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Modelo de Niemann-Pick tipo C induzido por U18666A : efeito sobre vários parâmetros bioquímicos em astrócitos de ratos de córtex cerebral de ratos recém-nascidosSantos, Daniela Copetti January 2015 (has links)
A doença de Nicmann - Pick tipo C (DNPC) é uma desordem genética lisossomal neurodegenerativa causada pelo acúmulo de lipídios, principalmente colesterol, esfingomielina e glicoesfingolipídios no espaço perinuclear. U18666A é um agente inihidor no transporte de colesterol, que vem sendo utilizado em diversos modelos tanto in vivo quanto in vitro para mimificar DNPC, principalmente em fihrohlastos. Diversas doenças ncurodcgcncrativas estão associadas ao estresse oxidativo c acredita-se que radicais livres, produtos de lipoperoxidação e alterações na fluidez da membrana possam inibir a enzima Na+, K+-A TPase, levando a célula a um "déficit" energético. A deficiência de algumas proteínas como a GF AP parecem tornar os astrócitos menos eficientes em lidar com estados de injúrias no SNC, além de algumas pesquisas mostrarem um decréscimo na fosforilação de vimentina em fihrohlastos humanos com NPC. MK-801 é um receptor não competitivo de NMDA (N-mctil D-aspartato), sendo considerado um ncurotransmissor primário do cérebro. O objetivo desse estudo foi observar os efeitos da droga U 18666A, que causam o acúmulo de colesterol no citoplasma de astrôcitos de ratos jovens e a partir daí verificar a atividade de algumas hidrolascs lisossomais, parâmetros do estresse oxidativo, metabolismo energético e a hipelfosforilação de filamentos intermediários (GFAP e vimcntina) em astrócitos de ratos jovens. Através da coloração de Filippin c microscopia de fluorescência e através da utilização do CellM software, foi feita a visualização e quantificação do colesteroL A melhor dose de U18666A que permitiu o acúmulo de colesterol foi de 0,25 j..tg/mL em um período de incubação de 48 horas. Astrócitos de ratos incubados com a droga (DNPC) mostraram um significativo aumento de colesterol em relação aquelas culturas sem a droga. A medida da atividade da csfingomielinasc c enzimas beta-glicosidase em astrócitos de ratos com NPC foi significativamente menor do que astrócitos controle, o que é consistente com a atividade da DNPC humana. Verificando as alterações sofridas em nível de enzimas antioxidantcs c estresse oxidativo observamos que U 18666A leva a um aumento nos gmpos TBARS e Carbonil, porém a uma diminuição nos grupos tióis medidos por ensaios sulfidril. Além disso, ocorre um decréscimo na atividade de CAT e SOD e aumenta a produção de NO, ao analisarmos a atividade de Na+, K+ A TPase verifica-se um efeito inibitório na atividade dessa enzima. Os presentes resultados mostram que o acúmulo de colesterol nas culturas de células, induz o estresse oxidativo, o que indica que é potencialmente tóxico e confirma os resultados observados em outras doenças neurodegenerativas. Por fim, ao utilizarmos 4 grupos diferentes, fazendo uso ou não da droga c do MK-801 verificou-se que com o acúmulo de colesterol nas células ocorre uma hiperfosforilação dos Filamentos Intermediários, tanto de GFAP quanto de vimentina, porém o MK-801, sendo um antagonista de NMDA e agindo sobre os receptores de glutamato demonstram inibirem a cxcitotoxicidadc provocada pelo Ul8666A. Além dos parâmetros que foram testados em nosso trabalho, como extresse oxidativo, enzimas antioxidantcs c metabolismo energético, fazendo uso da droga para minriticar NPC, outros parâmetros bioquímicas das células, os quais ainda não foram testados em nossos estudos, podem ser testados com este modelo animal, contribuindo assim para uma melhor compreensão da doença. Podemos fazer uso ainda de substâncias que diminuam a excitotocicidade causada pelo aumento do colesterol, observados na NPC, a exemplo do antagonista do receptor NMDA, MK-801, podendo se tomar ferramentas viáveis para auxiliar no tratamento de doenças ncurodcgcncrativas relacionadas a cxcitotocicidadc glutamatérgica. / The Niemann - Pick type C (NPC) is a disorder genetic neurodegenerative caused by lysosomal accumulation of lipids, cspccially cholcstcrol, sphingomyclin and glycosphingolipids in the perinuclear space. U 18666A is an inhibitory agent in choiesteroi transport, which has heen used in several models hoth in vivo and in vitro to mimificar NPC, cspccially in fibroblasts. Various ncurodcgencrativc discases are associatcd with oxidative stress and it is believed that the free radicais, lipid peroxidation products and changes in membrane fluidity may inhibit the enzyme Na+, K + -ATPase, causing the cell suftcring a dcficit of cncrgy. Thc dcficiency of ccrtain protcins as GFAP sccm to makc astrocytes iess efficient in dealing with states of injury in the CNS, and some research shows a decrease in phosphorylation of vimentin in human fibroblasts with NPC. MK-801 is a noncompctitive NMDA receptor, bcing considercd a primary ncurotransmitter. Thc ohjective of this study was to observe the effects of U 18666A drug, eausing the accumulation of cholcstcrol in thc eytoplasm of young rat astrocytcs and thus verify thc activity of some lysosomai hydroiases, oxidative stress parameters, energy metabolism and hyperphosphorylation of intermediate filaments (vimentin and GFAP) in astrocytes of young rat. Through Filippin staining and fluorescence microscopy and by using the software Cel!M was made visualization and quantitation of cholesterol. The hest dose U18666A which allowed thc aceumulation of cholcstcrol was 0.25 mg I mL in a 48 hour period of incubation. Rat astrocytes (NPC) incubated with the drug showed a significant increase in total cholesterol relative to the cultures without drug. The measure of activity of sphingomyclinase and bcta-glucosidasc enzymes in rat astroeytcs NPC was signiticantly lower than contrai astrocytes, which is consistent with the activity of the human NPC. Noting the changcs suftcred in thc levei of antioxidant enzymcs and oxidativc stress U 18666A observed that ieads to an increase in TBARS and carbonyl groups, but a decrease in the thiol groups as measured by sulfl1ydryl tests. Moreover, there is a decrease in SOD and CAT activity and incrcascs the production of NO, by analyzing thc activity ofthe Na+, K + -ATPase there is an inhibitory effect on this enzyme. The present results show that the accumulation of cholesterol in cell cultures induces oxidative stress, which indicates that it is potcntially toxic, confirming the results observed in othcr ncurodcgcnerative discascs. Finally, we used four different groups, with or without the use of the dmg MK-801, and found that the accumulation of cholesterol in cells leads to hyperphosphorylation FI both GFAP and vimcntin, howcver, MK-801, an NMDA antagonist acts on the glutamatc receptor, and inhibit excitotoxicity caused by U 18666A. Besides the parameters that were tcstcd in our study, as oxidative stress, antioxidant cnzymcs and encrgy mctabolism, causing the dmg to mimificar NPC other biochemical parameters of the cells, which were not tested in our study may he tested with this model animal, thus contributing to a better undcrstanding of thc diseasc. Wc can still makc use of substances that rcduec thc excitotocicidade caused by increased choiesteroi, observed in NPC, such as the NMDA receptor antagonist, MK-801, which can hecome viahle tools to aid in the treatment of ncurodcgcnerativc diseascs rclatcd to cxcitotoeicidadc glutamatcrgic.
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Modelo de Niemann-Pick tipo C induzido por U18666A : efeito sobre vários parâmetros bioquímicos em astrócitos de ratos de córtex cerebral de ratos recém-nascidosSantos, Daniela Copetti January 2015 (has links)
A doença de Nicmann - Pick tipo C (DNPC) é uma desordem genética lisossomal neurodegenerativa causada pelo acúmulo de lipídios, principalmente colesterol, esfingomielina e glicoesfingolipídios no espaço perinuclear. U18666A é um agente inihidor no transporte de colesterol, que vem sendo utilizado em diversos modelos tanto in vivo quanto in vitro para mimificar DNPC, principalmente em fihrohlastos. Diversas doenças ncurodcgcncrativas estão associadas ao estresse oxidativo c acredita-se que radicais livres, produtos de lipoperoxidação e alterações na fluidez da membrana possam inibir a enzima Na+, K+-A TPase, levando a célula a um "déficit" energético. A deficiência de algumas proteínas como a GF AP parecem tornar os astrócitos menos eficientes em lidar com estados de injúrias no SNC, além de algumas pesquisas mostrarem um decréscimo na fosforilação de vimentina em fihrohlastos humanos com NPC. MK-801 é um receptor não competitivo de NMDA (N-mctil D-aspartato), sendo considerado um ncurotransmissor primário do cérebro. O objetivo desse estudo foi observar os efeitos da droga U 18666A, que causam o acúmulo de colesterol no citoplasma de astrôcitos de ratos jovens e a partir daí verificar a atividade de algumas hidrolascs lisossomais, parâmetros do estresse oxidativo, metabolismo energético e a hipelfosforilação de filamentos intermediários (GFAP e vimcntina) em astrócitos de ratos jovens. Através da coloração de Filippin c microscopia de fluorescência e através da utilização do CellM software, foi feita a visualização e quantificação do colesteroL A melhor dose de U18666A que permitiu o acúmulo de colesterol foi de 0,25 j..tg/mL em um período de incubação de 48 horas. Astrócitos de ratos incubados com a droga (DNPC) mostraram um significativo aumento de colesterol em relação aquelas culturas sem a droga. A medida da atividade da csfingomielinasc c enzimas beta-glicosidase em astrócitos de ratos com NPC foi significativamente menor do que astrócitos controle, o que é consistente com a atividade da DNPC humana. Verificando as alterações sofridas em nível de enzimas antioxidantcs c estresse oxidativo observamos que U 18666A leva a um aumento nos gmpos TBARS e Carbonil, porém a uma diminuição nos grupos tióis medidos por ensaios sulfidril. Além disso, ocorre um decréscimo na atividade de CAT e SOD e aumenta a produção de NO, ao analisarmos a atividade de Na+, K+ A TPase verifica-se um efeito inibitório na atividade dessa enzima. Os presentes resultados mostram que o acúmulo de colesterol nas culturas de células, induz o estresse oxidativo, o que indica que é potencialmente tóxico e confirma os resultados observados em outras doenças neurodegenerativas. Por fim, ao utilizarmos 4 grupos diferentes, fazendo uso ou não da droga c do MK-801 verificou-se que com o acúmulo de colesterol nas células ocorre uma hiperfosforilação dos Filamentos Intermediários, tanto de GFAP quanto de vimentina, porém o MK-801, sendo um antagonista de NMDA e agindo sobre os receptores de glutamato demonstram inibirem a cxcitotoxicidadc provocada pelo Ul8666A. Além dos parâmetros que foram testados em nosso trabalho, como extresse oxidativo, enzimas antioxidantcs c metabolismo energético, fazendo uso da droga para minriticar NPC, outros parâmetros bioquímicas das células, os quais ainda não foram testados em nossos estudos, podem ser testados com este modelo animal, contribuindo assim para uma melhor compreensão da doença. Podemos fazer uso ainda de substâncias que diminuam a excitotocicidade causada pelo aumento do colesterol, observados na NPC, a exemplo do antagonista do receptor NMDA, MK-801, podendo se tomar ferramentas viáveis para auxiliar no tratamento de doenças ncurodcgcncrativas relacionadas a cxcitotocicidadc glutamatérgica. / The Niemann - Pick type C (NPC) is a disorder genetic neurodegenerative caused by lysosomal accumulation of lipids, cspccially cholcstcrol, sphingomyclin and glycosphingolipids in the perinuclear space. U 18666A is an inhibitory agent in choiesteroi transport, which has heen used in several models hoth in vivo and in vitro to mimificar NPC, cspccially in fibroblasts. Various ncurodcgencrativc discases are associatcd with oxidative stress and it is believed that the free radicais, lipid peroxidation products and changes in membrane fluidity may inhibit the enzyme Na+, K + -ATPase, causing the cell suftcring a dcficit of cncrgy. Thc dcficiency of ccrtain protcins as GFAP sccm to makc astrocytes iess efficient in dealing with states of injury in the CNS, and some research shows a decrease in phosphorylation of vimentin in human fibroblasts with NPC. MK-801 is a noncompctitive NMDA receptor, bcing considercd a primary ncurotransmitter. Thc ohjective of this study was to observe the effects of U 18666A drug, eausing the accumulation of cholcstcrol in thc eytoplasm of young rat astrocytcs and thus verify thc activity of some lysosomai hydroiases, oxidative stress parameters, energy metabolism and hyperphosphorylation of intermediate filaments (vimentin and GFAP) in astrocytes of young rat. Through Filippin staining and fluorescence microscopy and by using the software Cel!M was made visualization and quantitation of cholesterol. The hest dose U18666A which allowed thc aceumulation of cholcstcrol was 0.25 mg I mL in a 48 hour period of incubation. Rat astrocytes (NPC) incubated with the drug showed a significant increase in total cholesterol relative to the cultures without drug. The measure of activity of sphingomyclinase and bcta-glucosidasc enzymes in rat astroeytcs NPC was signiticantly lower than contrai astrocytes, which is consistent with the activity of the human NPC. Noting the changcs suftcred in thc levei of antioxidant enzymcs and oxidativc stress U 18666A observed that ieads to an increase in TBARS and carbonyl groups, but a decrease in the thiol groups as measured by sulfl1ydryl tests. Moreover, there is a decrease in SOD and CAT activity and incrcascs the production of NO, by analyzing thc activity ofthe Na+, K + -ATPase there is an inhibitory effect on this enzyme. The present results show that the accumulation of cholesterol in cell cultures induces oxidative stress, which indicates that it is potcntially toxic, confirming the results observed in othcr ncurodcgcnerative discascs. Finally, we used four different groups, with or without the use of the dmg MK-801, and found that the accumulation of cholesterol in cells leads to hyperphosphorylation FI both GFAP and vimcntin, howcver, MK-801, an NMDA antagonist acts on the glutamatc receptor, and inhibit excitotoxicity caused by U 18666A. Besides the parameters that were tcstcd in our study, as oxidative stress, antioxidant cnzymcs and encrgy mctabolism, causing the dmg to mimificar NPC other biochemical parameters of the cells, which were not tested in our study may he tested with this model animal, thus contributing to a better undcrstanding of thc diseasc. Wc can still makc use of substances that rcduec thc excitotocicidade caused by increased choiesteroi, observed in NPC, such as the NMDA receptor antagonist, MK-801, which can hecome viahle tools to aid in the treatment of ncurodcgcnerativc diseascs rclatcd to cxcitotoeicidadc glutamatcrgic.
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Expressão de CK5 e vimentina/E-caderina nos diferentes subtipos de carcinomas ductais mamários / Expression of CK5 and vimentin/E-cadherin in different subtypes of invasive ductal carcinomaRapatoni, Liane 17 September 2013 (has links)
Introdução: Os marcadores moleculares têm sido utilizados para identificar subgrupos de tumores com comportamento clínico distinto, inclusive quanto ao padrão de recidiva. Objetivo: Caracterizar a expressão imunoistoquímica de vimentina (VIM) e E-caderina (CDH1) em carcinomas ductais invasivos (CDI) de mama e sua associação com a expressão de citoqueratina 5 (CK5), e características clínico-patológicas. Métodos: Microarranjos teciduais (TMA) foram construídos a partir de 82 amostras de CDI de mama. Imunoistoquímica (IHQ) foi realizada para determinar os receptores hormonais (RH; receptores de estrógeno e progesterona) e receptor do fator de crescimento epidérmico humano 2 (HER2), VIM, CDH1, CK5 e Ki-67. Os tumores foram classificados como luminal A (RH+, HER2-), luminal B (RH+, HER2+ ou Ki-67 alto), HER2 hiperexpresso (RH-, HER2+) e triplo negativo (TN; RH-, HER2-). Resultados: O fenótipo VIM+/CDH1-/low não foi observado nos tumores luminal A, B e HER2 hiperexpresso, enquanto que este fenótipo estava presente em 61,9% dos TN (p= 0,0001). A mediana de Ki-67 em tumores VIM+/CDH1-/low foi 13,6 (variação, 17,8-45,4), em comparação com 9,8 (variação de 4,1-38,1) nos não- VIM+/CDH1-/low (p= 0,0007). O acometimento linfonodal foi menos freqüente em pacientes com VIM+/CDH1-/low do que nos não- VIM+/CDH1-/low (23% X 61%, teste de 2, p = 0,01). A sobrevida livre de doença em 5 anos foi de 61,5% e 83,7% (teste de log-rank, p= 0,02) e a sobrevida global em 5 anos foi de 51,2% e 83,5% (teste de log-rank, p= 0,03) em pacientes com tumores com fenótipo VIM+/CDH1-/low e não VIM+/CDH1-/low, respectivamente. Conclusão: A expressão de VIM e CDH1 identificaram um subconjunto de CDI de mama com fenótipo mesenquimal com alto grau histológico e alto índice mitótico. / Introduction: Molecular markers have been used to identify subgroups of tumors with distinct clinical behavior, including recurrence pattern. Objective: To characterize the immunohistochemical expression of vimentin (VIM) and E-cadherin (CDH1) in invasive ductal carcinoma (IDC) of the breast and its association with cytokeratin 5 (CK5) expression and clinicopathological features. Methods: A tissue microarray was constructed from 82 IDC breast cancer specimens. Immunohistochemistry (IHC) was used to determine hormone receptor (HR; estrogen and progesterone receptors) status and human epidermal growth factor receptor 2 (HER2), VIM, CDH1, CK5, and Ki-67 expression. Tumors were classified as luminal A (HR+, HER2-), luminal B (HR+, HER2+ or high Ki-67), HER2 enriched (HR-, HER2+), and triple negative (TNBC; HR-, HER2-). Results: The VIM+/CDH1-/low phenotype was not observed in luminal A, luminal B and HER2 enriched tumors, whereas this phenotype was present in 61.9% of triple negative (TNBC) tumors (p = 0.0001). The median Ki-67 index in VIM+/CDH1-/low tumors was 13.6 (range, 17.8-45.4) compared with 9.8 (range, 4.1-38.1) in non-VIM+/CDH1-/low tumors (p= 0.0007). The presence of lymph node metastasis was less frequent in patients with VIM+/CDH1-/low tumors than in those with non-VIM+/CDH1-/low tumors (23% vs. 61%; 2 test, p= 0.01). The 5-years disease-free survival was 61.5% and 83.7% (log-rank test; p= 0.02) and the 5-year overall survival was 51.2% and 83.5% (log-rank test; p= 0.03) in patients with VIM+/CDH1-/low phenotype and non-VIM+/CDH1-/low phenotype tumors, respectively. Conclusion: The expression of VIM and CDH1 identified a subset of IDC breast cancer of the mesenchymal phenotype with high histological grade and high mitotic index.
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Expressão de CK5 e vimentina/E-caderina nos diferentes subtipos de carcinomas ductais mamários / Expression of CK5 and vimentin/E-cadherin in different subtypes of invasive ductal carcinomaLiane Rapatoni 17 September 2013 (has links)
Introdução: Os marcadores moleculares têm sido utilizados para identificar subgrupos de tumores com comportamento clínico distinto, inclusive quanto ao padrão de recidiva. Objetivo: Caracterizar a expressão imunoistoquímica de vimentina (VIM) e E-caderina (CDH1) em carcinomas ductais invasivos (CDI) de mama e sua associação com a expressão de citoqueratina 5 (CK5), e características clínico-patológicas. Métodos: Microarranjos teciduais (TMA) foram construídos a partir de 82 amostras de CDI de mama. Imunoistoquímica (IHQ) foi realizada para determinar os receptores hormonais (RH; receptores de estrógeno e progesterona) e receptor do fator de crescimento epidérmico humano 2 (HER2), VIM, CDH1, CK5 e Ki-67. Os tumores foram classificados como luminal A (RH+, HER2-), luminal B (RH+, HER2+ ou Ki-67 alto), HER2 hiperexpresso (RH-, HER2+) e triplo negativo (TN; RH-, HER2-). Resultados: O fenótipo VIM+/CDH1-/low não foi observado nos tumores luminal A, B e HER2 hiperexpresso, enquanto que este fenótipo estava presente em 61,9% dos TN (p= 0,0001). A mediana de Ki-67 em tumores VIM+/CDH1-/low foi 13,6 (variação, 17,8-45,4), em comparação com 9,8 (variação de 4,1-38,1) nos não- VIM+/CDH1-/low (p= 0,0007). O acometimento linfonodal foi menos freqüente em pacientes com VIM+/CDH1-/low do que nos não- VIM+/CDH1-/low (23% X 61%, teste de 2, p = 0,01). A sobrevida livre de doença em 5 anos foi de 61,5% e 83,7% (teste de log-rank, p= 0,02) e a sobrevida global em 5 anos foi de 51,2% e 83,5% (teste de log-rank, p= 0,03) em pacientes com tumores com fenótipo VIM+/CDH1-/low e não VIM+/CDH1-/low, respectivamente. Conclusão: A expressão de VIM e CDH1 identificaram um subconjunto de CDI de mama com fenótipo mesenquimal com alto grau histológico e alto índice mitótico. / Introduction: Molecular markers have been used to identify subgroups of tumors with distinct clinical behavior, including recurrence pattern. Objective: To characterize the immunohistochemical expression of vimentin (VIM) and E-cadherin (CDH1) in invasive ductal carcinoma (IDC) of the breast and its association with cytokeratin 5 (CK5) expression and clinicopathological features. Methods: A tissue microarray was constructed from 82 IDC breast cancer specimens. Immunohistochemistry (IHC) was used to determine hormone receptor (HR; estrogen and progesterone receptors) status and human epidermal growth factor receptor 2 (HER2), VIM, CDH1, CK5, and Ki-67 expression. Tumors were classified as luminal A (HR+, HER2-), luminal B (HR+, HER2+ or high Ki-67), HER2 enriched (HR-, HER2+), and triple negative (TNBC; HR-, HER2-). Results: The VIM+/CDH1-/low phenotype was not observed in luminal A, luminal B and HER2 enriched tumors, whereas this phenotype was present in 61.9% of triple negative (TNBC) tumors (p = 0.0001). The median Ki-67 index in VIM+/CDH1-/low tumors was 13.6 (range, 17.8-45.4) compared with 9.8 (range, 4.1-38.1) in non-VIM+/CDH1-/low tumors (p= 0.0007). The presence of lymph node metastasis was less frequent in patients with VIM+/CDH1-/low tumors than in those with non-VIM+/CDH1-/low tumors (23% vs. 61%; 2 test, p= 0.01). The 5-years disease-free survival was 61.5% and 83.7% (log-rank test; p= 0.02) and the 5-year overall survival was 51.2% and 83.5% (log-rank test; p= 0.03) in patients with VIM+/CDH1-/low phenotype and non-VIM+/CDH1-/low phenotype tumors, respectively. Conclusion: The expression of VIM and CDH1 identified a subset of IDC breast cancer of the mesenchymal phenotype with high histological grade and high mitotic index.
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Avaliação da imunoexpressão de vimentina e de osteopontina no reparo ósseo precoce de defeitos preenchidos com enxerto bovino associado à terapia laser de baixa intensidade / Evaluation of the immunoexpression of vimentin and osteopontin in early bone repair of defects filled with bovine bone graft associated to low level laser therapyPaula, Fernanda Oliveira de 13 August 2010 (has links)
Submitted by Renata Lopes (renatasil82@gmail.com) on 2016-10-03T15:00:55Z
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Previous issue date: 2010-08-13 / O objetivo deste estudo foi avaliar, pelo método de imunoistoquímica, a expressão de vimentina e osteopontina durante as fases iniciais de reparo de defeitos ósseos criados em fêmures de ratos Wistar albinus tratados com enxerto ósseo bovino orgânico Gen-ox® em associação com terapia laser de baixa intensidade. Foram selecionadas de forma aleatória 24 amostras emblocadas de arquivo provenientes de trabalho experimental desenvolvido anteriormente, no qual foram efetuadas análises histológicas e histomorfométricas de fêmures de cinquenta ratos. Obtiveram-se lâminas histológicas dos blocos de diferentes animais, os quais estavam previamente divididos, de acordo com o tratamento realizado, da seguinte forma: grupo I (controle), grupo II (Gen-Ox®) e grupo III (LLLT e Gen-Ox®). Foram elaboradas quatro lâminas para cada um dos tempos experimentais de 3, 5, 7 e 15 dias para cada grupo. Duas lâminas foram utilizadas para analisar a expressão da osteopontina e duas para vimentina, totalizando 48 lâminas. Em cada lâmina considerou-se dois campos para análise, sendo um campo na região da interface osso-defeito e o outro próximo ao periósteo, em um total de 96 campos. Para realização da reação imunoistoquímica anti-vimentina e anti-osteopontina utilizou-se o método clássico do complexo avidina-biotina peroxidase anti-peroxidase. A marcação positiva foi determinada pela identificação de coloração castanha intracitoplasmática nas reações com ambos os anticorpos. Os cortes foram analisados em microscópio Zeiss em aumentos de 200x, 400x e 1000x, em toda extensão, por dois diferentes observadores. Determinou-se, por método de contagem semiquantitativo, a média de intensidade de células positivas marcadas nos campos dos tratamentos propostos em cada período, o qual foi classificado pelo sistema de escore de acordo com os seguintes parâmetros: 0 = ausência de marcação; + = marcação leve (até 1/3 de células positivas); ++ = marcação moderada (até 2/3 de células positivas); e +++ = marcação intensa (acima de 2/3 de células marcadas). Os resultados mostraram que todos os grupos apresentaram
marcação para vimentina e para osteopontina em todos os períodos do experimento. Observou-se marcação celular mais acentuada para vimentina no período cicatricial inicial no grupo III. Não foram verificadas diferenças na marcação para osteopontina nos animais submetidos à terapia laser de baixa intensidade associada ao enxerto quando comparado aos outros grupos. / The aim of this study was to evaluate, by immunohistochemistry, the expression of vimentin and osteopontin during the early stages of repair of bone defects created in femurs of Wistar albinus rats treated with organic bovine bone graft Gen-ox® and associated with low level laser therapy. Twenty four embedded samples were randomly selected from the file of a previous experimental work, in which histological analysis and histomorphometry of the femurs of fifty rats was performed. Histological slides were obtained from blocks of different animals which were divided in accordance to previous treatment as follow: group I (control), group II (Gen-Ox ® ) and group III (LLLT and Gen-Ox ®). Four slides were prepared for each of the experimental time of 3, 5, 7 and 15 days for each group. Of the four slides, two were assessed for the expression of osteopontin and two of vimentin, in a total of 48 slides. On each slide two fields were considered for analysis: one in the bone-defect interface and the other near the periosteum, in a total of 96 fields. To perform the immunohistochemistry anti-vimentin and anti-osteopontin, we used the classical avidin-biotin peroxidase anti-peroxidase method. The positive staining was determined by identification of intracytoplasmic brown color in the reactions with both antibodies. The sections were analyzed in Zeiss microscope at a magnification of 200x, 400x and 1000x by two different observers. The average intensity of positive cells stained in the fields in each period was determined by a semiquantitative counting method which was classified by a scoring system as follow: 0 = no marking; + = mild labeling (up to one third of positive cells); + + = moderate labeling (up to two thirds of positive cells) and + + + = intense labeling (over two thirds of labeled cells). The results showed that all groups had marked for vimentin and osteopontin in all periods of the experiment. We observed a stronger cell labeling for vimentin in the initial healing period in group III. There were no differences in cell labeling for
osteopontin in animals subjected to low level laser therapy associated with graft as compared to other groups.
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O envolvimento da remodelação da cromatina no controle do comportamento agressivo dos carcinomas epidermoides de cabeça e pescoço / The involvement of chromatin remodeling in the control of head and neck squamous cell carcinoma behaviorGiudice, Fernanda Salgueiredo 10 December 2012 (has links)
Modificações nas histonas são conhecidas por regular a estrutura conformacional da cromatina e a expressão gênica em células adultas e células-tronco pluripotentes. Tem sido postulado que a acetilação e deacetilação das histonas podem influenciar a expressão de genes envolvidos na iniciação, progressão e metástase tumoral, além de contribuir para o desenvolvimento de resistência à quimioterapia. Assim, buscou-se avaliar a influência das modificações nas histonas sobre a biologia do carcinoma epidermoide de cabeça e pescoço (CECP) e sua respectiva subpopulação de células semelhantes às células-tronco (CSC). Inicialmente, foi checado os níveis de acetilação da histona H3 (membro das histonas nucleares associado à compactação da cromatina) em um painel representativo de linhagens celulares de CECP. Posteriormente, para estudar a influência do estroma tumoral no padrão de acetilação da histona H3, o microambiente do tumor foi mimetizado através da utilização de meio condicionado derivado do cultivo de fibroblastos e cultura primária de células endoteliais humanas. Além disso, validamos esses resultados in vitro por meio de amostras humanas de CECP. Finalmente, a acetilação e deacetilação da cromatina foi induzida, respectivamente, pela administração dos inibidores das enzimas histona deacetilase tricostatina A (TSA) e histona acetiltransferase curcumina, em linhagens celulares de CECP. Foi feita a análise da formação de esferas (ensaio funcional de células-tronco), juntamente com a verificação dos níveis de ALDH, marcador de células-tronco (citometria de fluxo - FACS), além da determinação do índice de proliferação tumoral (Ki-67) e realização dos ensaios de invasão e migração celular. Linhagens celulares de CECP apresentaram níveis baixos de acetilação da histona H3 e demonstraram capacidade de retenção de uma subpopulação de CSC. Apenas o meio condicionado de células endoteliais humanas foi capaz de alterar a conformação da cromatina, uma vez que induziu o aumento da acetilação da histona H3. Interessantemente, foi também notado um concomitante aumento da agressividade de linhagens celulares de CECP (aumento dos níveis de BMI-1 e vimentina). Esses resultados foram confirmados em amostras humanas de CECP que mostraram, apenas no fronte de invasão, células com cromatina acetilada. Curiosamente, essas mesmas células também expressaram vimentina. Os tratamentos com TSA e curcumina resultaram na diminuição significativa da subpopulação de CSC, interrompendo a formação de esferas e reduzindo os níveis de ALDH. Além disso, o tratamento com curcumina mostrou resultados muito interessantes, uma vez que gerou uma redução evidente da invasão celular e impactou por completo o potencial de migração tumoral, sendo nesse sentido mais eficiente que a cisplatina, droga antineoplásica bem estabelecida. Por outro lado, o tratamento com TSA induziu a transição epitélio-mesenquimal nas linhagens celulares de CECP, detectada pelo aumento da expressão de vimentina e indução de um fenótipo fusiforme, juntamente com o aumento da invasão tumoral e os níveis de BMI-1. Portanto, a organização da cromatina está envolvida na modulação da presença de CSC e os altos níveis de acetilação das histonas intensificam o comportamento agressivo de células de CECP. / Histone modifications are known to regulate chromatin conformation structure and gene expression in adult cells and pluripotent stem cells. It has been postulated that histone acetylation and deacetylation could influence the expression of genes involved in cancer initiation, progression, metastasis, and development of resistance to chemotherapies. Here, we sought to evaluate the influence of histone modifications over the biology of head and neck squamous cell carcinoma (HNSCC) and its stem cell-like subpopulation (CSC). Initially, we checked the status of histone H3 acetylation (a member of the core histones associated to chromatin compaction) in a representative set of HNSCC cell lines. Subsequently, to analyze the influence of tumor stroma over the histone H3 acetylation, we mimicked the tumor microenvironment by using conditioned medium from fibroblasts and primary human endothelial cells. Further we validated these in vitro findings through human samples of HNSCC. Finally, we induced chromatin acetylation and deacetylation by the administration of the histone deacetylase inhibitor trichostatin A (TSA) and histone acetyltransferase inhibitor curcumin, respectively, in HNSCC cell lines. The analysis of spheres formation (stem cell functional assay), along with the levels of stem cells marker ALDH (showed by flow cytometry - FACS), tumor proliferation index (Ki-67), invasion and migration cellular potencial were verified. HNSCC cell lines showed lower levels of histone H3 acetylation and ability to retain a subpopulation of CSC. Only conditioned media from human endothelial cells was able to alter the conformation of chromatin, since it induced the increase of histone H3 acetylation. Interestingly, it was also noted a concomitant augment of HNSCC cell lines aggressiveness (enhanced BMI-1 and vimentin levels). These findings were confirmed in human samples of HNSCC that showed, only at the invasive front, cells with acetylated chromatin. Curiously, these same cells also expressed vimentin. TSA and curcumin treatments resulted in significant decrease of the CSC subpopulation by disrupting the spheres and reducing the levels of ALDH. Also, curcumin treatment showed exciting results since it caused an evident reduction of cellular invasion and it impacted the tumoral migration potential, being more efficient than cisplantin, a well-established antineoplastic drug. However, TSA induced epithelial to mesenchymal transition in HNSCC cell lines detected by the upregulation of vimentin and the induction of a fusiform phenotype along with augmented tumor invasion and the levels of BMI-1. Chromatin organization is involved in the modulation of CSC where high levels of histone acetylation intensify the aggressive behavior of HNSCC cells.
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O envolvimento da remodelação da cromatina no controle do comportamento agressivo dos carcinomas epidermoides de cabeça e pescoço / The involvement of chromatin remodeling in the control of head and neck squamous cell carcinoma behaviorFernanda Salgueiredo Giudice 10 December 2012 (has links)
Modificações nas histonas são conhecidas por regular a estrutura conformacional da cromatina e a expressão gênica em células adultas e células-tronco pluripotentes. Tem sido postulado que a acetilação e deacetilação das histonas podem influenciar a expressão de genes envolvidos na iniciação, progressão e metástase tumoral, além de contribuir para o desenvolvimento de resistência à quimioterapia. Assim, buscou-se avaliar a influência das modificações nas histonas sobre a biologia do carcinoma epidermoide de cabeça e pescoço (CECP) e sua respectiva subpopulação de células semelhantes às células-tronco (CSC). Inicialmente, foi checado os níveis de acetilação da histona H3 (membro das histonas nucleares associado à compactação da cromatina) em um painel representativo de linhagens celulares de CECP. Posteriormente, para estudar a influência do estroma tumoral no padrão de acetilação da histona H3, o microambiente do tumor foi mimetizado através da utilização de meio condicionado derivado do cultivo de fibroblastos e cultura primária de células endoteliais humanas. Além disso, validamos esses resultados in vitro por meio de amostras humanas de CECP. Finalmente, a acetilação e deacetilação da cromatina foi induzida, respectivamente, pela administração dos inibidores das enzimas histona deacetilase tricostatina A (TSA) e histona acetiltransferase curcumina, em linhagens celulares de CECP. Foi feita a análise da formação de esferas (ensaio funcional de células-tronco), juntamente com a verificação dos níveis de ALDH, marcador de células-tronco (citometria de fluxo - FACS), além da determinação do índice de proliferação tumoral (Ki-67) e realização dos ensaios de invasão e migração celular. Linhagens celulares de CECP apresentaram níveis baixos de acetilação da histona H3 e demonstraram capacidade de retenção de uma subpopulação de CSC. Apenas o meio condicionado de células endoteliais humanas foi capaz de alterar a conformação da cromatina, uma vez que induziu o aumento da acetilação da histona H3. Interessantemente, foi também notado um concomitante aumento da agressividade de linhagens celulares de CECP (aumento dos níveis de BMI-1 e vimentina). Esses resultados foram confirmados em amostras humanas de CECP que mostraram, apenas no fronte de invasão, células com cromatina acetilada. Curiosamente, essas mesmas células também expressaram vimentina. Os tratamentos com TSA e curcumina resultaram na diminuição significativa da subpopulação de CSC, interrompendo a formação de esferas e reduzindo os níveis de ALDH. Além disso, o tratamento com curcumina mostrou resultados muito interessantes, uma vez que gerou uma redução evidente da invasão celular e impactou por completo o potencial de migração tumoral, sendo nesse sentido mais eficiente que a cisplatina, droga antineoplásica bem estabelecida. Por outro lado, o tratamento com TSA induziu a transição epitélio-mesenquimal nas linhagens celulares de CECP, detectada pelo aumento da expressão de vimentina e indução de um fenótipo fusiforme, juntamente com o aumento da invasão tumoral e os níveis de BMI-1. Portanto, a organização da cromatina está envolvida na modulação da presença de CSC e os altos níveis de acetilação das histonas intensificam o comportamento agressivo de células de CECP. / Histone modifications are known to regulate chromatin conformation structure and gene expression in adult cells and pluripotent stem cells. It has been postulated that histone acetylation and deacetylation could influence the expression of genes involved in cancer initiation, progression, metastasis, and development of resistance to chemotherapies. Here, we sought to evaluate the influence of histone modifications over the biology of head and neck squamous cell carcinoma (HNSCC) and its stem cell-like subpopulation (CSC). Initially, we checked the status of histone H3 acetylation (a member of the core histones associated to chromatin compaction) in a representative set of HNSCC cell lines. Subsequently, to analyze the influence of tumor stroma over the histone H3 acetylation, we mimicked the tumor microenvironment by using conditioned medium from fibroblasts and primary human endothelial cells. Further we validated these in vitro findings through human samples of HNSCC. Finally, we induced chromatin acetylation and deacetylation by the administration of the histone deacetylase inhibitor trichostatin A (TSA) and histone acetyltransferase inhibitor curcumin, respectively, in HNSCC cell lines. The analysis of spheres formation (stem cell functional assay), along with the levels of stem cells marker ALDH (showed by flow cytometry - FACS), tumor proliferation index (Ki-67), invasion and migration cellular potencial were verified. HNSCC cell lines showed lower levels of histone H3 acetylation and ability to retain a subpopulation of CSC. Only conditioned media from human endothelial cells was able to alter the conformation of chromatin, since it induced the increase of histone H3 acetylation. Interestingly, it was also noted a concomitant augment of HNSCC cell lines aggressiveness (enhanced BMI-1 and vimentin levels). These findings were confirmed in human samples of HNSCC that showed, only at the invasive front, cells with acetylated chromatin. Curiously, these same cells also expressed vimentin. TSA and curcumin treatments resulted in significant decrease of the CSC subpopulation by disrupting the spheres and reducing the levels of ALDH. Also, curcumin treatment showed exciting results since it caused an evident reduction of cellular invasion and it impacted the tumoral migration potential, being more efficient than cisplantin, a well-established antineoplastic drug. However, TSA induced epithelial to mesenchymal transition in HNSCC cell lines detected by the upregulation of vimentin and the induction of a fusiform phenotype along with augmented tumor invasion and the levels of BMI-1. Chromatin organization is involved in the modulation of CSC where high levels of histone acetylation intensify the aggressive behavior of HNSCC cells.
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Peeling de fenol pontuado no tratamento do fotoenvelhecimento facial: estudo histoquímico e imuno-histoquímicoMendonça, Maria Cristina Cardoso de 12 July 2018 (has links)
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Previous issue date: 2018-07-12 / Introdução: A aparência física da população, que vive cada dia mais, vem assumindo um papel significativo quando nos referimos à saúde e bem-estar geral. Portanto as questões dermatológicas assumem, a cada dia, uma grande importância médica. Os peelings químicos são um importante arsenal terapêutico, sendo o peeling de fenol classicamente recomendado para tratamento de clareamento de pele, atenuação das rugas estáticas e flacidez cutânea da face, exigindo sedação em ambiente hospitalar. Na técnica pontuada, sua execução pode ser feita em ambiente ambulatorial, com segurança. Objetivo: investigar os mecanismos pelos quais a técnica se mostra eficaz quando aplicado de forma pontuada, avaliando as alterações da matriz extracelular colagenosa, das fibras elásticas e as fibras colágenas Tipo I e Tipo III, por morfometria automática, e o aumento de células de origem mesenquimal da derme através da imuno-histoquímica. Métodos: Foram utilizados blocos de biópsias de pele da face de pacientes do sexo feminino (n = 17) realizadas antes e depois do tratamento que foram atendidas no Serviço de Dermatologia do Hospital Universitário da Universidade Federal de Juiz de Fora, submetidas ao protocolo de cinco sessões de peeling de fenol pontuado. Os cortes histológicos foram submetidos à análise histopatológica de rotina (HE), análise histoquímica para fibras elásticas (Verhöeff) e para fibras colágenas Tipo I e Tipo III (picrosirius red) e à análise imuno-histoquímica para células com expressão vimentina positiva na derme. Três pacientes foram excluídas, por material insuficiente nos blocos para todas essas colorações. Os dados foram expressos em média aritmética simples ± desvio padrão, mediana e expostos em boxplot. Resultados: Ao compararmos as concentrações de matriz extracelular colagenosa pelo HE e de fibras elásticas (Verhöeff) houve uma relação inversa na histomorfometria, onde das oito pacientes que apresentavam as menores concentrações de fibras colágenas do grupo, seis possuíam as maiores concentrações de fibras elásticas. Das seis pacientes que apresentavam as maiores concentrações de fibras colágenas do grupo, todas apresentavam concentração abaixo da média do grupo para fibras elásticas. Quanto a análise da relação entre fibras colágenas Tipo III e Tipo I, houve uma inversão de valores por maior ganho de fibras colágenas Tipo I em relação as fibras colágenas Tipo III. Na imuno-histoquímica, 64,28% das pacientes (n = 9) apresentou aumento da celularidade mesenquimal. Conclusão: os resultados sugerem que a melhora clínica no tratamento do fotoenvelhecimento facial com a técnica proposta pode estar correlacionada com o maior equilíbrio entre material colágeno e elástico, com maior produção de fibras colágenas Tipo I em relação as fibras colágenas Tipo III e com o aumento do número de células mesenquimais nas amostras pós-tratamento. Diante dos resultados sugerimos que novos estudos sejam realizados, tanto clínicos quanto experimentais, para melhor elucidar os mecanismos de ação da técnica. / Introduction: The physical appearance of the population has been increasingly taking on a significant role when we speak of general health and well-being. Thus, dermatological questions take on an ever greater medical significance. Chemical peels are an important therapeutic arsenal, with phenol peeling being classically recommended for treatment of skin lightening, attenuation of static wrinkles and facial skin flaccidity, requiring sedation in a hospital environment. In the punctuated technique, treatment can safely be done in an outpatient setting. Objective: investigating the mechanisms by which the technique proves effective when applied in a punctuated form and evaluating the changes in the collagenous extracellular matrix, elastic fibers and Type I and Type III collagen fibers, by automatic morphometry, and the increase of dermal mesenchymal cells, through immunohistochemistry. Methods: Facial skin biopsy blocks from female patients (n = 17), taken before and after treatment at the Dermatology Service of the Universidade Federal de Juiz de Fora University Hospital, were used. Patients were submitted to the protocol of five punctuated phenol peeling sessions. The histological sections were submitted to routine histopathological analysis (HE), histochemical analysis for elastic fibers (Verhöeff) and for Type I and Type III collagen fibers (picrosirius red), and immunohistochemical analysis for cells with positive vimentin expression in the dermis. Three patients were excluded because of insufficient material in the blocks for all of these stains. The data were expressed as simple arithmetic mean ± standard deviation, median, and shown in boxplot. Results: Upon comparing the collagenous extracellular matrix concentrations by HE and for elastic fibers (Verhöeff), there was an inverse relation in the histomorphometry, where of the eight patients with the lowest concentrations of collagen fibers in the group, six had the highest concentrations of elastic fibers. Of the six patients who had the highest concentrations of collagen fibers in the group, all of them had a concentration for elastic fibers below the group mean. Regarding the analysis of the relationship between Type III and Type I collagen fibers, there was an inversion of values due to the higher gain of Type I collagen fibers in relation to Type III collagen fibers. In the immunohistochemistry, 64. 28% of the patients (n = 9) presented increased mesenchymal cellularity. Conclusion: the results suggest that the clinical improvement in the treatment of facial photoaging with the proposed technique may be correlated with the greater balance between collagen and elastic material, with a higher production of Type I collagen fibers in relation to Type III collagen fibers, and with the increase of the number of mesenchymal cells in the post-treatment samples. In view of the results, we suggest that new studies be conducted, both clinical and experimental, to better elucidate the action mechanisms of the technique.
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Análise imunocitoquímica e de expressão gênica de efeitos do bevacizumabe em explantes de retina de ratos lister e em linhagem celular de glia de Müller humana / Immunocytochemistry and gene expression effects of bevacizumab on retinal explants of rats lister and glial cell line of human Müller analysisKrempel, Paloma Gava 09 June 2015 (has links)
INTRODUÇÃO: As doenças retinianas associadas à neovascularização, tais como a degeneração macular relacionada à idade e as retinopatias diabética e da prematuridade são as principais e mais importantes causas da cegueira em todo o mundo. Nos últimos anos, injeções intravítreas de fármacos com ação antiangiogênica, como o bevacizumabe (BVZ), têm sido de grande valia tanto em pacientes na fase adulta quanto nos recém-natos. Todavia, estudos experimentais in vitro e in vivo sugerem que essas drogas promovam efeitos adversos sobre alguns processos celulares, interferindo diretamente em mecanismos fisiológicos que mantém a homeostase do tecido retiniano, incluindo os mecanismos de proliferação, diferenciação e morte celular. OBJETIVO: investigar o efeito do BVZ nos processos de transcrição e tradução de marcadores da gliose: GFAP e vimentina, de morte celular, caspase-3 e beclina-1, e dos proteoglicanos relacionados à manutenção e desenvolvimento de tecido retiniano: neurocam, fosfacam e sindecam-3. MÉTODOS: Dois modelos experimentais foram usados nesse estudo: 1) linhagem celular de Müller de Glia humana adulta (MIO-M1), cultivada em meio de cultura D-MEM na presença e ausência de BVZ por 12 e 24 horas nas concentrações de 0,25 mg/mL e 0,50 mg/mL e 2) explantes de retinas de ratos 2 dias pós-nascidos submetidos à 0,50 mg/mL da droga por 48 horas. Durante este período foram mantidos a 5% de dióxido de carbono à temperatura de 37°C. A análise de proteínas foi realizada por imunocitohistoquímica e Western Blotting e a expressão de RNAm, pela reação em cadeia da polimerase em tempo real (PCR Real Time). Foi utilizado o Teste de ANOVA - fator único para a comparação entre os grupos controle e tratados com BVZ de um mesmo período (12h ou 24h) e o teste t de Student para a comparação entre as mesmas concentrações de 12h e 24h, e para a comparação entre os grupos controle e tratado com BVZ dos explantes (p < 0,05). RESULTADOS: Nas células MIO-M1, o BVZ, aumentou a expressão gênica e diminui a tradução de VEGF na concentração de 0,50 mg/mL em 24h comparado a 12h. Para o GFAP, houve um aumento da transcrição em 0,50 mg/mL em 24h comparado a 12h e aos outros grupos em 24h. Entretanto, houve diminuição da tradução para estes mesmos períodos e condições. Para a vimentina, houve aumento na transcrição em 0,50 mg/mL após 24h. Os achados de beclina-1 revelaram uma diminuição da transcrição e tradução em 0,25 mg/mL em 24h comparado a 12h. A transcrição entre os grupos do mesmo período aumentou nos grupos tratados com BVZ tanto em 12h quanto em 24h. A tradução da beclina-1 diminuiu em 0,25 mg/mL, mas aumentou em 0,50 mg/mL em 24h em relação à 12h. A comparação entre os grupos de 24h revelou aumento da tradução em 0,50 mg/mL. Para a caspase-3, houve diminuição da transcrição em 0,25 mg/mL e 0,50 mg/mL em 24h em relação a 12h e entre nos grupos tratados com BVZ em 24h. A tradução revelou um aumento em 0,50 mg/mL em 24h em relação a 12h. No fosfacam, houve diminuição da transcrição em 0,50 mg/mL em 24h comparado a 12h e entre os grupos tratados com BVZ e controles para 12h e 24h. A transcrição de neurocam diminuiu em 0,25 mg/mL e 0,50 mg/mL em 24h comparado a 12h e entre os grupos tratados com BVZ e controles em 12h e 24h. A tradução aumentou em 0,50 mg/mL em 24h em relação a 12h, mas diminuiu entre os grupos em 24h. Nos explantes, a transcrição e tradução de VEGF diminuiram no grupo tratado com BVZ após 48h. CONCLUSÃO: Nossos resultados relacionados às células MIO-M1 e ao explante de ratos, in vitro, nos permitem aventar o possível comprometimento ocasionado pela depleção do VEGF pelo BVZ na homeostase do tecido retiniano, in vivo, interferindo nas moléculas envolvidas na morte e diferenciação celular e na neuroproteção em indivíduos em fase adulta e recém-nato / Backgraound: Vasoproliferative retinal disorders such as age-related macular, degeneration, diabetic retinopathy and retinopathy of prematurity are major causes of blindness in the world. In recent years, intravitreal injections of drugs with antiangiogenic action, as bevacizumab, have been very useful for both patients in adulthood and in newborns. However, experimental studies, in vivo and in vitro, suggest that antiangiogenic drugs may promote side effects in cellular proceedings, interfering directly in physiological mechanisms of cellular proliferation, differentiation and death. POURPOSE: Investigate the bevacizumab effects in transcription and translation processes of gliosis, GFAP and vimentin, cellular death markers, caspase-3 and beclin-1, and proteoglycans involved in retinal tissue maintenance and development, neurocan, phosphacan and syndecan-3. METHODS: Two experimental models were used on this research: cellular lineage of adult and human Müller glial cell(MIO-M1) were cultivated on D-MEM medium with 0,25 and 0,50 mg/mL bevacizumab for 12 and 24 hours, and two days old rat retinal explants submitted to 0,50 mg/mL for 48 hours. During this period were stored in laboratory ovens at 5% carbon dioxide pressure and 37 °C average temperature. Molecular techniques were used to evaluate gene expression and protein content. Protein assessments were performed by immunocytochemistry and western blotting analysis, while Real Time PCR was used to measure mRNA content. ANOVA tests one factor were applied to compare the control and BVZ groups of the same period (12h or 24h) and t test from Student to compare the same conditions of 12h and 24h, and to compare the control and BVZ retinal explants groups (p<0.05). RESULTS: At MIO-M1 cells, BVZ increased the gene expression and reduced the translation of VEGF at concentration of 0.50 mg / mL in 24 hours compared to 12 hours. For GFAP, there was an increase of transcription at 0.50 mg / mL in 24 hours compared to 12 hours and to the other groups at 24 hours. However, there was a decrease in translation for these same periods and conditions. For vimentin, there was an increase in transcription at 0.50 mg / mL after 24 hours. The beclin-1 findings revealed a decrease of transcription and translation at 0.25 mg / ml compared at 24 h compared to 12h. Transcription among groups increased in BVZ treated groups at 12h and 24h. The translation of beclin-1 decreased at 0.25 mg / ml, but increased at 0.50 mg / mL at 24 hours compared to 12 hours. The comparison between the groups at 24h revealed an increased in translation at 0.50 mg / mL. For caspase-3, there was a decrease in transcription at 0.25 mg / ml and 0.50 mg / ml at 24 compared to 12 hours and among BVZ treated groups at 24h. Translation revealed an increase at 0.50 mg / mL at 24 hours compared to 12 hours. For fosfacam, there was a decreased in transcription at 0.50 mg / mL in 24 hours compared to 12 hours and among BVZ treated groups and controls at 12h and 24h. The transcription of neurocam decreased at 0.25 mg / ml and 0.50 mg / ml at 24 hours compared to 12 hours and among BVZ treated groups and controls at 12h and 24h. Translation increased at 0.50 mg / mL at 24 compared to 12 hours, but decreased among the groups at 24 hours. For explants, transcription and translation of VEGF decreased in the BVZ group treated after 48h. CONCLUSION: Our results related to the MIO-M1 cells and explants of rats,in vitro, allow us to suggest the possible impairment caused by depletion of VEGF by BVZ in the homeostasis of retinal tissue, in vivo, interfering in the molecules involved in cell death and cell differentiation and neuroprotection in individuals in adulthood and newborns
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Análise imunocitoquímica e de expressão gênica de efeitos do bevacizumabe em explantes de retina de ratos lister e em linhagem celular de glia de Müller humana / Immunocytochemistry and gene expression effects of bevacizumab on retinal explants of rats lister and glial cell line of human Müller analysisPaloma Gava Krempel 09 June 2015 (has links)
INTRODUÇÃO: As doenças retinianas associadas à neovascularização, tais como a degeneração macular relacionada à idade e as retinopatias diabética e da prematuridade são as principais e mais importantes causas da cegueira em todo o mundo. Nos últimos anos, injeções intravítreas de fármacos com ação antiangiogênica, como o bevacizumabe (BVZ), têm sido de grande valia tanto em pacientes na fase adulta quanto nos recém-natos. Todavia, estudos experimentais in vitro e in vivo sugerem que essas drogas promovam efeitos adversos sobre alguns processos celulares, interferindo diretamente em mecanismos fisiológicos que mantém a homeostase do tecido retiniano, incluindo os mecanismos de proliferação, diferenciação e morte celular. OBJETIVO: investigar o efeito do BVZ nos processos de transcrição e tradução de marcadores da gliose: GFAP e vimentina, de morte celular, caspase-3 e beclina-1, e dos proteoglicanos relacionados à manutenção e desenvolvimento de tecido retiniano: neurocam, fosfacam e sindecam-3. MÉTODOS: Dois modelos experimentais foram usados nesse estudo: 1) linhagem celular de Müller de Glia humana adulta (MIO-M1), cultivada em meio de cultura D-MEM na presença e ausência de BVZ por 12 e 24 horas nas concentrações de 0,25 mg/mL e 0,50 mg/mL e 2) explantes de retinas de ratos 2 dias pós-nascidos submetidos à 0,50 mg/mL da droga por 48 horas. Durante este período foram mantidos a 5% de dióxido de carbono à temperatura de 37°C. A análise de proteínas foi realizada por imunocitohistoquímica e Western Blotting e a expressão de RNAm, pela reação em cadeia da polimerase em tempo real (PCR Real Time). Foi utilizado o Teste de ANOVA - fator único para a comparação entre os grupos controle e tratados com BVZ de um mesmo período (12h ou 24h) e o teste t de Student para a comparação entre as mesmas concentrações de 12h e 24h, e para a comparação entre os grupos controle e tratado com BVZ dos explantes (p < 0,05). RESULTADOS: Nas células MIO-M1, o BVZ, aumentou a expressão gênica e diminui a tradução de VEGF na concentração de 0,50 mg/mL em 24h comparado a 12h. Para o GFAP, houve um aumento da transcrição em 0,50 mg/mL em 24h comparado a 12h e aos outros grupos em 24h. Entretanto, houve diminuição da tradução para estes mesmos períodos e condições. Para a vimentina, houve aumento na transcrição em 0,50 mg/mL após 24h. Os achados de beclina-1 revelaram uma diminuição da transcrição e tradução em 0,25 mg/mL em 24h comparado a 12h. A transcrição entre os grupos do mesmo período aumentou nos grupos tratados com BVZ tanto em 12h quanto em 24h. A tradução da beclina-1 diminuiu em 0,25 mg/mL, mas aumentou em 0,50 mg/mL em 24h em relação à 12h. A comparação entre os grupos de 24h revelou aumento da tradução em 0,50 mg/mL. Para a caspase-3, houve diminuição da transcrição em 0,25 mg/mL e 0,50 mg/mL em 24h em relação a 12h e entre nos grupos tratados com BVZ em 24h. A tradução revelou um aumento em 0,50 mg/mL em 24h em relação a 12h. No fosfacam, houve diminuição da transcrição em 0,50 mg/mL em 24h comparado a 12h e entre os grupos tratados com BVZ e controles para 12h e 24h. A transcrição de neurocam diminuiu em 0,25 mg/mL e 0,50 mg/mL em 24h comparado a 12h e entre os grupos tratados com BVZ e controles em 12h e 24h. A tradução aumentou em 0,50 mg/mL em 24h em relação a 12h, mas diminuiu entre os grupos em 24h. Nos explantes, a transcrição e tradução de VEGF diminuiram no grupo tratado com BVZ após 48h. CONCLUSÃO: Nossos resultados relacionados às células MIO-M1 e ao explante de ratos, in vitro, nos permitem aventar o possível comprometimento ocasionado pela depleção do VEGF pelo BVZ na homeostase do tecido retiniano, in vivo, interferindo nas moléculas envolvidas na morte e diferenciação celular e na neuroproteção em indivíduos em fase adulta e recém-nato / Backgraound: Vasoproliferative retinal disorders such as age-related macular, degeneration, diabetic retinopathy and retinopathy of prematurity are major causes of blindness in the world. In recent years, intravitreal injections of drugs with antiangiogenic action, as bevacizumab, have been very useful for both patients in adulthood and in newborns. However, experimental studies, in vivo and in vitro, suggest that antiangiogenic drugs may promote side effects in cellular proceedings, interfering directly in physiological mechanisms of cellular proliferation, differentiation and death. POURPOSE: Investigate the bevacizumab effects in transcription and translation processes of gliosis, GFAP and vimentin, cellular death markers, caspase-3 and beclin-1, and proteoglycans involved in retinal tissue maintenance and development, neurocan, phosphacan and syndecan-3. METHODS: Two experimental models were used on this research: cellular lineage of adult and human Müller glial cell(MIO-M1) were cultivated on D-MEM medium with 0,25 and 0,50 mg/mL bevacizumab for 12 and 24 hours, and two days old rat retinal explants submitted to 0,50 mg/mL for 48 hours. During this period were stored in laboratory ovens at 5% carbon dioxide pressure and 37 °C average temperature. Molecular techniques were used to evaluate gene expression and protein content. Protein assessments were performed by immunocytochemistry and western blotting analysis, while Real Time PCR was used to measure mRNA content. ANOVA tests one factor were applied to compare the control and BVZ groups of the same period (12h or 24h) and t test from Student to compare the same conditions of 12h and 24h, and to compare the control and BVZ retinal explants groups (p<0.05). RESULTS: At MIO-M1 cells, BVZ increased the gene expression and reduced the translation of VEGF at concentration of 0.50 mg / mL in 24 hours compared to 12 hours. For GFAP, there was an increase of transcription at 0.50 mg / mL in 24 hours compared to 12 hours and to the other groups at 24 hours. However, there was a decrease in translation for these same periods and conditions. For vimentin, there was an increase in transcription at 0.50 mg / mL after 24 hours. The beclin-1 findings revealed a decrease of transcription and translation at 0.25 mg / ml compared at 24 h compared to 12h. Transcription among groups increased in BVZ treated groups at 12h and 24h. The translation of beclin-1 decreased at 0.25 mg / ml, but increased at 0.50 mg / mL at 24 hours compared to 12 hours. The comparison between the groups at 24h revealed an increased in translation at 0.50 mg / mL. For caspase-3, there was a decrease in transcription at 0.25 mg / ml and 0.50 mg / ml at 24 compared to 12 hours and among BVZ treated groups at 24h. Translation revealed an increase at 0.50 mg / mL at 24 hours compared to 12 hours. For fosfacam, there was a decreased in transcription at 0.50 mg / mL in 24 hours compared to 12 hours and among BVZ treated groups and controls at 12h and 24h. The transcription of neurocam decreased at 0.25 mg / ml and 0.50 mg / ml at 24 hours compared to 12 hours and among BVZ treated groups and controls at 12h and 24h. Translation increased at 0.50 mg / mL at 24 compared to 12 hours, but decreased among the groups at 24 hours. For explants, transcription and translation of VEGF decreased in the BVZ group treated after 48h. CONCLUSION: Our results related to the MIO-M1 cells and explants of rats,in vitro, allow us to suggest the possible impairment caused by depletion of VEGF by BVZ in the homeostasis of retinal tissue, in vivo, interfering in the molecules involved in cell death and cell differentiation and neuroprotection in individuals in adulthood and newborns
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