípica de determinados fatores angiogênicos na interface materno-fetal, enquanto que em outras condições hiperglicêmicas a provável participação destes fatores ainda não foi completamente determinada. Desta forma, partindo da hipótese de que as alterações placentárias vasculares em gestantes hiperglicêmicas podem ser decorrentes da expressão ou produção atípica do VEGF e que esta por sua vez pode ser decorrente de polimorfismos gênicos, o objetivo deste estudo foi avaliar polimorfismos do gene deste fator de crescimento em placentas de gestantes com distúrbios hiperglicêmicos. Foi realizada a análise dos polimorfismos -460C/T, -634G/C e 936C/T do gene do VEGF em fragmentos de vilos coriônicos de gestantes normoglicêmicas, com hiperglicemia moderada e com Diabete mellitus prévia à gestação, denominados respectivamente de grupo IA, IB e IIB. Todo o material foi fornecido pelo Serviço de Diabetes e Gravidez da Faculdade de Medicina de Botucatu UNESP. A genotipagem dos polimorfismos do VEGF foi realizada através da Reação de Polimerase em Cadeia (PCR), seguida de digestão por enzima de restrição. As freqüências de distribuição genotípica e alélica dos polimorfismos do VEGF foram comparadas entre os grupos hiperglicêmicos (IB e IIB) e 6 o grupo controle. As freqüências genotípicas estavam em equilíbrio de Hardy-Weinberg. Foram observadas diferenças significantes nas freqüências genotípicas e alélicas do polimorfismo -460C/T do gene do VEGF em placentas de gestantes hiperglicêmicas (grupos IB e IIB) quando comparadas entre si, mas não com o grupo controle. Diferenças estatísticas nas freqüências genotípicas e alélicas do polimorfismo -634G/C VEGF foram detectadas nos grupos hiperglicêmicos em geral comparados ao grupo controle. Não foram identificadas diferenças nas freqüências genotípicas e alélicas do polimorfismo 936C/T do VEGF entre os grupos avaliados. Em conjunto, nossos achados sugerem que a resposta placentária a distúrbios hiperglicêmicos pode estar correlacionada à presença dos dois polimorfismos: -460C/T e 634C/G. No entanto, nenhuma correlação direta funcional positiva foi observada com a angiogênese observada nas placentas de gestações associadas à hiperglicemia moderada. / The angiogenesis is a process essential for placental formation. Among the many factors involved in this biological event, the factor most active is the vascular endothelial growth factor (VEGF), whose production is controlled by genes, which may present different polymorphic variants. The functional consequences of these changes are not yet fully elucidated, although some have been associated with an impairment of angiogenesis in various biological systems. Moreover, morphological changes in distribution and arrangement of the placental vessels were described in the placenta of pregnant women with hyperglycemic disorders such as diabetes mellitus and mild hyperglycemia. Particularly in cases of mild hyperglycemia, the observed vascular adaptation seems to be related to the maintenance of functional placenta. In diabetes, this finding was correlated with the atypical gene and protein expression of certain angiogenic factors in maternalfetal interface, while in other hyperglycemic conditions the likely participation of these factors has not been fully determined. Thus, based on the hypothesis that placental vascular changes in hyperglycemic pregnant women may be due to atypical expression or production of VEGF and that this in turn may be caused by gene polymorphisms, the objective of this study was to assess polymorphisms of this gene factor growth in placentas of women with hyperglycemic disorders. The analysis of the polymorphisms of the VEGF gene was performed in fragments of chorionic villi of normoglycemic, mild hyperglycemic and diabetic pregnant women, respectively named of group IA, IB and IIB. All specimens were provided by the Serviço de Serviço de Diabetes e Gravidez da Faculdade de Medicina de Botucatu UNESP. Genotyping of the VEGF gene polymorphisms -460C/T, -634G/C and 936C/T was done by the polymerase chain reaction (PCR) and restriction fragment length polymorphism methods. The frequency of VEGF alleles and genotype distribution were compared among the hyperglycemic and control groups. The genotype frequencies were in Hardy-Weinberg equilibrium. We have observed significant differences of VEGF -460C/T polymorphism between the hyperglycemic placentas (IB X IIB), but not compared to control group. Statistical differences in the genotypic and allelic frequencies of C of VEGF -634G/C were detected 8 in hyperglycemic groups in general in comparison to controls. There were no significant differences in allelic or genotype frequencies among the evaluated groups. Taken together our findings suggest that the placental response to hyperglycemic disturbs may be correlated to the presence of both -460C/T and -636C/G polymorphism of the VEGF gene. However, no direct functional correlation was detected between these VEGF polymorphisms and the intense angiogenesis seen in placentas of mild hyperglycemiaassociated gestation.

Made available in DSpace on 2014-07-29T15:30:41Z (GMT). No. of bitstreams: 1 DissertacaoElianeDuarteMotaIPTSP.pdf: 4130183 bytes, checksum: 334a4dd3d5b4498f488ee03e5a9d338a (MD5) Previous issue date: 2012-03-23 / BACKGROUND: Colorectal adenocarcinoma (CRA) is a worldwide distributed pathology, and lymph node metastasis is associated with a poor prognostic outcome. Angiogenesis and lymphangiogenesis are correlated with metastasis. Vascular endothelial growth factor C (VEGF-C) and Cyclooxygenase 2 (COX-2) are molecules directly involved in those processes. We investigated the possible association of the expression of VEGF-C and COX-2 with clinical/pathology features and five year survival rate. MATERIALS AND METHODS: One hundred and thirty four cases of CRA from a Cancer Reference Hospital were randomly selected. The expression of VEGF-C and COX-2 was detected by immunohistochemistry and a univariate analysis was applied to evaluate the association between their expression and clinical stages, metastasis, and/or survival. RESULTS: COX-2 expression was observed in 98.67% of the adenocarcinoma cases while VEGF-C was found in 54.48% of the cases. COX-2 was highly expressed by all clinical stages of CRA, but its expression was not associated with LN metastasis, tumor infiltration or five years survival. A correlation was observed between LN metastasis and VEGF-C positivity (p=0.02) and clinical stages of the disease. The range of VEGF-C expressions was from 34.6% to 88.9% in stages 1 through 4, respectively. CONCLUSION: The majority of the CRA cases were positive for COX-2. It was observed association between the expression of VEGF-C and LN metastasis as well as with clinical stages of the disease, although no association was found to the overall five year survival rate. / INTRODUÇÃO: O adenocarcinoma colorretal (ACC) é uma doença de distribuição mundial e a metástase para linfonodos regionais está associada com pior prognóstico. A angiogênese e a linfangiogênese estão relacionadas com metástases. O Fator de crescimento endotelial vascular C (VEGF-C) e a Ciclooxigenase 2 (COX-2) são moléculas diretamente envolvidas nestes processos. Investigamos a possível associação da expressão de VEGF-C e COX-2 com características clínico/patológicas e a sobrevida em cinco anos. MÉTODOS: Cento e trinta e quatro casos de adenocarcinoma colorretal foram selecionados randomicamente. A expressão de COX-2 e VEGF-C foi detectada por imuno-histoquímica e as possíveis associações com aspectos clínicos e patológicos investigados. RESULTADOS: A expressão de COX-2 foi positiva em 133 (98,67%) pacientes e a expressão de VEGF-C foi encontrada em 73 (54,48%) pacientes. Não foram observadas associações significativas entre a expressão de COX-2 e metástases para linfonodos, invasão tumoral e nem com a sobrevida global em cinco anos. Quando a avaliação da expressão de VEGF-C foi realizada segundo Soumaoro et al, 2006, não associação com os aspectos estudados (p>0,05) e quando a expressão foi avaliada segundo Agaki et al., 2000, houve associação com metástases para linfonodos regionais o grau histológico do tumor (p=0,01) e com o estadiamento clínico (p=0,005). CONCLUSÃO: A maioria dos casos de ACR foram positivos para COX-2. Foram observadas associações entre a expressão de VEGF-C e metástases para linfonodos, bem como com os estadios clínicos da doença, embora, não tenha sido encontrada associação com a sobrevida em cinco anos.

A endometriose, caracterizada por crescimento de tecido endometrial fora da cavidade uterina, é responsável por sintomas álgicos com grande impacto na qualidade de vida da paciente. Várias linhas de medicações têm sido estudadas para essa o tratamento da endometriose, já que a cirurgia não é o tratamento de escolha sempre e, quando realizado, não é um tratamento definitivo. O conhecimento da patogenia da endometriose é fundamental para o estudo de novas classes de medicações. Uma delas, os fatores inibitórios da angiogênese, tem papel fundamental no estabelecimento e crescimento de lesões de endometriose. Neste estudo, buscamos a influência da Bevacizumab, droga anti-fator de crescimento endotelial (anti-VEGF), utilizada em duas dosagens diferentes, em endometriose peritoneal induzida em ratas, modelo animal já bem estabelecido para o estudo de endometriose. As ratas permaneceram sob tratamento durante 4 semanas, após as quais foram sacrificadas, sendo as lesões e o corno uterino remanescente retirados para posterior avaliação. Foi realizada avaliação da área das lesões de cada rata, da presença de tecido endometrial à microscopia, da positividade para o anticorpo antiVEGF na imunohistoquímica e da expressão gênica de PCNA, MMP9, Tp63 e VEGFA. O bevacizumab atuou reduzindo a área das lesões nos grupos que receberam medicação (p=0,002) e reduzindo a expressão gênica para Tp63 nas lesões (p=0,04). Não houve resultado significativo nas outras avaliações / Endometriosis, characterized by growth of endometrial tissue outside the uterine cavity, is responsible for painful symptoms with great impact on the quality of life of women. Several lines of medications have been studied for endometriosis\'s treatment, since surgery is not always the treatment of choice and, when done, it is not a definitive treatment. Knowing the pathogenesis of this disease is fundamental for the study of new classes of medications. One of them, the inhibitory factors of angiogenesis, plays a fundamental role in the establishment and growth of endometriosis lesions. In this study, we sought the influence of Bevacizumab, an anti-endothelial growth factor (anti-VEGF) drug, used in two different dosages, in peritoneal endometriosis induced in rats, an animal model well established for the study of endometriosis. The rats remained under treatment for 4 weeks, after which they were sacrificed, with the remaining lesions and uterine horn being removed for further evaluation. An evaluation of the lesion area of each rat, the presence of endometrial tissue under microscopy, the positivity of the anti-VEGF antibody in immunohistochemistry and the gene expression of PCNA, MMP9, Tp63 and VEGFA were performed. Bevacizumab worked by reducing the area of the lesions in the groups receiving medication (p = 0.002) and reducing the gene expression for Tp63 in the lesions (p = 0.04). There was no significant result in the other evaluations

En impesanteur réelle ou simulée, l'absence de gravité oriente les cellules souches multipotentes de la moelle osseuse à privilégier l’adipogénèse aux dépens de l’ostéogénèse. Ceci entraine une perte osseuse fréquemment rencontrée chez les astronautes lors des vols spatiaux. Parmi les traitements médicamenteux existants, le strontium possède une double action, à la fois activatrice de l'ostéogénèse et inhibitrice de l’adipogénèse. Dans ce contexte, l’objectif général de ce projet de thèse a été de démontrer que le strontium peut être un bon candidat pour contrecarrer les effets de l'impesanteur. Nous nous sommes particulièrement intéressés aux petites protéines Rho de la famille des GTPases, qui contrôlent le cytosquelette de la cellule, sa tension cellulaire ainsi que de nombreuses voies de signalisation. D'après la littérature, ces signalisations ont aussi été montrées comme étant liées aux voies du VEGF ou au statut oxydant des cellules, impliquées dans l’engagement des cellules souches multipotentes. La première partie de cette étude a permis de montrer l’effet antioxydant du strontium sur la lignée C3H10T1/2 en tant qu’activateur de la GTPase RhoA, permettant l’induction du gène clé de la réponse antioxydante, Nrf2, et par conséquent l’inhibition de l’adipogénèse. La deuxième partie a utilisé comme modèle des cultures 3D sur microbilles de polystyrène recouvertes de collagène pour la culture d'adipocytes, avec l'ajout de minéraux d’apatite pour la culture d'ostéoblastes. Ces billes ont été mises en culture dans un bioréacteur simulant l’impesanteur (Rotating Wall Vessel, RWV, NASA). Sous strontium, cette culture en RWV a favorisé l’ostéogenèse et limité l’adipogénèse, validant l'utilisation du strontium en tant que répresseur des effets délétères de l'impesanteur sur l’os. Nous avons montré que cet effet peut être expliqué d'une part par la stimulation des activités des deux GTPases RhoA et Rac1, et d'autre part par l’induction de l’isoforme matricielle du VEGF chez les ostéoblastes. En revanche, chez les adipocytes, les deux formes solubles et matricielles du VEGF étaient inhibées. De plus, le strontium a induit l'expression du récepteur Flt-1 qui favoriserait l’ostéogénèse. L’ensemble de ces données nous a permis de mieux comprendre les cinétiques de RhoA et Rac1 pendant l’ostéoblastogénèse et l’adipogénèse, ainsi que le rôle important des voies de signalisation du VEGF et du statut oxydant dans l’orientation de la différenciation des cellules multipotentes. Le strontium s’est révélé être un bon inducteur ostéogénique dont les applications fondamentales peuvent amener de nouvelles voies d’utilisation / In real or simulated microgravity, the absence of gravity directs multipotent stem cells from bone marrow to favor adipogenesis at the expense of osteogenesis. This causes a bone loss, commonly found in astronauts during spaceflight. Among existing drug therapies, strontium has a double action, both activating osteogenesis and inhibiting adipogenesis. In this context, the general objective of this project was to demonstrate that strontium may be a good candidate to counteract the microgravity effects. We were particularly interested in small proteins Rho of the GTPases family, which control cell cytoskeleton, cell tension and many signaling pathways. According to the literature, these pathways were also shown to be related to the VEGF singaling or the cell oxidative status, involved in the multipotent stem cells commitment. The first part of this study demonstrated the strontium antioxidant effect on the C3H10T1/2 line as an activator of the GTPase RhoA, allowing the induction of the key antioxidant response gene, Nrf2, and therefore inhibiting adipogenesis. The second part used a 3D cultures model on polystyrene microbeads coated with collagen for the adipocytes culture, and with mineral apatite added for osteoblasts culture. These beads were cultivated in a bioreactor simulating microgravity (Rotating Wall Vessel, RWV, NASA). With strontium, this RWV culture promoted osteogenesis and limited adipogenesis, validating the use of strontium as a repressor of the microgravity deleterious effects on bone. We have shown that this effect can be explained first by the stimulation of both GTPases RhoA and Rac1 activities, and secondly by the induction of the matrix-bound VEGF isoform in osteoblasts. In contrast, in adipocytes, both soluble and matrix-bound VEGF isoforms were inhibited. Moreover, strontium induced Flt-1 receptor expression, which would promote osteogenesis. All these data allowed us to better understand the RhoA and Rac1 kinetics during osteoblastogenesis and adipogenesis, and the important role of VEGF signaling pathways and oxidative status in directing multipotent cells differentiation. Strontium was found to be a good osteogenic inductor whose core applications can bring new ways of use