O vinho é a bebida obtida por meio da fermentação alcoólica do mosto simples de uva sã, fresca e madura. Durante o processo fermentativo, realizado por leveduras Saccharomyces cerevisiae, ocorre uma sucessão de microrganismos. Espécies pertencentes aos gêneros Brettanomyces e Dekkera permanecem no produto final podendo influenciar de forma negativa ao produzirem compostos fenólicos voláteis. Estas leveduras apresentam como uma de suas características a lenta taxa de crescimento. Com isto, este trabalho teve como objetivo o desenvolvimento de meio de cultivo para isolamento e detecção destas leveduras e de metodologia molecular para detecção independente de cultivo. O meio de cultivo desenvolvido permitiu o isolamento e também a diferenciação de leveduras dos gêneros Brettanomyces e Dekkera das demais leveduras comumente encontradas em vinho. Uma metodologia molecular, baseada em PCR convencional, foi desenvolvida para a detecção dos gêneros em vinhos. Inicialmente foram construídos dois pares de oligonucleotídeos. Um par universal para leveduras e outro específico para D. bruxellensis. O primeiro par apresentou ampla aplicabilidade na avaliação da efetividade de diferentes processos de extração de DNA e na detecção de compostos inibidores presentes em amostras de vinho. A utilização de ambos os pares permitiu o desenvolvimento de um protocolo de extração e amplificação de DNA diretamente de amostras de vinho, facilitando a identificação de leveduras D. bruxellensis e permitindo a tomada de decisão em tempo hábil de evitar perdas econômicas. / The wine is a beverage obtained by alcoholic fermentation of simple must of healthy, fresh and mature grape. During the fermentation process, carried out by Saccharomyces cerevisiae yeasts, these is a succession of microorganisms. Species belonging to the genera Brettanomyces and Dekkera remain in the final product can influence negatively by producing volatile phenolic compounds. These yeasts present as one the features of the slow rate of growth. This work aimed at the development of culture media for isolation and detection of these strains and molecular methods for detection of independent culture. The medium developed also allowed the isolation and differentiation of yeasts of the genera Brettanomyces and Dekkera yeasts from other commonly found in wine. A molecular approach, based on conventional PCR, was developed for the detection of genera in wines. Initially we constructed two sets of primers. A universal pair for yeast and other specific for D. bruxellensis. The first pair showed a broad applicability in evaluating the effectiveness of various procedures for DNA extraction and detection of inhibitory compounds present in wine samples. The use of both pairs allowed development of a protocol for extracting and amplifying DNA directly from wine samples, facilitating the identification of yeasts D. bruxellensis and allowing the decision-making in a timely manner to avoid economic losses.

Um chocolate amargo com alto teor de cacau (71%) foi desenvolvido e codificado como D71. Previamente, foi realizada a seleção da amostra de liquor de cacau mais rica em polifenóis e flavonóides, dentre três amostras recebidas de fornecedores diferentes. Como comparativo, quatro variedades de vinho tinto foram estudadas (Merlot, Cabernet Sauvignon, Pinot-Noir e Tannat) e o vinho Tannat selecionado. Para caracterizar o produto D71 sua quantidade de polifenóis e flavonóides foi comparada a amostras de chocolate amargo comerciais contendo diferentes percentuais de cacau: 50%, 70%, 72%, 86% e 99%. Em um segundo passo, efetuou-se a comparação do D71 com diferentes tipos de chocolate comerciais: branco (WC), ao leite (MC) e meio amargo (D40). O produto D71 demonstrou menor quantidade de polifenóis em relação às amostras comerciais de chocolate amargo, porém similar quantidade de flavonóides. Quando as amostras de WC, MC e D40 foram comparadas ao D71, este produto mostrou superioridade significativa em relação aos teores de polifenóis e flavonóides. Comparando a quantidade de flavonóides presentes no D71 e no vinho tinto Tannat verificou-se que para obtenção da mesma quantidade de flavonóides de 196 mL deste vinho seria necessário o consumo de 49g do chocolate desenvolvido (D71). Esta relação foi utilizada para o ensaio in vivo com ratos da raça Wistar, realizado por um período de 45 dias. Os resultados obtidos nas análises do sangue demonstraram que as taxas de LDL oxidado (ox-LDL) nos ratos que consumiram vinho tinto puro ou vinho tinto combinado com o chocolate foram superiores às dos ratos que consumiram somente chocolate. Quando o efeito sinérgico das duas fontes de antioxidantes foi avaliado, o ox-LDL mostrou-se ainda mais elevado sugerindo uma interação negativa entre os antioxidantes do chocolate D71 com o vinho tinto Tannat. A análise do colesterol total no fígado mostrou níveis reduzidos nos grupos que ingeriram vinho tinto sendo coerente com os resultados sangüíneos. Os dados obtidos neste trabalho permitem sugerir que estes compostos presentes no D71, quando ingeridos na ausência do vinho tinto (Tannat), apresentam melhor capacidade antioxidante; demonstrando o potencial efeito benéfico dos polifenóis e flavonóides do chocolate amargo (D71) à saúde. / The evaluation of potential benefits to health of dark chocolate in a comparison with red wine was studied. For that, a dark chocolate with a high level of cocoa (71%, labeled as D71) was developed and the quantity of polyphenols and flavonoids of the sample was measured. Previous to the manufacture of chocolate, cocoa liquor was selected based on the amount of antioxidants. Red wine polyphenols and flavonoids were also evaluated and Tannat was selected between four varieties (Merlot, Cabernet Sauvignon, Pinot-Noir and Tannat). The quantity of antioxidants of D71 was analyzed and compared with other samples of dark chocolate with different levels of cocoa (50%, 70%, 72%, 86% and 99%) and with different types of chocolate (White, Milk and Dark with 40% of cocoa). D71 was the lowest in polyphenols levels, but similar in flavonoids quantity. When compared with different types of chocolate, D71 showed the highest amount of polyphenols and flavonoids and a statistical difference could be observed. The obtained results of D71 and Tannat showed that to ingest the same amount of flavonoids found in 196 ml of Tannat an adult has to eat 49g of D71. This proportion was used to an in vivo assay with Wistar rats for 45 days. Results obtained in blood analysis showed that oxidized LDL (ox-LDL) in rats that ingested red wine was higher than the groups that ingested only chocolate. When synergic effect of these two sources of antioxidants was measured, the ox-LDL showed the highest values, suggesting a competition between these antioxidants. Total cholesterol in liver showed lower levels in groups that ingested red wine that was a consistent result when compared to ox-LDL in blood. This research suggests that antioxidants from D71, in absence of Tannat Red Wine, could contribute to health benefits.

A levedura Brettanomyces/Dekkera pode causar alterações importantes em vinhos tintos, com a formação de etil-fenóis, compostos de aromas desagradáveis. Este estudo teve como objetivo determinar a presença dessa levedura e de etil-fenóis em vinhos tintos comerciais e durante a vinificação em escala industrial, além de observar sua possível inibição pelo ácido sórbico. Brettanomyces/Dekkera foi quantificada em meio seletivo, e etil-fenóis, por cromatografia gasosa. SO2 livre e total, álcool, extrato seco total, açúcares residuais, acidez total e volátil e pH também foram determinados. O crescimento durante a vinificação foi acompanhado usando diferentes meios seletivos. Dekkera bruxellensis (NRRL Y – 12961) e leveduras isoladas de vinhos brasileiros foram cultivadas em meio sintético e vinho, contendo ácido sórbico entre 0 e 250 mg/L. Das 126 amostras de vinhos comerciais, 26,98% apresentaram Brettanomyces/Dekkera, e 46,03%, etil-fenóis acima do limiar de 426 μg/L, com SO2 e álcool mostrando-se como fatores limitantes. A passagem dos vinhos por barricas e as variedades de uva não influenciaram os níveis de contaminação e de etil-fenóis. Durante a vinificação, Brettanomyces/Dekkera foi detectada a partir do mosto. A baixa população não foi suficiente para formar etil-fenóis durante cinco meses após o esmagamento. Os meios não foram completamente seletivos, especialmente para uvas e mostos. O ácido sórbico inibiu a cepa de Dekkera bruxellensis (NRRL Y – 12961), especialmente para concentrações acima de 150 mg/L, sendo variável o grau de inibição para os isolados. / The yeast Brettanomyces/Dekkera can cause significant spoilage in red wines, with the production of ethylphenols, compounds of unpleasant odors. This study aimed at determining the presence of this yeast and ethylphenols in commercial red wines during vinification in industrial scale and to observe its possible inhibition by sorbic acid. Brettanomyces/Dekkera was quantified on selective medium, while ethyphenols were quantified by gas chromatography. Free and total SO2, alcohol, total dry extract, residual sugar, total and volatile acidity, and pH were also determined. The growth during winemaking was followed using different selective media. Dekkera bruxellensis (NRRL Y – 12961) and Brazilian wines yeasts were grown in synthetic medium and in wine, containing sorbic acid between 0 and 250 mg/L. Brettanomyces/Dekkera was present in 26.98% of the 126 samples of commercial wines. The ethylphenols were above of the 426 μg/L threshold in 46.03% of the samples. SO2 and alcohol were limiting factors. The stage in barrels and the varieties did not affect the levels of contamination and ethylphenols. During winemaking, Brettanomyces/Dekkera was detected from the must. The low population was not enough to produce ethylphenols in five months after crushing. The media were not completely selective, especially for grapes and musts. Sorbic acid inhibited the strains of Dekkera bruxellensis (NRRL Y – 12961), especially at concentrations above 150 mg/L, with variable degree of inhibition for the isolates.

A levedura Brettanomyces/Dekkera pode causar alterações importantes em vinhos tintos, com a formação de etil-fenóis, compostos de aromas desagradáveis. Este estudo teve como objetivo determinar a presença dessa levedura e de etil-fenóis em vinhos tintos comerciais e durante a vinificação em escala industrial, além de observar sua possível inibição pelo ácido sórbico. Brettanomyces/Dekkera foi quantificada em meio seletivo, e etil-fenóis, por cromatografia gasosa. SO2 livre e total, álcool, extrato seco total, açúcares residuais, acidez total e volátil e pH também foram determinados. O crescimento durante a vinificação foi acompanhado usando diferentes meios seletivos. Dekkera bruxellensis (NRRL Y – 12961) e leveduras isoladas de vinhos brasileiros foram cultivadas em meio sintético e vinho, contendo ácido sórbico entre 0 e 250 mg/L. Das 126 amostras de vinhos comerciais, 26,98% apresentaram Brettanomyces/Dekkera, e 46,03%, etil-fenóis acima do limiar de 426 μg/L, com SO2 e álcool mostrando-se como fatores limitantes. A passagem dos vinhos por barricas e as variedades de uva não influenciaram os níveis de contaminação e de etil-fenóis. Durante a vinificação, Brettanomyces/Dekkera foi detectada a partir do mosto. A baixa população não foi suficiente para formar etil-fenóis durante cinco meses após o esmagamento. Os meios não foram completamente seletivos, especialmente para uvas e mostos. O ácido sórbico inibiu a cepa de Dekkera bruxellensis (NRRL Y – 12961), especialmente para concentrações acima de 150 mg/L, sendo variável o grau de inibição para os isolados. / The yeast Brettanomyces/Dekkera can cause significant spoilage in red wines, with the production of ethylphenols, compounds of unpleasant odors. This study aimed at determining the presence of this yeast and ethylphenols in commercial red wines during vinification in industrial scale and to observe its possible inhibition by sorbic acid. Brettanomyces/Dekkera was quantified on selective medium, while ethyphenols were quantified by gas chromatography. Free and total SO2, alcohol, total dry extract, residual sugar, total and volatile acidity, and pH were also determined. The growth during winemaking was followed using different selective media. Dekkera bruxellensis (NRRL Y – 12961) and Brazilian wines yeasts were grown in synthetic medium and in wine, containing sorbic acid between 0 and 250 mg/L. Brettanomyces/Dekkera was present in 26.98% of the 126 samples of commercial wines. The ethylphenols were above of the 426 μg/L threshold in 46.03% of the samples. SO2 and alcohol were limiting factors. The stage in barrels and the varieties did not affect the levels of contamination and ethylphenols. During winemaking, Brettanomyces/Dekkera was detected from the must. The low population was not enough to produce ethylphenols in five months after crushing. The media were not completely selective, especially for grapes and musts. Sorbic acid inhibited the strains of Dekkera bruxellensis (NRRL Y – 12961), especially at concentrations above 150 mg/L, with variable degree of inhibition for the isolates.

Um chocolate amargo com alto teor de cacau (71%) foi desenvolvido e codificado como D71. Previamente, foi realizada a seleção da amostra de liquor de cacau mais rica em polifenóis e flavonóides, dentre três amostras recebidas de fornecedores diferentes. Como comparativo, quatro variedades de vinho tinto foram estudadas (Merlot, Cabernet Sauvignon, Pinot-Noir e Tannat) e o vinho Tannat selecionado. Para caracterizar o produto D71 sua quantidade de polifenóis e flavonóides foi comparada a amostras de chocolate amargo comerciais contendo diferentes percentuais de cacau: 50%, 70%, 72%, 86% e 99%. Em um segundo passo, efetuou-se a comparação do D71 com diferentes tipos de chocolate comerciais: branco (WC), ao leite (MC) e meio amargo (D40). O produto D71 demonstrou menor quantidade de polifenóis em relação às amostras comerciais de chocolate amargo, porém similar quantidade de flavonóides. Quando as amostras de WC, MC e D40 foram comparadas ao D71, este produto mostrou superioridade significativa em relação aos teores de polifenóis e flavonóides. Comparando a quantidade de flavonóides presentes no D71 e no vinho tinto Tannat verificou-se que para obtenção da mesma quantidade de flavonóides de 196 mL deste vinho seria necessário o consumo de 49g do chocolate desenvolvido (D71). Esta relação foi utilizada para o ensaio in vivo com ratos da raça Wistar, realizado por um período de 45 dias. Os resultados obtidos nas análises do sangue demonstraram que as taxas de LDL oxidado (ox-LDL) nos ratos que consumiram vinho tinto puro ou vinho tinto combinado com o chocolate foram superiores às dos ratos que consumiram somente chocolate. Quando o efeito sinérgico das duas fontes de antioxidantes foi avaliado, o ox-LDL mostrou-se ainda mais elevado sugerindo uma interação negativa entre os antioxidantes do chocolate D71 com o vinho tinto Tannat. A análise do colesterol total no fígado mostrou níveis reduzidos nos grupos que ingeriram vinho tinto sendo coerente com os resultados sangüíneos. Os dados obtidos neste trabalho permitem sugerir que estes compostos presentes no D71, quando ingeridos na ausência do vinho tinto (Tannat), apresentam melhor capacidade antioxidante; demonstrando o potencial efeito benéfico dos polifenóis e flavonóides do chocolate amargo (D71) à saúde. / The evaluation of potential benefits to health of dark chocolate in a comparison with red wine was studied. For that, a dark chocolate with a high level of cocoa (71%, labeled as D71) was developed and the quantity of polyphenols and flavonoids of the sample was measured. Previous to the manufacture of chocolate, cocoa liquor was selected based on the amount of antioxidants. Red wine polyphenols and flavonoids were also evaluated and Tannat was selected between four varieties (Merlot, Cabernet Sauvignon, Pinot-Noir and Tannat). The quantity of antioxidants of D71 was analyzed and compared with other samples of dark chocolate with different levels of cocoa (50%, 70%, 72%, 86% and 99%) and with different types of chocolate (White, Milk and Dark with 40% of cocoa). D71 was the lowest in polyphenols levels, but similar in flavonoids quantity. When compared with different types of chocolate, D71 showed the highest amount of polyphenols and flavonoids and a statistical difference could be observed. The obtained results of D71 and Tannat showed that to ingest the same amount of flavonoids found in 196 ml of Tannat an adult has to eat 49g of D71. This proportion was used to an in vivo assay with Wistar rats for 45 days. Results obtained in blood analysis showed that oxidized LDL (ox-LDL) in rats that ingested red wine was higher than the groups that ingested only chocolate. When synergic effect of these two sources of antioxidants was measured, the ox-LDL showed the highest values, suggesting a competition between these antioxidants. Total cholesterol in liver showed lower levels in groups that ingested red wine that was a consistent result when compared to ox-LDL in blood. This research suggests that antioxidants from D71, in absence of Tannat Red Wine, could contribute to health benefits.

O vinho é a bebida obtida por meio da fermentação alcoólica do mosto simples de uva sã, fresca e madura. Durante o processo fermentativo, realizado por leveduras Saccharomyces cerevisiae, ocorre uma sucessão de microrganismos. Espécies pertencentes aos gêneros Brettanomyces e Dekkera permanecem no produto final podendo influenciar de forma negativa ao produzirem compostos fenólicos voláteis. Estas leveduras apresentam como uma de suas características a lenta taxa de crescimento. Com isto, este trabalho teve como objetivo o desenvolvimento de meio de cultivo para isolamento e detecção destas leveduras e de metodologia molecular para detecção independente de cultivo. O meio de cultivo desenvolvido permitiu o isolamento e também a diferenciação de leveduras dos gêneros Brettanomyces e Dekkera das demais leveduras comumente encontradas em vinho. Uma metodologia molecular, baseada em PCR convencional, foi desenvolvida para a detecção dos gêneros em vinhos. Inicialmente foram construídos dois pares de oligonucleotídeos. Um par universal para leveduras e outro específico para D. bruxellensis. O primeiro par apresentou ampla aplicabilidade na avaliação da efetividade de diferentes processos de extração de DNA e na detecção de compostos inibidores presentes em amostras de vinho. A utilização de ambos os pares permitiu o desenvolvimento de um protocolo de extração e amplificação de DNA diretamente de amostras de vinho, facilitando a identificação de leveduras D. bruxellensis e permitindo a tomada de decisão em tempo hábil de evitar perdas econômicas. / The wine is a beverage obtained by alcoholic fermentation of simple must of healthy, fresh and mature grape. During the fermentation process, carried out by Saccharomyces cerevisiae yeasts, these is a succession of microorganisms. Species belonging to the genera Brettanomyces and Dekkera remain in the final product can influence negatively by producing volatile phenolic compounds. These yeasts present as one the features of the slow rate of growth. This work aimed at the development of culture media for isolation and detection of these strains and molecular methods for detection of independent culture. The medium developed also allowed the isolation and differentiation of yeasts of the genera Brettanomyces and Dekkera yeasts from other commonly found in wine. A molecular approach, based on conventional PCR, was developed for the detection of genera in wines. Initially we constructed two sets of primers. A universal pair for yeast and other specific for D. bruxellensis. The first pair showed a broad applicability in evaluating the effectiveness of various procedures for DNA extraction and detection of inhibitory compounds present in wine samples. The use of both pairs allowed development of a protocol for extracting and amplifying DNA directly from wine samples, facilitating the identification of yeasts D. bruxellensis and allowing the decision-making in a timely manner to avoid economic losses.

Um chocolate amargo com alto teor de cacau (71%) foi desenvolvido e codificado como D71. Previamente, foi realizada a seleção da amostra de liquor de cacau mais rica em polifenóis e flavonóides, dentre três amostras recebidas de fornecedores diferentes. Como comparativo, quatro variedades de vinho tinto foram estudadas (Merlot, Cabernet Sauvignon, Pinot-Noir e Tannat) e o vinho Tannat selecionado. Para caracterizar o produto D71 sua quantidade de polifenóis e flavonóides foi comparada a amostras de chocolate amargo comerciais contendo diferentes percentuais de cacau: 50%, 70%, 72%, 86% e 99%. Em um segundo passo, efetuou-se a comparação do D71 com diferentes tipos de chocolate comerciais: branco (WC), ao leite (MC) e meio amargo (D40). O produto D71 demonstrou menor quantidade de polifenóis em relação às amostras comerciais de chocolate amargo, porém similar quantidade de flavonóides. Quando as amostras de WC, MC e D40 foram comparadas ao D71, este produto mostrou superioridade significativa em relação aos teores de polifenóis e flavonóides. Comparando a quantidade de flavonóides presentes no D71 e no vinho tinto Tannat verificou-se que para obtenção da mesma quantidade de flavonóides de 196 mL deste vinho seria necessário o consumo de 49g do chocolate desenvolvido (D71). Esta relação foi utilizada para o ensaio in vivo com ratos da raça Wistar, realizado por um período de 45 dias. Os resultados obtidos nas análises do sangue demonstraram que as taxas de LDL oxidado (ox-LDL) nos ratos que consumiram vinho tinto puro ou vinho tinto combinado com o chocolate foram superiores às dos ratos que consumiram somente chocolate. Quando o efeito sinérgico das duas fontes de antioxidantes foi avaliado, o ox-LDL mostrou-se ainda mais elevado sugerindo uma interação negativa entre os antioxidantes do chocolate D71 com o vinho tinto Tannat. A análise do colesterol total no fígado mostrou níveis reduzidos nos grupos que ingeriram vinho tinto sendo coerente com os resultados sangüíneos. Os dados obtidos neste trabalho permitem sugerir que estes compostos presentes no D71, quando ingeridos na ausência do vinho tinto (Tannat), apresentam melhor capacidade antioxidante; demonstrando o potencial efeito benéfico dos polifenóis e flavonóides do chocolate amargo (D71) à saúde. / The evaluation of potential benefits to health of dark chocolate in a comparison with red wine was studied. For that, a dark chocolate with a high level of cocoa (71%, labeled as D71) was developed and the quantity of polyphenols and flavonoids of the sample was measured. Previous to the manufacture of chocolate, cocoa liquor was selected based on the amount of antioxidants. Red wine polyphenols and flavonoids were also evaluated and Tannat was selected between four varieties (Merlot, Cabernet Sauvignon, Pinot-Noir and Tannat). The quantity of antioxidants of D71 was analyzed and compared with other samples of dark chocolate with different levels of cocoa (50%, 70%, 72%, 86% and 99%) and with different types of chocolate (White, Milk and Dark with 40% of cocoa). D71 was the lowest in polyphenols levels, but similar in flavonoids quantity. When compared with different types of chocolate, D71 showed the highest amount of polyphenols and flavonoids and a statistical difference could be observed. The obtained results of D71 and Tannat showed that to ingest the same amount of flavonoids found in 196 ml of Tannat an adult has to eat 49g of D71. This proportion was used to an in vivo assay with Wistar rats for 45 days. Results obtained in blood analysis showed that oxidized LDL (ox-LDL) in rats that ingested red wine was higher than the groups that ingested only chocolate. When synergic effect of these two sources of antioxidants was measured, the ox-LDL showed the highest values, suggesting a competition between these antioxidants. Total cholesterol in liver showed lower levels in groups that ingested red wine that was a consistent result when compared to ox-LDL in blood. This research suggests that antioxidants from D71, in absence of Tannat Red Wine, could contribute to health benefits.

O vinho é a bebida obtida por meio da fermentação alcoólica do mosto simples de uva sã, fresca e madura. Durante o processo fermentativo, realizado por leveduras Saccharomyces cerevisiae, ocorre uma sucessão de microrganismos. Espécies pertencentes aos gêneros Brettanomyces e Dekkera permanecem no produto final podendo influenciar de forma negativa ao produzirem compostos fenólicos voláteis. Estas leveduras apresentam como uma de suas características a lenta taxa de crescimento. Com isto, este trabalho teve como objetivo o desenvolvimento de meio de cultivo para isolamento e detecção destas leveduras e de metodologia molecular para detecção independente de cultivo. O meio de cultivo desenvolvido permitiu o isolamento e também a diferenciação de leveduras dos gêneros Brettanomyces e Dekkera das demais leveduras comumente encontradas em vinho. Uma metodologia molecular, baseada em PCR convencional, foi desenvolvida para a detecção dos gêneros em vinhos. Inicialmente foram construídos dois pares de oligonucleotídeos. Um par universal para leveduras e outro específico para D. bruxellensis. O primeiro par apresentou ampla aplicabilidade na avaliação da efetividade de diferentes processos de extração de DNA e na detecção de compostos inibidores presentes em amostras de vinho. A utilização de ambos os pares permitiu o desenvolvimento de um protocolo de extração e amplificação de DNA diretamente de amostras de vinho, facilitando a identificação de leveduras D. bruxellensis e permitindo a tomada de decisão em tempo hábil de evitar perdas econômicas. / The wine is a beverage obtained by alcoholic fermentation of simple must of healthy, fresh and mature grape. During the fermentation process, carried out by Saccharomyces cerevisiae yeasts, these is a succession of microorganisms. Species belonging to the genera Brettanomyces and Dekkera remain in the final product can influence negatively by producing volatile phenolic compounds. These yeasts present as one the features of the slow rate of growth. This work aimed at the development of culture media for isolation and detection of these strains and molecular methods for detection of independent culture. The medium developed also allowed the isolation and differentiation of yeasts of the genera Brettanomyces and Dekkera yeasts from other commonly found in wine. A molecular approach, based on conventional PCR, was developed for the detection of genera in wines. Initially we constructed two sets of primers. A universal pair for yeast and other specific for D. bruxellensis. The first pair showed a broad applicability in evaluating the effectiveness of various procedures for DNA extraction and detection of inhibitory compounds present in wine samples. The use of both pairs allowed development of a protocol for extracting and amplifying DNA directly from wine samples, facilitating the identification of yeasts D. bruxellensis and allowing the decision-making in a timely manner to avoid economic losses.

A levedura Brettanomyces/Dekkera pode causar alterações importantes em vinhos tintos, com a formação de etil-fenóis, compostos de aromas desagradáveis. Este estudo teve como objetivo determinar a presença dessa levedura e de etil-fenóis em vinhos tintos comerciais e durante a vinificação em escala industrial, além de observar sua possível inibição pelo ácido sórbico. Brettanomyces/Dekkera foi quantificada em meio seletivo, e etil-fenóis, por cromatografia gasosa. SO2 livre e total, álcool, extrato seco total, açúcares residuais, acidez total e volátil e pH também foram determinados. O crescimento durante a vinificação foi acompanhado usando diferentes meios seletivos. Dekkera bruxellensis (NRRL Y – 12961) e leveduras isoladas de vinhos brasileiros foram cultivadas em meio sintético e vinho, contendo ácido sórbico entre 0 e 250 mg/L. Das 126 amostras de vinhos comerciais, 26,98% apresentaram Brettanomyces/Dekkera, e 46,03%, etil-fenóis acima do limiar de 426 μg/L, com SO2 e álcool mostrando-se como fatores limitantes. A passagem dos vinhos por barricas e as variedades de uva não influenciaram os níveis de contaminação e de etil-fenóis. Durante a vinificação, Brettanomyces/Dekkera foi detectada a partir do mosto. A baixa população não foi suficiente para formar etil-fenóis durante cinco meses após o esmagamento. Os meios não foram completamente seletivos, especialmente para uvas e mostos. O ácido sórbico inibiu a cepa de Dekkera bruxellensis (NRRL Y – 12961), especialmente para concentrações acima de 150 mg/L, sendo variável o grau de inibição para os isolados. / The yeast Brettanomyces/Dekkera can cause significant spoilage in red wines, with the production of ethylphenols, compounds of unpleasant odors. This study aimed at determining the presence of this yeast and ethylphenols in commercial red wines during vinification in industrial scale and to observe its possible inhibition by sorbic acid. Brettanomyces/Dekkera was quantified on selective medium, while ethyphenols were quantified by gas chromatography. Free and total SO2, alcohol, total dry extract, residual sugar, total and volatile acidity, and pH were also determined. The growth during winemaking was followed using different selective media. Dekkera bruxellensis (NRRL Y – 12961) and Brazilian wines yeasts were grown in synthetic medium and in wine, containing sorbic acid between 0 and 250 mg/L. Brettanomyces/Dekkera was present in 26.98% of the 126 samples of commercial wines. The ethylphenols were above of the 426 μg/L threshold in 46.03% of the samples. SO2 and alcohol were limiting factors. The stage in barrels and the varieties did not affect the levels of contamination and ethylphenols. During winemaking, Brettanomyces/Dekkera was detected from the must. The low population was not enough to produce ethylphenols in five months after crushing. The media were not completely selective, especially for grapes and musts. Sorbic acid inhibited the strains of Dekkera bruxellensis (NRRL Y – 12961), especially at concentrations above 150 mg/L, with variable degree of inhibition for the isolates.

Submitted by Marco Antônio de Ramos Chagas (mchagas@ufv.br) on 2016-07-08T11:44:25Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 4000472 bytes, checksum: 84cbb38e3b22b36a907a1d4863c66385 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-07-08T11:44:25Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 4000472 bytes, checksum: 84cbb38e3b22b36a907a1d4863c66385 (MD5) Previous issue date: 2015-09-22 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / O dióxido de enxofre (SO 2 ) é o aditivo mais frequentemente utilizado para evitar a deterioração de vinhos. No entanto, ele pode causar alterações sensoriais no produto final e apresentar riscos à saúde humana. O ozônio, por sua vez, tem sido proposto em diferentes fases da produção de vinho, porém ainda não diretamente no mosto para o controle de micro-organismos. O objetivo desta pesquisa foi investigar a viabilidade do ozônio como substituto ao SO 2 em algumas etapas da linha de produção de vinhos. Para isso, os trabalhos foram realizados em duas etapas. Na primeira etapa, analisou-se o efeito do ozônio (0 a 7,5 mg.L -1 , durante 10 min) sobre micro-organismos de importância enológica (Saccharomyces cerevisiae, Lactobacillus casei, Leuconostoc mesenteroides, Pediococcus acidilactici e Gluconobacter oxydans), in vitro, em comparação ao tratamento com SO 2 . O ozônio foi mais eficaz que o SO 2 na redução das populações de bactérias lácticas (BAL), permitindo a permanência das leveduras, mesmo na presença dos nutrientes da uva e nas condições de vinificação. O ozônio causou também a redução das bactérias acéticas (BAC), porém, a produção de biofilme pode ter afetado os resultados. Na segunda etapa dos trabalhos foram produzidos vinhos com uvas var. Syrah, pelo processo de microvinificação. O ozônio foi aplicado em diferentes concentrações (2 a 12 mg.L -1 ) e tempos de tratamento (5 a 25 min), nos dias 1o, 6o e 16o da fermentação alcoólica. Foi realizado um tratamento testemunha, empregando-se metabissulfito de potássio, e um controle, sem adição de ozônio ou SO 2 . Leveduras, BAL e BAC foram quantificadas logo após os tratamentos. As análises de antocianinas, parâmetros de cor, concentração de polifenóis totais, atividade antioxidante e compostos voláteis foram realizadas após o fim da fermentação alcoólica. Leveduras, BAL e BAC não foram afetadas pelos tratamentos com ozônio, assim como as antocianinas totais e poliméricas, densidade de cor, cor decorrente das antocianinas poliméricas, características cromáticas, polifenóis totais e atividade antioxidante. Os vinhos produzidos com maiores concentrações de ozônio adquiriram características de vinho envelhecido, apresentando diminuição nas antocianinas monoméricas, aumento no percentual da cor decorrente das antocianinas poliméricas e aumento na tonalidade amarelo/amarronzada, o que pode contribuir para reduzir o tempo necessário de envelhecimento para que o vinho atinja a coloração desejada. Entre os compostos voláteis analisados, o acetaldeído atingiu o limite de detecção sensorial em todos os tratamentos. Em alguns vinhos tratados com ozônio por 15 e 25 min, o metanol estava presente em quantidade acima do permitido pela legislação Brasileira. Estes compostos voláteis são importantes para a qualidade sensorial dos vinhos e tais alterações devem ser levadas em consideração antes de se empregar o ozônio como um substituto do sulfito na produção de vinho. / Sulfur dioxide (SO 2 ) is the additive that is most frequently used to avoid wine spoilage. However, it can cause sensorial alterations in the final product and presents risks to human health. Ozone has been proposed at different stages of wine production. However, it has not yet been used directly in the must to control microorganism growth. Therefore, the purpose of this research was to investigate the viability of ozone as substitute for SO 2 in some stages of wine production. For this, experiments were carried out in two parts. First, the ozone effect (0 to 7.5 mg.L -1 for 10 min) on microorganisms with enological importance (Saccharomyces cerevisiae, Lactobacillus casei, Leuconostoc mesenteroides, Pediococcus acidilactici, and Gluconobacter oxydans) in vitro in comparison with SO 2 treatment was analyzed. Ozone was more effective in reducing the population of lactic bacteria (LAB) compared with the SO 2 treatment, even in the presence of grape nutrients and under winemaking conditions. Ozone also caused a reduction in acetic bacteria (AAB). However, biofilm production may have affected the results. In the second part, wines were produced with Syrah grapes by microvinification. Ozone was applied at different concentrations (2 – 12 mg.L -1 ) and treatment times (5 – 25 min) at days 1, 6 and 16 of fermentation. A standard treatment was performed employing potassium metabisulfite. The control was performed without O 3 or SO 2 . The yeasts, LAB and AAB were quantified after the treatments. The analyses of anthocyanins, color parameters, phenolic content, antioxidant activity and volatile compounds were performed after the end of alcoholic fermentation. The yeasts, LAB and AAB were not affected by the treatments with ozone, nor were the total and polymeric anthocyanins, color density, polymeric color, chromatic characteristics, polyphenol content and antioxidant activity. Wines produced with higher ozone concentrations acquired aging characteristics, presented decreased monomeric anthocyanins, increased percentage of polymeric color and increased yellow/brown shades and tonality. This suggests that the use of ozone as a substitute of sulfite may confer aging characteristics to wine in terms of color and may contribute to reducing the time needed for maturation. Of the analyzed volatile compounds, acetaldehyde reached the sensorial detection limit in all the treatments. In some wines treated with ozone for 15 and 25 min, methanol was present in quantities above those permitted by Brazilian law. These volatile compounds are important for the sensory quality and safety of wines. Such changes should be taken into account before using ozone as a substitute for sulfite in wine production.