L'épilepsie du lobe temporal est fréquente et souvent pharmacorésistante. L'épileptogenèse est imputée à la mort neuronale, l'inflammation ou au déséquilibre de la neurotransmission. Récemment, la perméabilité vasculaire a été reconnue comme une cause de crises d'épilepsie. Dans un modèle d'épilepsie chronique, nous avons montré une angiogenèse associant vascularisation, surexpression de VEGF, perte de protéines des jonctions serrées et perméabilité de la BHE. L'observation des immunoglobulines G (IgGs) comme marqueurs de perméabilité vasculaire nous a permis de découvrir que les IgGs s'accumulent dans les neurones. Nous avons alors étudié le rôle de ces protéines dans l'épileptogenèse. Ensuite, afin de corréler la perméabilité de la BHE à l'épileptogenèse, nous avons étudié le kindling, un modèle dans lequel les crises sont induites mais pas spontanées. Nous n'avons observé aucun remaniement vasculaire, si ce n'est une dérégulation transitoire de deux protéines de jonctions serrées. La comparaison de ces deux modèles confirme la contribution de la dérégulation de la BHE dans la genèse des crises et la désigne comme une nouvelle cible thérapeutique. / Temporal lobe epilepsy is the most frequent form of pharmacoresistant epilepsies. Epileptogenesis is commonly imputed to neuronal loss, inflammation and an imbalance in neurotransmission. Now, vascular permeability was shown to participate in epileptic seizures generation. In a model of chronic epilepsy, we showed a neo-vascularisation associated with VEGF over expression, loss of tight junction proteins and BBB permeability. The use of immunoglobulins G (IgGs) as markers of permeability vascular allowed us to discover that the IgGs accumulates in neurones. We then studied the role of these proteins in epileptogenesis. Then, to correlate BBB permeability to epileptogenesis, we studied the kindling, a model in which seizures are induced but never spontaneous. We observed no vascular remodeling, except for a transient deregulation of tight junctions proteins. The comparison of these models confirms the contribution of BBB deregulation and points it as new therapeutic target.

Submitted by Nadir Basilio (nadirsb@uninove.br) on 2018-06-18T21:18:10Z No. of bitstreams: 1 Anna Cristina de Farias Marques.pdf: 2073138 bytes, checksum: 63fce77ba3e8c96e01965f2b4cecc62c (MD5) / Made available in DSpace on 2018-06-18T21:18:10Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Anna Cristina de Farias Marques.pdf: 2073138 bytes, checksum: 63fce77ba3e8c96e01965f2b4cecc62c (MD5) Previous issue date: 2015-12-18 / This study investigates the effect of low-level laser therapy (LLLT) on collagen type I and III, matrix metalloproteinase (MMP), and vascular endothelial growth factor (VEGF) in experimentally induced tendinopathy in female aged rats. Tendinopathy was induced by collagenase peritendinous of the Achilles tendon. Forty-two Wistar rats (Norvegicus albinus) were used; groups consisted of 36 aged animals (18 months old; mean body weight, 517.7 ± 27.54 g) and 6 adult animals (12 weeks old; mean body weight, 266 ± 19.30 g). The animals were randomlydivided in three groups: control, aged tendinopathy, and aged tendinopathy LLLT; the aged groups were subdivided according to experimental periods: 7, 14, and 21 days. LLLT involved a gallium-arsenide-aluminum laser (Theralaser, DMC®) with active medium operating at wavelength 830 ± 10 nm, 50 mW power, 0.028 cm2 laser beam, 107 J/cm2 energy density, 1.7 w/cm2 power density, and 6 J of energy, with a frequency of 3 times per week, until euthanasia. VEGF, MMP-3, and MMP-9 were analyzed by immunohistochemistry, and collagen type I and III by Sirius red. LLLT increased the deposition of collagen type I and III in a gradual manner, with significant differences relative to the group aged tendonitis (p<0.001), and in relation to VEGF (p<0.001); decreased expression of MMP-3 and 9 was observed in group aged tendinopathy (p<0.001). LLLT, therefore, increased the production of collagen type I and III, downregulated the expression of MMP-3 and MMP-9, and upregulated that of VEGF, with age and age-induced hormonal deficiency. / O objetivo deste estudo foi investigar O Efeito da terapia Laser de baixa intensidade no Colágeno tipo I e III, Metaloproteinase e VEGF em Modelo Experimental de Tendinopatia, em ratas fêmeas idosas. A colagenase foi induzida na região peritendínea no tendão Calcâneo dos animais. Quarenta e duas ratas Wistar (Norvegicus albinus) foram utilizadas no estudo, com grupos consistindo de 36 animais idosos (18 meses de idade; com média da massa, 517.7 ± 27.54 g) e 6 animais adultos (12 semanas de idade; média da massa, 266, 19:30 0 ± g). Os animais foram randomizados e divididos em três grupos, Controle, tendinopatia idoso e tendinopatia Laser idoso, e subdividido em três grupos experimentai, 7, 14 e 21 dias. O tratamento com Laser de baixa intensidade foi aplicado utilizando um Laser Arseneto de Galium e Alumínio (AsGaAl) (Theralaser, DMC®) operando no comprimento de onda de 830nm (±10nm), 50 mW de potência, saída do feixe de 0,028 cm2, densidade de energia de 107J /cm2, densidade de potência 1,7 w/cm2 e energia de 3 J, com uma frequência de 3 vezes por semana, até a data da eutanásia (7, 14 e 21 dias). Foram analisados VEGF e MMP 3 e 9 por meio de Imunohistoquímica e Colágeno tipo I e III por Sirius red. Os resultados sugerem que a Terapia a Lesar de Baixa Intensidade foi capaz de aumentar os níveis de Colágeno tipo I e III de maneira gradual e com significante diferença no grupo Tendinpatia Idoso (p<0,001), isso pode ser observado em relação ao VEGF (p<0.001), foi também observado diminuição da expressão de MMP 3 e MMP 9 em relação ao grupo tendinopatia Idoso, com diferença estatística (p<0,001). Nós concluímos que a terapia Laser de Baixa Intensidade foi capaz de diminuir a produção de Colágeno tipo I e III, reduzir a expressão de MMP 3 e 9, e aumentar a expressão de VEGF, mesmo nas ratas fêmeas idosas com deficiência hormonal causada pela idade.

Angiogenese ist an physiologischen Vorgängen wie der Embryogenese und der Wundheilung, aber auch bei pathologischen Abläufen wie bei Neoplasien und der Makula Degeneration beteiligt. Im Bereich des Tissue Engineering ist sie ebenfalls unersetzlich und ausschlaggebend für den Erfolg einer Gewebetransplantation. In dieser Studie wurde an 40 männliche Charles Lewis-Ratten das arteriovenöse (AV-) Loop-Modell angewandt, um spontane Angiogenese unter Einfluss wachstumshemmender Faktoren in vivo zu untersuchen. Der AV-Loop wurde in einer mit Fibrin gefüllten Teflonkammer gebettet. Für die statistische Auswertung wurde der Student t-Test mit ungepaarten Stichproben angewandt und das Signifkanzniveau betrug α=0,05. Multiple Testungen wurden nach der Bonferroni-Holm-Methode angepasst. In der Anfangsphase der Studie wurde der zeitliche Verlauf der AV-Loop assoziierten Angiogenese an 16 Tieren untersucht. Es wurde ein signifikanter Anstieg der Gefäßfläche über einen Zeitraum von 5 (n=2), 10 (n=3) und 15 Tagen (n=3) beobachtet und ebenfalls eine signifikant höhere Gefäßanzahl an Tag 15 im Vergleich zu Tag 5. Acht Tiere konnten nicht in die Studie miteingeschlossen werden infolge von Thrombosierungen des Loops. Diese erwartete Verlustrate trat aufgrund Lernkurve dieses komplexen mikrochirurgischen Modells, insbesondere zu Beginn des Projektes, auf. In der zweiten Phase der Studie wurde die Neoangiogenese auf drei unterschiedliche Verfahren gehemmt. Die Implantationszeit betrug bei allen Gruppen 15 Tage. In der ersten Gruppe (n = 6) wurde ein Inhibitor des Wachstumfaktors VEGF (vascular endothelial growth factor) intravenös appliziert, nämlich der monoklonale Antikörper Bevacizumab. Hier konnte ein signifikanter Unterschied zur Kontrollgruppe (n = 6) bei der Gefäßfläche (94 432 ± 17 903 μm2 gegenüber 268 682 ± 63 575 μm2) und ebenfalls bei der Gefäßdichte (18 ± 5 Gefäße pro mm2 versus 40 ± 9 Gefäße pro mm2 in der Kontrollgruppe) gemessen werden. Dieser Befund ließ darauf schließen, dass die Neovaskularisation durch VEGF vermittelt wurde. Die direkte Bestrahlung von 2 Gy auf den venösen Graft in der zweiten Versuchsgruppe (n = 7) löste eine signifikante Verringerung von Gefäßanzahl (311 ± 73), -fläche (43 137 ± 10 225 μm2) und –dichte (15 ± 7 Gefäße pro mm2) im Vergleich zur Kontrollgruppe (776 ± 123, 268 682 ± 63 575 μm2 und 40 ± 9 Gefäße pro mm2) aus. Dieses Verfahren hatte somit starken Einfluss auf den Reifeprozess der Neoangiogenese. Bei der Kombinationsgruppe (Bevacizumab und Bestrahlung, n = 5) konnte nur bei der Gefäßfläche ein signifikant geringerer Unterschied in der Angiogenese erhoben werden. Dies ließ vermuten, dass das hier zu findende physiologische und somit geordnete Gefäßwachstum nicht auf diese hemmende Methode anspricht, wie es bei chaotischen Tumorgefäßsystemen der Fall ist und der vermutete Synergismus ausbleibt. Zusätzlich wurde im Zuge dieser Studie ein standardisiertes Auswertungsprogramm etabliert. Dabei handelt es sich um ein selbstentwickeltes Computerprogramm, das nicht nur die hier gesammelten aber auch 2-D-Aufnahmen anderer Angiogenese-Modelle benutzerunabhängig und standardisiert evaluieren kann. Zusammenfassend kann gesagt werden, dass das AV-Loop-Modell sich ausgezeichnet für die Untersuchung der Angiogenese im gesunden Gewebe eignet. Es bietet die Möglichkeit verschiedene angiogene und anti-angiogene Faktoren zu applizieren sowie deren Einfluss auf eine physiologische Neovaskularisation zu beobachten.:1 EINLEITUNG 1 1.1 ZIELSETZUNG DIESER ARBEIT 3 2 LITERATURÜBERSICHT 5 2.1. ANGIOGENESE 5 2.1.1 PHYSIOLOGIE 5 2.1.1.1 Bildung von Blutgefäßen 5 2.1.1.2 Embryogenese 8 2.1.1.3 Angiogenese und Wundheilung 9 2.1.2 TUMOR-ASSOZIIERTE ANGIOGENESE 11 2.2 TISSUE ENGINEERING 22 2.3 DAS ARTERIOVENÖSE (AV) LOOP-MODELL 22 2.4 AUSWERTUNG VON ANGIOGENESEPROZESSEN 23 3 MATERIAL UND METHODEN 24 3.1 TIERE UND HALTUNG 24 3.2 OPERATIVE EINGRIFFE 24 3.2.1 KAMMER UND MATRIX 24 3.2.2 HERSTELLUNG DES AV-LOOPS 25 3.2.3 BESTRAHLUNG 29 3.3 EXPLANTATION 29 3.3.1 PERFUSION MIT INDIA INK 29 3.3.2 PERFUSION MIT MICROFIL® 31 3.4. HISTOLOGISCHE UND IMMUNHISTOLOGISCHE METHODEN 32 3.4.1 VORBEREITUNG DER SCHNITTE 32 3.4.2 HÄMATOXYLIN-EOSIN-FÄRBUNG 33 3.4.3 LEKTINFÄRBUNG 34 3.5 DATENVERARBEITUNG 36 3.5.1 MIKROSKOPISCHE AUFZEICHNUNGEN 36 3.5.2 AUSWERTUNG DER HISTOLOGISCHEN SCHNITTE 36 3.5.3 AUFNAHMEN DER MIKRO-CT-BILDER 41 3.5.4 AUSWERTUNG DER MIKRO-CT-BILDER 42 3.5.5 POWER ANALYSE 43 3.5.6 STATISTISCHE AUSWERTUNGEN 43 3.6 VERWENDETES MATERIAL 44 4 ERGEBNISSE 47 4.1 AV-LOOP-ASSOZIIERTE ANGIOGENESE 48 4.2 ZEITLICHER VERLAUF DER AV-LOOP-ASSOZIIERTEN ANGIOGENESE 50 4.3 HISTOMORPHOMETRISCHE ANGIOGENESE-CHARAKTERISIERUNG MITTELS HE- UND LEKTINFÄRBUNG 52 4.4 AUTOMATISCHE, COMPUTERGESTÜTZTE UND UNTERSUCHERUNABHÄNGIGE ANGIOGENESE- QUANTIFIZIERUNG 53 4.5 EINFLUSS VON VEGF AUF AV-LOOP-ANGIOGENESE 58 4.6 EINFLUSS VON BESTRAHLUNG AUF DIE NEOVASKULARISATION IM AV-LOOP-MODELL 62 4.7 WECHSELWIRKUNG VON VEGF UND IONISIERENDER BESTRAHLUNG AUF DIE ANGIOGENESE IM AV-LOOP-MODELL 65 5 DISKUSSION 71 6 ZUSAMMENFASSUNG 81 7 SUMMARY 83 8 LITERATURVERZEICHNIS 85 9 ANHANG 95 9.1 PROTOKOLL ZUR HERSTELLUNG DER PUFFER 95 9.1.1 CITRATPUFFER 95 9.1.2 TRISPUFFER 95 9.2 TABELLEN 95 9.3 ABBILDUNGEN 95 10 DANKSAGUNG 98 / Angiogenesis is evident in both physiological and pathological processes in the body. It is involved in events of embryogenesis and in wound healing as well as in neoplastic growth and macula degeneration. In the field of Tissue Engineering neovascularisation plays an irreplaceable role and determines the result of the transplantation. Here, an arterio-venous loop (AV-loop) model embedded in fibrin- filled teflon chambers in 40 Charles Lewis rats was applied to conduct in vivo investigations of the physiological processes of vessel growth in healthy tissue and to understand neovascularisation under the impact of anti-angiogenic factors such as monoclonal anti-bodies and ionizing radiation (IR). For statistical analysis the unpaired t-test was applied with a significance level of α = 0,05. Multiple testing was adapted according to the Bonferroni-Holm method. At the beginning of the study the AV-loop induced angiogenesis was examined on 16 animals and consecutively characterized. A significant increase in vessel area was observed over a time frame of 5 (n=2), 10 (n=3) and 15 days (n=3). Additionally the vessel count has increased significantly at day 15 in comparison to day 5. Eight of the animals had to be excluded due to thrombosis of the loop, which was expected due to the complex microsurgical model, especially at the onset of the project. In the second phase of the study three different anti-angiogenic procedures were investigated. Time of implantation was 15 days. In group one (n = 6) the monoclonal antibody of VEGF (vascular endothelial growth factor) named Bevacizumab was applied intravenously. As a result a significant lower vessel area (94 432 ± 17 903 μm2) and density (18 ± 5 vessels per mm2) could be measured in comparison to the control group (n = 6; 268 682 ± 63 575 μm2 respectively 40 ± 9 vessels per mm2). We concluded from these results that angiogenesis was mediated by VEGF. In comparison to the controlgroup direct IR of 2 Gy led in group two (n = 7) to a significant decrease in vessel number (311 ± 73 versus 776 ± 123), area (43137±10225μm2 versus 268682±63575μm2) and density (15±7 versus 40±9 vessels per mm2). Therefore this procedure has an obvious impact on the vessel maturation. In the combined group (n = 5) of both anti-angiogenic procedures (anti- VEGF and IR) a significant decrease was only evident in the vessel area. We assumed that this physiological and accordingly organized angiogenesis does not respond to the applied inhibiting methods, as it is observed in tumor vessel growth. Additionally, an evaluation program was established with the goal of designing a user-independent and standardized computer program to measure 2-D-images of both this and other angiogenesis models. In summary the AV-loop presents a proficient model to investigate angiogenesis in healthy tissue. It offers a variety of possibilities to apply pro- and anti-angiogenic factors and to examine their impact in vivo.:1 EINLEITUNG 1 1.1 ZIELSETZUNG DIESER ARBEIT 3 2 LITERATURÜBERSICHT 5 2.1. ANGIOGENESE 5 2.1.1 PHYSIOLOGIE 5 2.1.1.1 Bildung von Blutgefäßen 5 2.1.1.2 Embryogenese 8 2.1.1.3 Angiogenese und Wundheilung 9 2.1.2 TUMOR-ASSOZIIERTE ANGIOGENESE 11 2.2 TISSUE ENGINEERING 22 2.3 DAS ARTERIOVENÖSE (AV) LOOP-MODELL 22 2.4 AUSWERTUNG VON ANGIOGENESEPROZESSEN 23 3 MATERIAL UND METHODEN 24 3.1 TIERE UND HALTUNG 24 3.2 OPERATIVE EINGRIFFE 24 3.2.1 KAMMER UND MATRIX 24 3.2.2 HERSTELLUNG DES AV-LOOPS 25 3.2.3 BESTRAHLUNG 29 3.3 EXPLANTATION 29 3.3.1 PERFUSION MIT INDIA INK 29 3.3.2 PERFUSION MIT MICROFIL® 31 3.4. HISTOLOGISCHE UND IMMUNHISTOLOGISCHE METHODEN 32 3.4.1 VORBEREITUNG DER SCHNITTE 32 3.4.2 HÄMATOXYLIN-EOSIN-FÄRBUNG 33 3.4.3 LEKTINFÄRBUNG 34 3.5 DATENVERARBEITUNG 36 3.5.1 MIKROSKOPISCHE AUFZEICHNUNGEN 36 3.5.2 AUSWERTUNG DER HISTOLOGISCHEN SCHNITTE 36 3.5.3 AUFNAHMEN DER MIKRO-CT-BILDER 41 3.5.4 AUSWERTUNG DER MIKRO-CT-BILDER 42 3.5.5 POWER ANALYSE 43 3.5.6 STATISTISCHE AUSWERTUNGEN 43 3.6 VERWENDETES MATERIAL 44 4 ERGEBNISSE 47 4.1 AV-LOOP-ASSOZIIERTE ANGIOGENESE 48 4.2 ZEITLICHER VERLAUF DER AV-LOOP-ASSOZIIERTEN ANGIOGENESE 50 4.3 HISTOMORPHOMETRISCHE ANGIOGENESE-CHARAKTERISIERUNG MITTELS HE- UND LEKTINFÄRBUNG 52 4.4 AUTOMATISCHE, COMPUTERGESTÜTZTE UND UNTERSUCHERUNABHÄNGIGE ANGIOGENESE- QUANTIFIZIERUNG 53 4.5 EINFLUSS VON VEGF AUF AV-LOOP-ANGIOGENESE 58 4.6 EINFLUSS VON BESTRAHLUNG AUF DIE NEOVASKULARISATION IM AV-LOOP-MODELL 62 4.7 WECHSELWIRKUNG VON VEGF UND IONISIERENDER BESTRAHLUNG AUF DIE ANGIOGENESE IM AV-LOOP-MODELL 65 5 DISKUSSION 71 6 ZUSAMMENFASSUNG 81 7 SUMMARY 83 8 LITERATURVERZEICHNIS 85 9 ANHANG 95 9.1 PROTOKOLL ZUR HERSTELLUNG DER PUFFER 95 9.1.1 CITRATPUFFER 95 9.1.2 TRISPUFFER 95 9.2 TABELLEN 95 9.3 ABBILDUNGEN 95 10 DANKSAGUNG 98

Das Mammakarzinom gehört zu den häufigsten Krebserkrankungen der Frau. Die Prognose einer Brustkrebserkrankung richtet sich nach den Stadien der TNM-Klassifikation, dabei ist die Wahrscheinlichkeit eines fortgeschrittenen Stadiums bei später Diagnosestellung erhöht. Daher ist insbesondere die Früherkennung der Erkrankung Gegenstand klinischer Forschung. Das Risiko, an Brustkrebs zu erkranken, liegt in der Normalbevölkerung bei 7-10%. Eine individuelle Erhöhung des Risikos findet sich bei familiärer Belastung bezüglich Brustkrebs, sowie einer früheren Erkrankung an einer Präkanzerose wie des Carcinoma ductale in situ (DCIS), des Carcinoma lobulare in situ (CLIS) und der atypischen ductalen Hyperplasie (ADH). Besonderes Augenmerk in der Krebsforschung liegt zur Zeit auf dem Zusammenhang zwischen Tumorwachstum und der Bildung neuer Gefäße, der Angiogenese. Diese Neubildung von Kapillaren ist in hohem Maße von der Ausschüttung bestimmter Wachstumsfaktoren abhängig, von denen der vaskuläre endotheliale Wachstumsfaktor (VEGF) aufgrund seiner Endothelspezifität der mitogenen Wirkung große Bedeutung besitzt. Aber auch der in fast allen Geweben vorkommende und für viele physiologische Prozesse entscheidende Insulin-like growth factor-1 (IGF-1) und seine Bindungs-proteine (IGFBP-1 bis IGFBP-7) scheinen bei der Tumorentwicklung eine wichtige Rolle zu spielen. Zahlreiche klinische Studien beschäftigen sich daher mit dem Vergleich von Serum-oder Plasmakonzentrationen an VEGF, IGF-1 und seiner Bindungsproteine zwischen Krebspatienten und Kontrollgruppen. Dabei sind für Brustkrebspatientinnen erhöhte VEGF- und IGF-1-Konzentrationen und erniedrigte IGFBP-3-Konzentrationen beschrie-ben. Auch für Patientinnen mit einer DCIS-Erkrankung sind erhöhte VEGF-Konzentrationen gefunden worden. Diese Untersuchung beschäftigt sich mit der Wertigkeit einer Messung der genannten Wachstumsfaktoren zur regelmäßigen Untersuchung von Brustkrebsrisikopatientinnen in der Klinik. Dafür wurde ein Kollektiv von 106 Frauen untersucht, die entweder aufgrund einer familiären Belastung oder der Erkrankung an einer Präkanzerose in der Spezial-sprechstunde der Frauenklinik der Charité behandelt bzw. beraten wurden. Für einen Vergleich innerhalb der Hauptgruppen "familiäre Belastung" und "Präkanzerose" wurde eine Einteilung in Subgruppen nach Menopausenstatus, in der Gruppe der familiär belasteten Frauen zusätzlich nach Höhe des berechneten Risikos und in der Gruppe der Patientinnen mit Präkanzerose zusätzlich nach Antiöstrogenbehandlung und Familienanamnese bezüglich Brustkrebs vorgenommen. Als Kontrollgruppen dienten ein Kollektiv von Mammakarzinompatientinnen sowie ein Normalkollektiv aus 234 gesunden Frauen ohne ersichtliche Risiken. Die VEGF, IGF-1 und IGFBP-3-Konzentrationen wurden mittels eines Enzyme-linked Immunoassays (ELISA) im Serum gemessen und verglichen. Dabei fanden sich für VEGF und IGFBP-3 keine signifikanten Unterschiede zwischen den einzelnen Haupt- und Subgruppen (p>0,05). Für IGF-1 konnte eine signifikante Abhängigkeit der Serumkonzentration vom Menopausenstatus bestätigt werden (p0,05). Auch der Vergleich zwischen den VEGF-Konzentrationen von Risikopatientinnen und dem Normalkollektiv wies keinen signifikanten Unterschied aus (p>0,05). Um die intraindividuelle Konstanz der Werte über einen längeren Zeitraum zu prüfen, wurden 34 Frauen, von denen mehr als ein Serum-Wert vorlag, untersucht. Dabei konnte eine intraindividuelle Streubreite der VEGF-Werte im Mittel von 115 pg/ml (Median 118,5 pg/ml, Range 2-310 pg/ml), der IGF-1-Werte im Mittel von 36 ng/ml (Median 27,5 ng/ml, Range 0-134 ng/ml) und der IGFBP-3-Werte im Mittel von 1792 ng/ml (Median 1587 ng/ml, Range 1-4074 ng/ml) festgestellt werden. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass aufgrund der starken interindividuellen Streuung der VEGF-, IGF-1- und IGFBP-3-Werte eine Kontrolle der Serum-konzentration nur nach Bestimmung eines individuellen Referenzwertes von klinischem Nutzen sein kann. Zur Zeit scheint die Messung von VEGF, IGF-1 und IGFBP-3 zur Kontrolle von Risikopatientinnen wenig aussagekräftig zu sein. / Breast Cancer is among the most common female malignancies. The prognosis in the case of breast cancer is made according to the status of the TNM-classification, in which the possibility of an advanced stage is higher in the case of a late diagnosis. This is the reason why the early recognition of the illness receives special attention in clinical research. The average risk among the normal population lies at 7-10%. Individually increased risk is given in the case of family history for breast cancer, having earlier suffered from precancer, a carcinomca ductale in situ (DCIS), a carcinoma lobulare in situ (CLIS) and the atypical ductal hyperplasie (ADH). In cancer research special attention is currently given to the connection between tumour growth and the creation of new blood vessels, called angiogenesis. This new creation of capillaries is highly dependent on the setting free of certain growth factors of which the vascular endothelial growth factor (VEDF) is especially important due to ist endothelspecificity. However the insulin-like growth factor-1 (IGF-1) which occurs in nearly all tissues and is decisive for many physiological processes, and its binding proteins (IGFBP-1 to IGFBP-7) appear to play an important role in tumour development. Many clinical studies therefore occupy themselves with a comparison between the serum or plasma-concentrations at VEGF, IGF-1 and its binding proteins among cancer patients and control groups. These comparisons find higher VEGF and IFG-1 concentrations and lower IGFBP-3-concentrations among breast cancer patients. For patients with a DCIS illness higher VEGF concentrations have also been found. This study looks at the possible clinical use of the measurement of the mentioned growth factors during the regular check up of breast cancer risk patients. For this purpose a collective of 106 women were examined that were being treated or advised during the consultancy of the Charité's women's clinic due to a family cancer risk or having been diagnosed with a precancer. In order to compare among the main groups "family risk" and "precancer" a separation into subgroups according to menopausal status was undertaken, within the group "family risk" an additional separation according to the calculated risk was done and the group "precancer" was further split according to anti-estrogen treament and family anamnesis with regards to breastcancer. A collective of breast cancer patients as well as a collective of 234 healthy women without distinct risks functioned as control groups. The concentrations of VEGF, IGF-1 and IGFBP-3 in the serum were measured with an enzyme linked immunoassays (ELISA) and compared. No significant differences between the separate maingroups and subgroups could be found (p>0,05). In the case of IGF-1 a significant dependency of the concentration in the serum and the menopausal status could be confirmed (p0,05). The comparison between the concentrations of VEGF of risk patients and the healthy collective also did not show any significant differences (p>0,05). In order to check the intraindividual consistency of the values over a longer period of time 34 women, for which there existed more than one serum-value, were examined. Here, intraindividual differences of the VEGF-values of 115 pg/ml (Median 118,5 pg/ml, Range 2-310 pg/ml), the IGF-value of 36 ng/ml (Median 27,5 ng/ml, Range 0-134 ng/ml) and the IGFBP-3-value of 1792 ng/ml (Median 1587 ng/ml, Range 1-4074 ng/ml) was found. In summary it can be said that, due to the high interindividual differences of the values of VEGF, IGF-1 and IGFBP-3, a control of the serum concentration can only be of clinical use if a individual reference value is measured.

Die Therapie des häufigsten primären Hirntumors bei Erwachsenen, des Glioblastoms, gestaltet sich aufgrund der relativen Resistenz gegen Bestrahlung und Zytostatika schwierig und resultiert in einer äußerst schlechten Prognose. Ziel dieser Arbeit war die Identifikation von zellulären Faktoren, die bei einer Behandlung mit dem neuartigen onkolytischen Virus Ad5-Delo3RGD (ΔE1A-13S, ΔE19K, ΔE3, zusätzliches RGD-Motiv) eine Bedeutung hinsichtlich des Ansprechens auf die Therapie haben. Dazu erfolgte nach der Transduktion von Gliomzellen mit adenoviralen Vektoren, mit unterschiedlichem E1A-Status, eine Analyse der Modulation der globalen Genexpression. Die E1A-Deletante, Ad5-Ad312, war replikationsinkompetent in Gliomzellen und hatte infolgedessen nur einen marginalen Einfluss auf Genebene und keine biologischen Effekte auf Proteinebene. Das Wildtypvirus (Ad5-wt) mit intakter und das onkolytische Virus (Ad5-Delo3RGD) mit mutierter E1A-Region induzierten eine starke Modifikation der zellulären Genexpression in Gliomzellen. Die Transduktion der Gliomzellen mit Wildtypvirus bzw. onkolytischen Virus resultierte in einer bis zu 60 %-igen Hemmung der Sekretion des Angiogenesefaktors VEGF. Fernerhin konnte in Glioblastomzellen gezeigt werden, dass Ad5-wt und Ad5-Delo3RGD eine 50 bis 60 %-ige Inhibition der Sekretion von TGF-β2, sowie eine bis zu 65 %-ige Hemmung der Transkriptionsaktivität des TGF-β-Signalwegs induzierten. Damit reprimieren besagte Viren zelluläre Faktoren, deren Expression im Gliom mit einer schlechten Prognose korreliert ist. Aufgrund dieser Daten konnte für maligne Gliome ein Modell von Ad5-Delo3RGD-Therapie relevanten zellulären Faktoren entwickelt werden, welches den Zusammenhang zwischen TGF-β2, VEGF bzw. MIR-181 und der Virotherapie verdeutlicht. Mit Hilfe dieses Modells steigt das Verständnis um die antineoplastische Aktivität des onkolytischen Virus, und ermöglicht damit eine Verbesserung der Ad5-Delo3RGD-basierten Therapie. / Glioblastoma is the most common type of brain tumor among adults. The therapy is very difficult, due to its relative resistance to radiation and zytostatica, and often results in fatal prognosis. The main objective of this thesis was the identification of cellular factors associated with therapy response to adenoviral treatment using the newly developed oncolytic virus Ad5-Delo3RGD. Therefore, after viral transduction of glioma cells with adenoviral vectors, using E1A-wildtype and -mutant viruses, an analysis of the modulation of mRNA expression profiles was conducted. The E1A deletion mutant Ad5-Ad312 was replication-deficient in glioma cells and therefore had only marginal influence of host gene transcription level and no biological effect on protein level. Both, wildtype adenovirus type 5 (Ad5-wt), with intact E1A, and oncolytic virus (Ad5-Delo3RGD), with mutated E1A, induced strong modifications of gene expression profiles in glioma cells. The transduction of glioma cells with wildtype or oncolytic virus resulted in a 60 % reduced secretion of the angionesis factor Vascular Endothelial Growth Factor (VEGF). In addition it was shown that Ad5-wt and Ad5-Delo3RGD induced a reduced secretion of TGF-ß2 by 50 to 60 % and a repression of the SMAD2/SMAD3/SMAD4-specific transcription activity up to 65 %. Thus the viruses inhibit cellular factors, which expression is corelated to a weak prognosis. Based on this data a new model for malign glioma was developed, which illustrates the relationship between virotherapy and the cellular factors TGF-β2, VEGF and MIR-181, which are associated with treatment response to Ad5-Delo3RGD-based therapy. The model helps to understand the basic antineoplastic activity of the oncolytic virus and therefore should help to improve Ad5-Delo3RGD-based therapy.

Die Studien der vorliegenden Habilitationsschrift hatten die Untersuchung der Abhängigkeit diffuser und tumorförmiger Hypervaskularisationen der Plazenta von angiogenen Wachstumsfaktoren zum Ziel. Kernaussagen sind, daß in Chorangiomen eine höhere Expression der Angiopoietine - 1 und - 2 vorliegt, bei morphologisch gleicher Rezeptorausstattung. Keine Differenzen zeigte die Expression von PDGF sowie seinem Rezeptor PDGF-ß. Bei Differenzierung solitärer und multipler Chorangiome (Chorangiomatosen) hinsichtlich klinischer Parameter sowie der Expression der angiogenen Wachstumsfaktoren Angiopoietin-1 und bFGF sowie hinsichtlich der Proliferationsrate konnten Unterschiede zwischen den plazentaren Läsionen deutlich werden. Die Expression der Wachstumsfaktoren war jeweils in Chorangiomatosen kräftiger als in solitären Veränderungen. Das Auftreten von Chorangiomatosen steht offensichtlich in Zusammenhang mit einer verstärkten Expression dieser Wachstumsfaktoren, die damit noch die ohnehin in Chorangiomen - gegenüber ortholog gereiftem Plazentaparenchym - gesteigerte Expression übertrifft. So deutet diese Studie nunmehr verstärkt auf eine Korrelation zwischen der Höhe der Wachstumsfaktorexpression und dem quantitativen Auftreten lokalisierter Angiopathien hin. Zudem ließen sich klinische Korrelationen aufzeigen. So lag das mütterliche Alter beim Auftreten lokalisierter hypervakularisierter Veränderungen deutlich über der bei unauffälligen Plazenten, ein Ergebnis, das vorherige Untersuchungen bestätigte. Geringe Differenzen das maternale Alter betreffend bestanden zwischen Chorangiomen und Chorangiomatosen. Hinsichtlich der Schwangerschaftskomplikationen fanden sich keine Unterschiede zwischen Chorangiomen und Chorangiomatosen. Begleitende Reifungsstörungen fanden sich auch in diesem Studienkollektiv, dahingehend, daß Chorangiome und häufiger noch Chorangiomatosen kombiniert mit diesen Auftreten. Untersuchungen zur Apoptose- und Proliferationsrate in Chorangiomen mit differierendem histologischen Subtyp erbrachten keinen Hinweis auf den Einfluß der Apoptose auf das Wachstum dieser tumorartigen Läsionen. In Chorangiomen zeigte sich im Vergleich zu regelhaft entwickeltem reifem Plazentagewebe eine leicht gesteigerte Proliferationsrate. Auffällig war einzig, daß Chorangiome endotheliomatösen Subtyps die höchste Proliferationsrate aufwiesen. Studien intrauteriner Todesfällen der frühen und mittleren Fetalperiode konnten zeigen, das diffuse Hypervaskularisationen offensichtlich reaktiver Natur sind. Untersuchungen zur Expression angiogener Wachstumsfaktoren zeigten, daß diese exprimiert werden und damit bereits an der Gefäßentwicklung der Plazenta in der Fetalperiode beteiligt sind. Unterschiede hinsichtlich der Expression der Wachstumsfaktoren in Plazenten mit Hypervaskularisationen und Kontrollproben fanden sich jedoch morphologisch nicht. Die gesteigerte Gefäßbildung in der frühen Fetalperiode ist offenbar eine reaktive Anpassung der Zotten auf die Hypoxie. Falldarstellungen zweier weiterer Plazentatumoren, eines inzidentellen Chorangiokarzinoms sowie eines Angiomyxoms der Nabelschnur erbrachten hinsichtlich der Gefäßkomponente in diesen Tumoren keine Abhängigkeit von den untersuchten Wachstumsfaktoren. Eine Studie von 136 Chorangiomen aus 22439 Plazenten ließen aussagefähigen Analysen der Häufigkeit, morphologischer Charakteristika und Korrelationen zwischen Chorangiomen und klinischen Befunden zu. So zeigten sich signifikante Abhängigkeiten zwischen dem Auftreten eines Chorangioms und dem mütterlichen Alter, der gestationsbedingten Hochdrucksymptomatik, der Parität, dem kindlichen Geschlecht und begleitender Reifungsstörungen der Plazenta. Insbesondere die Reifungsstörungen in Kombination zum Auftreten eines Chorangioms waren zuvor nie Gegenstand einer größeren wissenschaftlichen Studie. Einzelne Parameter fanden zwar sporadisch in einzelnen Publikationen mit wenigen Chorangiomen wissenschaftlich Beachtung, doch die dort publizierten Ergebnisse widersprachen sich vielfach. So ist die jetzt vorliegende Untersuchung in ihrer Größe und damit Aussagekraft sehr relevant. / The studies had the investigation of the dependence of vague and tumoric hypervascularisation of the placenta on angiogenic growth factors as a goal. Core statements are that in chorangiomas a higher expression of Angiopoietin-1 and - 2 is present, during morphologically same receptor equipment. The expression of PDGF as well as ist receptor did not show differences PDGF - beta. With differentiation of solitär and multiple chorangiomas (chorangiomatoses) regarding clinical parameters as well as the expression of the angiogenic growth factors Angiopoietin-1 and bFGF as well as regarding the proliferation rate could become clear differences between the placental lesions. The expression of the growth factors was in each case in chorangiomatoses stronger than in single changes. The occurrence of chorangiomatoses stands obviously in connection with a strengthened expression of these growth factors, which exceeds thereby still anyway the expression increased in chorangiomas - opposite ortholog matured placental tissue. Thus this study points now strengthened on a correlation between the height of the expression on growth factors and the quantitative occurrence of located angiopathia. Besides clinical correlations could be pointed out. Thus the maternal age was clearly with the occurrence of located such changes over with inconspicuous placentas, a result, which confirmed previous investigations. Small differences concerning the maternal age existed between chorangiomas and chorangiomatoses. Regarding the pregnancy complications were no differences between chorangiomas and chorangiomatoses. Accompanying maturing disturbances were in such a way also in this study collective, that chorangiomas combines and more frequently still chorangiomatoses with this occurrence. Investigations to the apoptoses and proliferation rate in chorangiomas with differing histological subtyp did not furnish a reference to the influence of the apoptoses on the growth of these tumor-like lesions. To chorangiomas an easily increased proliferation rate pointed itself compared with regularly developed ripe placental tissue. Remarkably it was only that chorangiomas with endotheliomatos subtyp the highest proliferation rate exhibited. Studies of intrauterin deaths of the early and middle fetal periode could show, which are vague hypervascularisation of obviously reactive nature. Investigations to the expression of angiogenic growth factors showed the fact that these are exprime and so that in the container development of the placenta in the fetal periode is involved already. Differences regarding the expression of the growth factors in plazentas with hypervascularisationen and inspection samples were not however morphologically. The increased container formation in the early fetal periode is obviously a reactive adjustment of the villous trees on the hypoxia. Drop representations of two further placenta tumors, a incidentially chorangiocarcinoma as well as a angiomyxoma of the umbilical cord did not furnish dependence on the examined growth factors regarding the container component in these tumors. Expressive analyses of the frequency, morphologic characteristics and correlations between chorangiomas and clinical findings permitted a study of 136 chorangiomas from 22439 plazentas. Thus significant dependence between the occurrence of a chorangioma and the maternal age, the gestational high pressure symptomatology, the parity, the childlike sex showed up and accompanying maturing disturbances of the placenta.

OBJECTIVE:Vascular smooth muscle cell (VSMC) hypertrophy and proliferation occur in response to strain-induced local and systemic inflammatory cytokines and growth factors which may contribute to hypertension, atherosclerosis, and restenosis. We hypothesize VSMC strain, modeling normotensive arterial pressure waveforms in vitro, results in attenuated proliferative and increased hypertrophic responses 48 hrs post-strain.METHODS:Using Flexcell Bioflex Systems we determined the morphological, hyperplastic and hypertrophic responses of non-strained and biomechanically strained cultured rat A7R5 VSMC. We measured secretion of nitric oxide, key cytokine/growth factors and intracellular mediators involved in VSMC proliferation via fluorescence spectroscopy and protein microarrays. We also investigated the potential roles of VEGF on VSMC strain-induced proliferation.RESULTS:Protein microarrays revealed significant increases in VEGF secretion in response to 18 hours mechanical strain, a result that ELISA data corroborated. Apoptosis-inducing nitric oxide (NO) levels also increased 43% 48 hrs post-strain. Non-strained cells incubated with exogenous VEGF did not reproduce the antimitogenic effect. However, anti-VEGF reversed the antimitogenic effect of mechanical strain. Antibody microarrays of strained VSMC lysates revealed MEK1, MEK2, phospo-MEK1T385, T291, T298, phospho-Erk1/2T202+Y204/T185+T187, and PKC isoforms expression were universally increased, suggesting a proliferative/inflammatory signaling state. Conversely, VSMC strain decreased expression levels of Cdk1, Cdk2, Cdk4, and Cdk6 by 25-50% suggesting a partially inhibited proliferative signaling cascade.CONCLUSIONS:Subjecting VSMC to cyclic biomechanical strain in vitro promotes cell hypertrophy while attenuating cellular proliferation. We also report an upregulation of MEK and ERK activation suggestive of a proliferative phenotype. Hhowever, the proliferative response appears to be aborogated by enhanced antimitogenic cytokine VEGF, NO secretion and downregulation of Cdk expression. Although exogenous VEGF alone is not sufficient to promote the quiescent VSMC phenotype, we provide evidence suggesting that strain is a necessary component to induce VSMC response to the antimitogenic effects of VEGF. Taken together these data indicate that VEGF plays a critical role in mechanical strain-induced VSMC proliferation and vessel wall remodeling. Whether VEGF and/or NO inhibit signaling distal to Erk 1/2 is currently under investigation.

Ovarian cancer (OC) is the second most common gynecologic cancer; however it is responsible for the most gynecologic cancer-related deaths. Apoptosis evasion is an important mechanism in OC tumorigenesis, and the prototypic anti-apoptotic protein, B-cell lymphoma 2 (Bcl-2), is often overexpressed in OC tumors. Gaining a better understanding of the mechanism(s) behind Bcl-2 overexpression and potential extra-anti-apoptotic functions of Bcl-2 could elucidate the importance of elevated Bcl-2 in OC. In the current study, I show through immunohistochemical analysis of normal, benign, and OC tissue sections, that both epithelial and stromal Bcl-2 expression decreases with OC progression. However, the number of Bcl-2-positive lymphocyte nests and the size of these lymphocyte nests increase dramatically with OC progression. Additionally, this study shows that lysophosphatidic acid (LPA), a glycerophospholipid frequently elevated in serum and ascites fluid of OC patients, upregulates Bcl-2 in OC cells. Bcl-2 enzyme-linked immunosorbant assay (ELISA), western blot analysis, reverse transcriptase polymerase chain reaction (RT-PCR), and luciferase reporter assays reveal that LPA increases Bcl-2 promoter, messenger RNA (mRNA), and protein levels in OC cells, but not in normal immortalized ovarian surface epithelial (IOSE) cells. LPA also increases secreted levels of Bcl-2. In vitro human umbilical vein endothelial cell (HUVEC) tube formation assays show that OC-derived Bcl-2 or recombinant human (rh) Bcl-2 promotes aberrant formation of tube-like structures. Though extracellular Bcl-2 does not affect HUVEC cell viability, it may cause aberrant tube formation by inhibiting HUVEC migration. Finally, Bcl-2 ELISA reveals that urinary Bcl-2 levels in OC patients are higher than those in normal individuals and patients with benign gynecologic disease. Urinary Bcl-2 also complements serum CA125 when the two are compared in parallel samples. Furthermore, urinary Bcl-2 decreases following cytoreductive surgery. Altogether, the results suggest that Bcl-2 is important in OC tumorigenesis and angiogenesis. Additionally, urinary Bcl-2 may be a valuable non-invasive biomarker for OC diagnosis and/or screening. Consequently, further elucidation of mechanisms of Bcl-2 overexpression and its extra-apoptotic functions could lead to improved treatment and diagnostic strategies for OC patients.

The vascular system is critical for maintaining homeostasis in all vertebrates. Structural studies of Neuropilin (Nrp), an essential angiogenic receptor, have defined its role in regulating angiogenesis, the formation of new vessels from the existing vasculature. Utilizing biochemical and biophysical tools we describe the ability of Nrp to function as a co-receptor for the VEGFR receptor tyrosine kinase. Two families of Nrp-1 ligands, Vascular Endothelial Growth Factor A (VEGF-A) and Semaphorin3F (Sema3F), physically compete for binding to the Nrp-1 b1 domain, and have opposite roles. VEGF-A is a potent pro-angiogenic cytokine while Sema3F is an angiogenesis inhibitor. Using coupled structural and functional studies, we have discovered the basis for potent competitive binding of Sema3F to Nrp1 requires engagement of two distinct binding sites. These data provide a basis for understanding the rational design of novel high affinity Nrp-1 inhibitor.

Cervical cancer is the third most common cancer among women worldwide, and the fourth leading cause of cancer mortality. Despite significant declines in the incidence and mortality rates of cervical cancer in Canada, it remains the 4th most common cancer in women aged 20-29 years. In order to gain novel insights into cervical cancer tumourigenesis and clinical outcome, we investigated and characterized the alterations in microRNA (miRNA) expression in this disease. Firstly, we performed global miRNA expression profiling of cervical cancer cell lines (n=3), and patient specimens (n=79). From this analysis, we identified miR-196b to be significantly down-regulated in cervical cancer, and characterized its role in regulating the HOXB7~VEGF axis. The global miRNA expression data also led to the development of a candidate 9-miRNA signature that was prognostic for disease-free survival in patients with cervical cancer, although we were unable to validate this signature in an independent cohort. This report describes important considerations concerning the development and validation of microRNA signatures for cervical cancer. Our investigations also led us to a comparison of three methods for measuring miRNA abundance: the TaqMan Low Density Array, the NanoString nCounter assay, and single-well quantitative real-time PCR. Our findings demonstrated limited concordance between the TLDA and NanoString platforms, although each platform correlated well with PCR, which is considered the gold standard for nucleic acid quantification. Furthermore, we examined biases created by amplification protocols for microarray studies. Our analysis demonstrated that performing a correction using the LTR-method (linear transformation of replicates) could help mitigate, but not completely eliminate such biases. Overall, this report presents insights into the role of miRNAs in cervical cancer, as well as an evaluation of technical considerations concerning miRNA and mRNA expression profiling studies.