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Virus del moteado de la parietaria (PMoV): mecanismos de interacción del virus con la planta y caracterización de aislados viralesMartínez Moncayo, Carolina 04 February 2016 (has links)
En el primer capítulo de esta Tesis se ha realizado un estudio de la variabilidad genética y evolución del virus del moteado de la parietaria (PMoV). El análisis filogenético mostró que los aislados italianos se agrupaban en el clado I aislados españoles se agrupaban en los clados II, III y IV. El aislado griego GrT-1 estudiado formaba parte del clado IV en el árbol filogenético de la CP mientras que en el árbol filogenético de la 2b aparecía como un aislado independiente. La diversidad nucleotídica de los genes que codifican para las proteínas 2b y CP fue baja, aunque más alta que la observada en otros ilarvirus. La distribución de las sustituciones sinónimas (S) y no sinónimas (N) reveló que las proteínas 2b y CP se encontraban bajo presión de selección purificadora, con unas pocas posiciones bajo selección diversificadora. También se detectaron fenómenos de intercambio genético entre algunos aislados españoles, probablemente como resultado de reordenamientos entre los segmentos genómicos de éstos.
Se caracterizó biológica y molecularmente el aislado del PMoV T32. Se observó que T32 era un patotipo y genotipo diferente al aislado español CR8. El análisis de secuencia de los RNAs genómicos del aislado T32 y de las secuencias aminoacídicas de las proteínas mostró diferentes dominios conservados. La CP del aislado T32 tenía 16 aminoácidos menos que la CPs de los otros dos aislados italianos (Pe1 y ST-1) como consecuencia de la delección de un nucleótido (citosina). Finalmente, el análisis de las substituciones N y S indicó que todas las regiones genómicas del aislado T32 estaban sometidas a una presión de selección negativa o purificadora.
Posteriormente se estudió la implicación de la proteína 3a (MP) de PMoV en el movimiento célula-a-célula del virus. Se observó la presencia de dos regiones hidrofílicas no contiguas (R1 y R2) con un alto contenido de aminoácidos básicos lisinas (K) y argininas (R) y una estructura secundaria en α-hélice. Además, se demostró que ambas regiones tenían capacidad de unión al RNA de manera independiente. Mediante un análisis mutacional se observó que la pérdida de los aminoácidos básicos de estas regiones interfería con el movimiento intercelular del virus. Los estudios de localización subcelular mostraron que la MP nativa de PMoV se localizaba en los PDs mientras que las MPs a las que se les había quitado los aminoácidos básicos perdían parcial o totalmente la capacidad de localizarse en los PDs. Los ensayos llevados a cabo con una construcción recombinante que contenía el RNA 3 del virus del mosaico de la alfalfa (Alfalfa mosaic virus, AMV) y a la que se le había reemplazado la MP por la del PMoV mostraron que la acumulación de la MP en los PDs es esencial para el movimiento intercelular del virus.
Finalmente, se estudió la implicación de las proteínas 2b, MP y CP del PMoV en la patogenicidad del virus y el posible mecanismo de inducción de síntomas (factores de potogenicidad o avirulencia). Se observó que la CP de PMoV indujo fuertes síntomas de enanismo, mosaico y enrollado foliar en plantas de Nicotiana benthamiana, mientras que la MP y la 2b de PMoV indujeron únicamente síntomas de enrollado foliar y mosaico. El análisis para determinar si las proteínas CP, 2b y MP de PMoV eran supresores de silenciamiento génico (Viral suppressors of RNA silencing, VSRs), mediante una construcción genética basada en la secuencia genética del virus del arrugado del nabo (TCV) mostraron que ni la CP, MP ni la 2b de PMoV eran capaces de restablecer el movimiento de la construcción de TCV, sugiriendo que ninguna de ellas tenía actividad VSR. / In the first Thesis chapter , we have studied the genetic variation and evolution of parietaria mottle virus (PMoV). Phylogenetic analysis showed that the Italian isolates clustered in the clade I and the Spanish isolates clustered in the clades II, III and IV. The studied isolate GrT-1 from Greece clustered in the clade IV for the CP phylogenetic tree whereas it fell out as an individual isolate for the 2b phylogenetic tree. The nucleotide diversity was low as for other plant viruses, but higher than that for other ilarviruses. The distribution of synonymous (S) and non synonymous (N) substitutions revealed that 2b and CP were under strong purifying selection with some positions under diversifying selection. These results suggest that both genes are under evolutionary constrains probably as a consequence of the essential roles played on the virus life cycle. In addition, we have detected some events of genetic exchange, probably by reassortement of different genomic segments between PMoV Spanish isolates.
A molecular and biological characterization of the PMoV isolate T32 was performed. The results obtained suggested that this PMoV isolate is a different pathotype and genotype respect to the Spanish isolated CR8 and Italian isolate Pe1. Nucleotide sequence analysis of the T32 genomic RNAs and the encoded putative proteins showed different conserved motifs. The CP of isolate T32 showed a nucleotide (cytosine) deletion that resulted in a different start codon rendering a CP which was 16 amino acids shorter than those of the Italian isolates (Pe1 and ST-1). Finally, the analysis of N and S substitutions indicated a negative or purifying selection pressure for all genomic regions.
Later, the role of 3a (MP) protein in the virus cell-to-cell movement was studied. In silico analysis revealed the presence of two hydrophilic non-contiguous regions (R1 and R2) with many basic amino acids: lysines (K) and arginines (R), and a secondary structure in α-helix. Results of Electrophoretic Mobility Shift Assays (EMSA) showed that both R1 and R2 regions were able to bind RNA in an independent manner. Mutational analysis showed that K and R basic amino acids of these regions were essential for virus cell-to-cell movement. The assays carried out to determine the subcellular localization of PMoV MP reveled that the wild-type MP was located in the PDs whereas the MP mutants which the basic amino acids were removed, lost total or partially the ability to accumulate in the PDs. Assays with a recombinant construction containing the RNA 3 of Alfalfa mosaic virus (AMV) whose MP was replaced with those of PMoV showed that MP localization in the PDs was essential for the intercellular virus movement.
Finally, the role played for the CP, MP and 2b proteins of PMoV in the development of infection symptoms (pathogenicity or avirulence factors) was studied. The PMoV CP induced strong symptoms of stunting, mosaic and leaf deformation in Nicotiana benthamiana plants, while PMoV MP and 2b proteins induced only leaf deformation and mosaic symptoms. The analysis to determine if PMoV CP, MP and 2b proteins act as suppressors of RNA silencing (VSRs) through a viral vector based on the Turnip crinkle virus (TCV) showed that neither CP, MP or 2b proteins were able to suppress the genic silencing mechanism. These results showed that suppression of RNA silencing pathway could not be implied on symptoms induction in N. benthamiana plants by CP, MP or 2b proteins of PMoV.
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Caracterització i anàlisi del potencial terapèutic de l’Adenovirus 5/40 quimèric de tropisme específic intestinal com a vector de teràpia gènica per al tractament de la malaltia inflamatòria intestinalRodríguez Aguilar, Ester 16 December 2015 (has links)
La Malaltia Inflamatòria Intestinal (IBD) engloba un grup de malalties (com la CD i la UC) que es caracteritzen per una inflamació crònica del tub digestiu. La IBD requereix un tractament mèdic i farmacològic a mida, i tot i que actualment existeixen diferents teràpies que permeten millorar la qualitat de vida dels pacients, cap d’aquestes aconsegueix eliminar totalment la malaltia.
La teràpia gènica és una de les disciplines de la biomedicina amb més futur pel tractament de malalties d’origen genètic, però també en malalties en que la patologia no està determinada per un sol gen sinó que hi ha una alteració de la homeòstasis del sistema, com en càncer, malalties cardiovasculars o malalties neurològiques. Per tant la teràpia gènica sembla una alternativa prometedora per administrar localment a l’intestí una teràpia per a la IBD. Dintre de la família dels adenovirus, els vectors més utilitzats en teràpia gènica, hi ha el subgrup F (Ad40 i Ad41) amb tropisme intestinal. Aquests adenovirus es caracteritzen per la presència de dos fibers de diferent mida i pel seu pobre creixement in vitro. Mitjançant el pseudotipatge, es pot substituir els gens que codifiquen la proteïna fiber de l’Ad5, un dels vectors més utilitzats en teràpia gènica, per gens que codifiquen per la proteïna fiber curta de l’Ad40. D’aquesta manera, a més de canviar el tropisme natural de l’Ad5 pel tropisme del nou fiber, es millora la seva producció i es facilita la clonació de gens terapèutics. Així doncs, ens vam proposar caracteritzar i analitzar el potencial terapèutic d’adenovirus quimèrics 5/40 de tropisme específic intestinal per a la futura aplicació com vectors de teràpia gènica per a la Malaltia Inflamatòria Intestinal.
En la primera part d’aquest treball ens vam centrar en caracteritzar els vectors quimèrics per tal de determinar les possibilitats reals per convertir-se en vectors de teràpia gènica. En primer lloc es va optimitzar el protocol de producció dels vectors, augmentant l’eficiència de 2-4 a 20 i 25 vegades per cada cicle, i es va estudiar quines noves característiques conferia el fiber curt de l’Ad40 a les partícules de l’Ad5.
En la segona part es va avaluar la capacitat dels vectors quimèrics com a vectors de teràpia gènica a l’intestí. Es va comprovar que la presència del fiber augmentava la resistència a pH àcid dels vectors (tot i que no a proteases) i es va estudiar la biodistribució i bioseguretat d’aquests vectors en ratolins per tres vies diferents: oral, rectal i intravenosa mitjançant la quantificació de l’expressió de β-gal per luminometria i l’anàlisi histològic i immunohistoquímic de la transfecció adenoviral. Els resultats van mostrar que els adenovirus quimèrics administrats per la via rectal eren més eficients que l’Ad5, transfectant cèl·lules epitelials en vellositats i criptes intestinals, cèl·lules enteroendocrines i macròfags locals de la mucosa intestinal. Un cop avaluada la capacitat dels adenovirus quimèrics d’infectar l’intestí de ratolins sans, es va procedir a avaluar si mantenia la seva infectivitat en un model murí de MMI, escollint el model de colitis induïda per DSS.
En la tercera part d’aquest treball es van generar nous vectors quimèrics que permetessin la clonació fàcil i ràpida de qualsevol gen terapèutic.
En resum, en aquest treball demostrem que amb el pseudotipatge del fiber curt de l’Ad40 es transfereixen moltes de les característiques singulars dels Adenovirus entèrics, i es proposa un protocol optimitzat per a la seva producció a nivells equivalents als de l’Ad5. Els nostres resultats també suggereixen que l’adenovirus quimèric F/40S es un excel·lent candidat com a vector estratègia de teràpia gènica per a l’administració de gens terapèutics a l’intestí de manera local. / Inflammatory Bowel Disease (IBD) comprises a group of diseases (such as CD and UC) characterized by a chronic inflammation of the digestive tract. The IBD requires a personalized medical and pharmacological approach, and although currently there are different therapies to improve the quality of life of patients, none of these has healed the disease.
Gene therapy is one of the most promising biomedical disciplines for the treatment of genetic diseases, but also for other diseases in which the pathology is not determined by a single gene, but there is an alteration of the homeostasis of the system, such as cancer, cardiovascular disease and neurological diseases. Therefore, gene therapy seems a promising alternative to administer local therapy in the intestine for IBD. Within the family of adenovirus vectors, the most used vectors in gene therapy, there is subgroup F adenovirus (Ad40 and Ad41) with intestinal tropism. These adenoviruses are characterized by the presence of two different size fibers and its poor growth in vitro. By pseudotyping technique, you can replace the genes encoding the Ad5 fiber protein, one of the most used adenoviral vector, for the genes encoding the protein of Ad40 short fiber. Thus, besides changing the natural tropism of Ad5 tropism by the new fiber, it improves production and simplify the cloning of therapeutic genes. Therefore, we decided to analyse and characterize the therapeutic potential of chimeric adenovirus 5/40 specific intestinal tropism for future use as gene therapy vectors for Inflammatory Bowel Disease.
In the first part of this work, we focused on characterizing the chimeric vector to determine the real possibilities to become gene therapy vectors. Firstly, we optimize the protocol for the vectors production, increasing the efficiency from 2-4 times to 20 and 25 times per cycle, and we studied what new features the Ad40 short fiber transferred to Ad5 particles.
In the second part, we evaluate the ability of chimeric vectors as gene therapy vectors in the intestine. We found that the presence of fiber increased vectors resistance to acidic pH (but not to proteases) and we studied the biodistribution and biosafety of these vectors in mice by three different routes: oral, rectal and intravenous by quantifying the expression of β-gal luminometry and by histology and immunohistochemistry analysis of adenoviral transfection. The results showed that the chimeric adenovirus administered by rectal route were more efficient than Ad5, transfecting intestinal epithelial cells in villi and crypts, and enteroendocrine cells and local macrophages in intestinal mucosa. After evaluating the ability of chimeric adenovirus to infect the intestines of healthy mice, we proceeded to assess their infectivity capacity in a MMI animal model of MMI, choosing the model of DSS-induced colitis mice.
In the third part of this work, we generate new chimeric vectors that allow easy and fast cloning of any therapeutic gene.
In summary, this work shows that the short fiber of the Ad40 pseudotipying transferred many of the unique characteristics of enteric adenovirus, and it proposes an optimized protocol for production levels equivalent to the Ad5. Our results also suggest that the chimeric adenovirus F/40S is an excellent candidate as a gene therapy vector for for the local administration of therapeutic genes in the gut
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Torque teno sus viruses: pathogenesis in co-infection with Porcine circovirus type 2 and humoral immune responses during natural infection of pigsNieto Blanco, David 13 November 2015 (has links)
Los Torque teno sus viruses pertenecen a la familia Anelloviridae, e infectan tanto a cerdos como a jabalíes. En la actualidad, los TTSuVs se dividen en dos géneros, Iotatorquevirus para los TTSuV1, que incluye las especies: TTSuV1a y TTSuV1b; y Kappatorquevirus para los TTSuV2, que incluye las especies: TTSuVk2a y TTSuVk2b. Ambos géneros se caracterizan por tener una organización similar del genoma y por una gran variabilidad genética.
Las consecuencias de la infección de los TTSuVs sobre su hospedador no son del todo claras. Ambos géneros se detectan con una prevalencia muy alta, tanto en poblaciones de cerdos sanos como enfermos. El virus se transmite principalmente tanto por vía horizontal como vertical; sin embargo, la ruta parenteral también sería posible, ya que se ha detectado la presencia de TTSuVs contaminando productos vacunales veterinarios.
Tras la infección, los TTSuVs se distribuyen por la mayoría de los tejidos y órganos del cerdo. Aunque en la actualidad el papel patogénico de los TTSuVs aún no está claro, se cree que estos virus pueden agravar el curso de la enfermedad en asociación con otros patógenos comunes de los cerdos domésticos. Entre los virus concomitantes con los que se asocian destaca el Circovirus porcino tipo 2 (PCV2), responsable de la circovirosis porcina (CP), una enfermedad con consecuencias devastadoras en la población porcina. La relación existente entre los TTSuV y el PCV2 se basa en la mayor prevalencia de los TTSuVs en cerdos afectados por CP comparada con la de cerdos sanos. Sin embargo, la alta prevalencia de los TTSuVs en la población porcina y su alta variabilidad genética, combinados con una alta prevalencia de otros virus que también infectan a los cerdos, constituyen varios obstáculos en la comprensión del papel patogénico asociado a la infección por los TTSuVs. Al mismo tiempo, la falta de herramientas de diagnóstico eficaces ha sido una barrera en el progreso del conocimiento de los TTSuVs. El diagnóstico de la infección de los TTSuV se ha basado principalmente en la detección mediante la técnica de la PCR.
El objetivo de los estudios realizados en esta Tesis fue el de contribuir a la comprensión del papel que desempeñan los TTSuVs en la infección del cerdo. Para poder llevarlo a cabo fue necesario desarrollar técnicas de diagnóstico eficaces para estudiar la epidemiología de TTSuVs.
En el primer estudio se investigó la dinámica de la infección y la carga viral en suero de los TTSuV1 y TTSuV2. Se seleccionaron sueros de cerdos afectados de CP y, se compararon los valores de carga viral y prevalencia en sueros de cerdos sanos criados en condiciones equivalentes.
Para poder llevar a cabo el estudio, previamente se puso a punto una técnica de PCR cuantitativa a tiempo real (qPCR). Se observó que la prevalencia de los TTSuVs era alta en los dos grupos de cerdos estudiados y para los dos virus. En el caso del TTSuV2, la carga viral fue significativamente mayor en los cerdos afectados por la CP. Tal diferencia no se observó en el caso del TTSuV1. También cabe destacar que los cerdos infectados por el TTSuV2 a edades más tempranas (semanas 1 y 3 de vida) fueron más propensos a desarrollar la CP. Por el contrario, dicha correlación no se observó para TTSuV1. En conjunto, los resultados obtenidos refuerzan la hipótesis de la asociación entre la infección por los TTSuVs y el desarrollo de la CP.
En el segundo estudio se investigaron las cargas virales tanto del TTSuV1 como del TTSuV2 en tejidos de 20 cerdos (divididos en dos grupos: 10 sanos y 10 afectados por CP). De cada cerdo se investigaron un total de 7 tejidos, incluyendo pulmón, riñón, hígado, íleon, médula ósea, y los nódulos linfáticos mesentéricos y mediastínicos. La determinación de las cargas de TTSuV1 y TTSuV2 en tejidos se llevó a cabo usando la qPCR descrita anteriormente. Las cargas del TTSuV2 fueron significativamente mayores en los tejidos procedentes de cerdos afectados por la CP que en sus homólogos sanos y que las cargas virales del TTSuV1 para ambos grupos de cerdos. Las mayores cargas del TTSuV2 se observaron en la médula ósea, los nódulos linfáticos mediastínicos y en el hígado. Las mayores cargas del TTSuV1 se detectaron en la médula ósea, pulmón e hígado. Independientemente del estado de salud, la médula ósea fue el tejido donde se observaron las cargas virales más altas. En este estudio se concluyó que las cargas de TTSuV2 fueron significativamente mayores que las cargas de TTSuV1 en los tejidos analizados. Además, las cargas de TTSuV2 en tejidos de cerdos afectados por la CP fueron significativamente mayor que las cargas de TTSuV2 en los mismos tejidos procedentes de cerdos sanos. Por último, los TTSuVs se hallaron en un gran número de tejidos diferentes, e incluso es muy probable que otros tejidos que no se incluyeron en este estudio también pudieran estar infectados por TTSuVs.
En el tercer estudio se desarrolló una técnica serológica de ELISA basada en la detección de la proteína recombinante ORF1-A de los TTSuVs. Al mismo tiempo, la carga de los TTSuVs en suero se cuantificó usando la qPCR desarrollada previamente. El ensayo ELISA se usó para estudiar el desarrollo de la respuesta inmune humoral frente a TTSuV1 y TTSuV2. Para ello, se realizó un estudio longitudinal en cerdos clínicamente sanos y en sus madres. Se detectaron IgGs anti ORF1-A en las muestras de suero, tanto frente al TTSuV1 como al TTSuV2. En el caso de TTSuV1, se observó una gran prevalencia de cerdos seropositivos en la semana 4 de vida; por el contrario, para el TTSuV2, el porcentaje de cerdos seropositivos en esa semana fue muy bajo. Se concluyó que los cerdos son capaces de desarrollar una respuesta inmune frente a la infección por los TTSuVs; sin embargo, la alta prevalencia de cerdos virémicos en presencia de IgGs anti ORF1-A sugiere que los anticuerpos no son capaces de eliminar los TTSuVs de la sangre. / Torque teno sus viruses (TTSuVs) belong to the family Anelloviridae and they infect swine and wild boar. Currently, TTSuVs infecting swine are divided into two separated genera, Iotatorquevirus for TTSuV1, including species: TTSuV1a and TTSuV1b, and Kappatorquevirus for TTSuV2, including species TTSuVk2a and TTSuVk2b. Both genera are characterized by similar genomic organization and high genomic variability.
The impact of TTSuVs infection for the host is under discussion, since TTSuVs have been detected in high prevalence in healthy and diseased swine populations. Main described transmission routes are horizontal and vertical; nevertheless, the parenteral route is also possible due to the presence of TTSuVs contaminating veterinary vaccine products.
In the infected host, TTSuVs are able to infect a variety of tissues and organs. However, the pathogenic role of TTSuVs is not yet clear. It is assumed they can be associated with other well-known swine pathogens, potentially worsening the prognosis of the disease. One of the most studied and harmful viruses in pig production is Porcine circovirus type 2 (PCV2), which is the essential cause of PCV2-systemic disease (PCV2-SD), a devastating disease for the swine industry. In fact, TTSuVs were linked to PCV2-SD triggering, based on the higher prevalence of TTSuVs observed in pigs suffering from PCV2-SD when compared with healthy counterparts. However, the high prevalence of TTSuVs in the swine population, the high genetic variability of TTSuVs, combined with high prevalence of other swine infecting viral pathogens constitute a hindrance in the understanding of the pathogenic role associated to TTSuVs infection. At the same time, the lack of effective diagnostic tools has been a barrier in the understanding of TTSuVs role or biology, as diagnosis of TTSuVs infection has been mainly based on polymerase chain reaction (PCR) detection.
The studies carried out in this Thesis aimed to contribute to the understanding of the role played by TTSuVs in the pig. To go further into the study of TTSuVs, it was necessary to develop effective tools to study the epidemiology of TTSuVs.
In the first study, the dynamics of TTSuV1 and TTSuV2 loads was studied. For this, serum TTSuV loads of pigs affected by PCV2-SD were compared with appropriate healthy control animals. Such study was carried out by means of a newly developed real-time quantitative PCR (qPCR) method. Results from this study showed that TTSuVs prevalence was high in all studied pigs. TTSuV2 viral load was significantly higher in PCV2-SD affected pigs. Such difference was not observed for TTSuV1. Importantly, it was observed that early TTSuV2 infected pigs were more prone to develop PCV2-SD; on the contrary, such correlation was not observed for TTSuV1. Altogether, obtained data reinforced the hypothesis of the association between TTSuVs infection and PCV2-SD development.
In the second study, TTSuV1 and TTSuV2 loads were investigated in tissues of 20 pigs (10 healthy and 10 PCV2-SD affected pigs). For each pig a total of 7 different tissues were analysed, including lung, kidney, liver, ileum, bone marrow, and mesenteric and mediastinal lymph nodes. TTSuV1 and TTSuV2 tissue loads were quantified by the previously developed qPCR. TTSuV2 load was significantly higher in tissues of PCV2-SD affected pigs when compared with healthy counterparts and with TTSuV1 load. For TTSuV2, the highest viral load was observed in bone marrow, mediastinal lymph node and liver, while it was bone marrow, lung and liver for TTSuV1. Regardless of the health status, bone marrow contained the highest viral load. It was observed that TTSuV2 loads in tissues were significantly higher than TTSuV1 tissue loads. Moreover, TTSuV2 tissue load in PCV2-SD affected pigs was significantly higher than TTSuV2 load in tissues of healthy pigs. Finally, TTSuVs had a wide range of tissue distribution, so, it is very likely that other tissues not included in this study would also be infected by TTSuVs.
In the third study, Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay (ELISA) assays to detect antibodies against TTSuVs were developed based on the open reading frame (ORF) 1-A recombinant protein of both viruses. Concomitantly, the viral loads in the same examined sera were quantified using the developed qPCR. The ELISA assay was used to study the development of the humoral immune response against TTSuV1 and TTSuV2 in longitudinally sampled clinically healthy pigs and their dams. Anti-ORF1-A IgGs were found in serum of pigs and sows for both TTSuVs. In case of TTSuV1, a high percentage of seropositive pigs were detected at 4 weeks of age; on the contrary, for TTSuV2, percentage of seropositive pigs at the same age was very low. It was concluded that, pigs are able to mount a humoral immune response against TTSuVs. However, based on the high prevalence of viremic pigs in the presence of anti ORF1-A IgGs, it was suggested that these antibodies are not able to remove TTSuVs from blood circulation.
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Epidemiologia de la influença porcina: Estudis seroepidemiològics i dinàmica de la infecció en explotacions porcinesSimon Grifé, Meritxell 23 November 2012 (has links)
Des de l’any 1931, s’han aïllat diferents tipus de virus influença en l’espècie porcina i en l’actualitat es considera que certs subtipus circulen de forma endèmica entre la població porcina mundial.
Degut a que els porcs poden infectar-se tant per virus influença d’origen aviar com d’origen humà, l’espècie porcina es considera la font de generació de nous virus influença recombinants, que podrien incloure gens de virus de diferents orígens. Per aquest motiu, més enllà de les conseqüències productives que comporta la malaltia pel sector porcí, la grip porcina prèn importància degut a les implicacions que pot tenir per la salut pública.
En el primer estudi d’aquesta tesi es va examinar la seroprevalença enfront els virus influença en el porcí d’Espanya i els factors de risc associats. Es van recollir informació i mostres de sèrum (2.151 animals) de 98 explotacions distribuïdes arreu del país. Els resultats obtinguts mitjançant la tècnica d’ inhibició de la hemaglutinació (IH), utilitzant els subtipus H1N1, H1N2 i H3N2 com antígens, van mostrar que el 75.4% dels animals presentaven anticossos enfront algun dels subtipus. A totes les granges estudiades es va detectar com a mínim un animal seropositiu enfront algun dels subtipus, però només el 9% van reportar simptomatologia compatible amb grip durant l’últim any. Per últim, tres factors de risc van resultar associats a la infecció: el percentatge de reposició, les separacions discontínues entre corrals i un accés no controlat a l’explotació. Els resultats obtinguts en aquest estudi mostren una àmplia disseminació dels virus influença en la població porcina d’Espanya. Així mateix, ressalten la importància de les mesures de bioseguretat així com del disseny de les instal·lacions a l’hora de minimitzar la prevalença dels virus influença en les explotacions porcines.
En el segon estudi es van seguir serològicament i virològicament dos lots de producció de dues granges comercials, per tal d’explorar la dinàmica de la
infecció dels virus influença en el porc. En una de les explotacions es van detectar quatre onades víriques, la primera es va observar a les 3 i 4 setmanes de vida dels garrins en presència d’anticossos maternals. L’anàlisi filogenètic va mostrar que havien cocirculat endèmicament dues variants del virus H1N1. A més, en dos animals, es va aïllar la mateixa soca viral en dos moments diferents separats entre sí per com a mínim 4 setmanes. En l’altre explotació en canvi, només es va aïllar una soca del subtipus H1N2 que es va detectar en una única onada vírica en la que el 93.7% dels animals van resultar RRT-PCR positius. Els resultats obtinguts més rellevants d’aquest estudi són: a) la infecció per virus influença en les granges porcines comercials pot donar-se tant de forma epidèmica com de forma endèmica. b) els virus influença poden infectar els garrins amb anticossos maternals. c) la protecció homòloga generada després d’una primera infecció podria no prevenir enfront una segona infecció amb la mateixa soca o una molt similar. d) diferents variants de virus influença poden circular conjuntament entre els animals d’una explotació durant llargs períodes de temps.
En el tercer estudi s’explorava si el virus pandèmic H1N1 (pH1N1) continuava circulant, entre 22-26 mesos després de la infecció original, en 3 explotacions porcines d’Austràlia on s’havia detectat el virus l’any 2009. També es valorava el potencial de disseminació del virus a altres explotacions a través del moviment de persones i animals. Per portar-lo a terme, es van analitzar els sèrums de 55 animals de cada granja mitjançant l’IH per detectar anticossos específics enfront el virus pH1N1. Els resultats obtinguts mostren que almenys en una de les explotacions el virus pH1N1 havia circulat recentment. / Since 1931, different types of swine influenza virus (SIV) have been isolated in swine and nowadays it is assumed that certain subtypes are endemically circulating among pigs population worldwide.
Pigs can be infected by both avian and human influenza virus, and as a consequence, swine is considered the source of generation for new reassortant influenza virus, which virus could combine genes from different origins. For this reason, beyond the consequences that involved the disease for pig sector, swine influenza is taking special importance because of the implications it could have on public health.
In the first study of this thesis seroprevalence and risk factors of SIV in swine population from Spain were examined. Data and serum samples (2,151 animals) were collected from 98 herds located throughout the Spanish territory. The results obtained by hemagglutination inhibition (HI), using H1N1, H1N2 and H3N2 SIV subtypes as antigens, showed that 75.4% of the animals had antibodies against at least one of the subtypes examined. All farms studied had at least one seropositive animal against one of the HI tests. However, only 9% reported clinical signs compatible with swine influenza during the previous year. Finally, three risk factors were associated with the infection: increasement of replacement rates, existence of open partitions between pens and uncontrolled entrance to the farm. The results obtained in this study indicate a widespread exposure to SIV in swine population from Spain. Furthermore, these results highlight the importance of biosecurity measures and facilities design in order to minimize the SIV prevalence is pig farms.
In the second study serological and virological follow-ups were conducted in two whole batches of pigs from two commercial pig farms in order to assess the dynamics of SIV infection in pigs. In one farm, four viral waves were observed; the first one took place in the presence of colostral-derived antibodies when the piglets had 3-4 weeks of age. Phylogenetic analysis showed that two H1N1 variants circulated in that farm. Moreover, in two pigs, the same strain was isolated in two non-consecutive sampling points separated
at least 4 weeks. In contrast in the other farm, only one strain of H1N2 subtype was detected in one viral wave in which 93.7% of the animals were RRT-PCR positive. The most relevant results of this study are: a) the SIV infection in pigs from commercial herds can occur both in epidemics and endemics form. b) SIV infection can occur in piglets in presence of colostral-derived antibodies. c) homologous protection after infection with one strain could not prevent a infection with the same strain or closely related one. d) several SIV may co circulate for extended periods of time.
In the third study, freedom for pandemic H1N1 (pH1N1) virus, 22-26 months following the original infection, in three piggeries from Australia where the pH1N1 were detected in 2009 was assessed. In addition, the potential spread of the virus to other piggeries through people and animal movement was investigated. To accomplish this aim, serum samples from 55 pigs from each piggery were analyzed by HI to detect specific antibodies against pH1N1 virus. The results obtained show that at least in one piggery pH1N1 had recently circulated among pigs.
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Estudo epidemiológico e genético dos vírus da imunodeficiência felina identificados no Estado de São Paulo /Lara, Valéria Maria. January 2004 (has links)
Orientador : João Pessoa Araújo Júnior / Resumo: O presente trabalho objetivou determinar a freqüência do vírus da imunodeficiência felina, correlacioná-la a dados epidemiológicos, identificar os diferentes sorotipos das amostras positivas e realizar a análise filogenética das mesmas. Para tanto, foram colhidas 519 amostras de sangue total de gatos domésticos oriundos de diferentes cidades do estado de São Paulo submetidas à técnica de PCR-nested para identificação do vírus. Dessas amostras, 81 (15,6%) apresentaram-se positivas ao teste, das quais 45 (55,5%) pertenciam a gatos com sinais clínicos de alguma enfermidade, sendo 21 fêmeas e 24 machos. Vinte e duas amostras (27,2%) foram provenientes de animais aparentemente normais, com duas fêmeas e 20 machos, e outras 14 (17,3%) a gatos sem histórico clínico definido, com três fêmeas e 11 machos. Foram submetidas ao seqüenciamento genético 50 (61,7%) amostras positivas. Entretanto, em somente 32 destas (64%) realizou-se a inferência filogenética. A análise genética foi baseada em um segmento do gene gag de 459 pb. As relações genealógicas foram realizadas através dos métodos da máxima parcimônia, da evolução mínima e de agrupamento de vizinhos. Os resultados obtidos revelaram uma ampla similaridade entre as três árvores construídas e em todas elas, as 32 amostras estudadas foram agrupadas dentro do mesmo sorotipo, que foi o sorotipo B. / Abstract: The present work aimed to determine the feline immunodeficiency virus frequency, to correlate it to epidemiologic data, to identify different FIV subtypes of positive samples and also to accomplish its phylogenetic analysis. For that, it was collected 519 blood samples of domestic cats from different cities of the São Paulo state, submitting them by PCR-nested for virus identification. Eighty one samples (15.6%) were positive to the test, which 45 (55.5%) of them were from animals with clinical signs of some illness. Those samples, 21 were from female and 24 from male cats. Twenty-two of the positive samples (27.2%) were from healthy cats (2 females and 20 males), and 14 of them (17.3%) from cats without clinical history (3 females and 11 males). Fifty positive samples (61.7%) were submitted to DNA sequencing, but only in 32 of them the phylogenetic inference was done. The genetic analysis was based on a segment of the gag gene with 459pb. The genealogical relationships were established through maximum parcimony, minimum evolution and neighbor-joining methods. The results revealed a wide similarity among the three built trees and, in all of them, the 32 studied samples were allocated inside of the same subtype, that was the subtype B. / Doutor
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Study of Cucumber mosaic virus infection in the resistant melon accession PI 161375Guiu Aragonés, Cèlia 01 October 2014 (has links)
L’accessió exòtica de meló PI 161375 presenta una barreja de resistència qualitativa i quantitativa front a la infecció per CMV depenent de la soca. Anteriorment s’ha descrit la presencia del gen recessiu de resistència cmv1 situat en el grup de lligament XII, i que conferia resistència total només a algunes soques de CMV (Essafi et al., 2009). En aquesta tesi hem ampliat els coneixements sobre la resistència determinada pel gen cmv1 present en meló i hem obtingut la seqüència i els clons infectius de la soca M6. Aquesta tesi ha estat estructurada en tres capítols.
En el primer capítol vam analitzar la resistència conferida pel gen cmv1 en 11 soques de CMV del subgrup I i II. Els resultats van indicar que cmv1 conferia resistència total a les soques del subgrup II però no a les del subgrup I. Mitjançant l’ús dels clons infectius de les soques CMV-LS (subgrup II) i CMV-FNY (subgrup I) vam fer combinacions entre els RNAs d’ambdues soques podent localitzar el determinant de virulència en el RNA3. Virus quimèrics entre FNY i LS van indicar-nos que el determinant de virulència estava en els 209 aminoàcids de l’extrem N-terminal de la proteïna de moviment. Mitjançant mutagènesi dirigida vàrem identificar una combinació de 4 posicions específiques que confereixen a LS l’habilitat de sobrepassar la resistència conferida pel gen cmv1 quan els substituïm pels residus corresponents de la soca FNY.
El segon capítol tracta de la caracterització de la resistència conferida pel gen cmv1. La soca CMV-LS és capaç de replicar-se i de moure’s cèl·lula a cèl·lula en la fulla inoculada de la línia resistent. No obstant, LS és incapaç d’envair el floema ja que no hem pogut detectar virus en el floema de la línia resistent. Mitjançant immunomarcatge de CMV amb or col·loïdal hem identificat el límit entre cèl·lules de la beina (BS) i parènquima vascular (VP) o cèl·lules acompanyants (IC) com a barrera que impedeix la infecció sistèmica en la línia portadora del gen cmv1. Amb els resultats obtinguts hem demostrat que la resistència determinada pel gen cmv1 interromp l’entrada del virus al sistema vascular, impedint així una infecció sistèmica.
En el tercer capítol vam obtenir la seqüència de la soca CMV-M6 i vam generar clons moleculars capaços d’infectar sistèmicament N. benthamiana i meló. / La accesión exótica de melón PI 161375 presenta una mezcla de resistencia cualitativa y cuantitativa frente a la infección por CMV, dependiendo de la cepa. Anteriormente se describió en nuestro laboratorio la presencia del gen recesivo de resistencia cmv1 situado en el grupo de ligamiento XII, y que confería resistencia total sólo a algunas cepas de CMV (Essafi et al., 2009). En esta tesis hemos ampliado los conocimientos sobre la resistencia mediada por el gen cmv1 presente en melón y hemos obtenido la secuencia y los clones infectivos de la cepa M6. La tesis ha sido estructurada en tres capítulos.
En el primer capítulo analizamos la resistencia conferida por el gen cmv1 en 11 cepas de CMV del subgrupo I y II. Los resultados indicaron que cmv1 confería resistencia total a las cepas del subgrupo II pero no a las del subgrupo I. Mediante el uso de los clones infecciosos de las cepas CMV-LS (subgrupo II) y CMV-FNY (subgrupo I) hicimos combinaciones entre los RNAs de ambas cepas, pudiendo localizar el determinante de virulencia en el RNA3. Quimeras entre FNY y LS indicaron que el determinante de virulencia estaba en los 209 aminoácidos del extremo N-terminal de la proteína de movimiento (MP). Mediante mutagénesis dirigida identificamos una combinación de 4 posiciones específicas que confieren a LS la habilidad de sobrepasar la resistencia mediada por cmv1 cuando las sustituimos por los residuos correspondientes de la cepa FNY.
El segundo capítulo trata de la caracterización de la resistencia conferida por el gen cmv1. La cepa CMV-LS es capaz de replicarse y moverse célula a célula en la hoja inoculada de la línea resistente. No obstante, LS es incapaz de invadir el floema ya que no hemos podido detectar virus en el floema de la línea resistente. Mediante inmunomarcaje de CMV con oro coloidal hemos identificado el límite entre células de la vaina (BS) y parénquima vascular (VP) o células acompañantes (IC) como barrera que impide la infección sistémica en la línea portadora del gen cmv1. Con los resultados obtenidos hemos demostrado que la resistencia determinada por el gen cmv1 interrumpe la entrada del virus al sistema vascular, impidiendo así una infección sistémica.
En el tercer capítulo hemos obtenido la secuencia de la cepa CMV-M6 y generado clones moleculares capaces de infectar sistémicamente N. benthamiana y melón. / The exotic melon accession PI 161375 shows a complex mixture of qualitative and quantitative resistance to Cucumber mosaic virus (CMV) infection, depending on the strain. Previously, the presence of a recessive gene (cmv1) in the linkage group XII conferring total resistance to a set of CMV strains was reported in our laboratory (Essafi et al., 2009). In this thesis we have extended the knowledge about the cmv1-mediated resistance present in melon and have obtained the sequence of the strain CMV-M6 and its infectious clones. This thesis is divided in three chapters.
In the first chapter, we have analysed the cmv1-mediated resistance in 11 strains of CMV from subgroup I and II and have established that cmv1 confers total resistance only to strains of subgroup II. Using infectious clones of strains CMV-LS (subgroup II) and CMV-FNY (subgroup I) we have made combinations between RNAs of both strains showing that the determinant of the virulence is located in RNA3. Chimaeras between CMV-FNY and CMV-LS showed that the determinant of virulence is in the N-terminal 209 amino acids of the movement protein (MP). By directed mutagenesis, we identified a combination of four specific positions that confer to LS the ability to overcome cmv1-mediated resistance when exchanged for the corresponding FNY residues.
In the second chapter, we have characterized the resistance mediated by cmv1. The strain CMV-LS is able to replicate and move cell to cell in the inoculated leaf of the resistant line. However, it is not able to invade the sieve elements since it has not been detected in the phloem of the resistant line. By immunogold labelling of CMV particles we have identified that the boundary between bundle sheath cells (BS) and vascular parenchyma (VP) or intermediary cells (IC) impedes the systemic infection in the resistant line. Altogether, our results demonstrate that the resistance determined by cmv1 involves interruption of the virus entry into the vascular system and therefore, inability to develop a systemic infection.
In the third chapter, we have obtained the sequence of CMV-M6 strain and generated infectious clones able to infect systemically N. benthamiana and melon.
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La eliminación del gen CD2v del aislado virulento BA71 del visrus de la perste porcina africana provoca su atenuación in vivo, permitiendo disponer de una vacuna experimental con capacidad protectora frente a virus homólogo y heterólogosLópez Monteagudo, Paula 09 September 2015 (has links)
La
peste
porcina
africana
(PPA)
es
una
enfermedad
hemorrágica
altamente
infecciosa
de
declaración
obligatoria
a
la
Organización
Mundial
de
la
Salud
Animal
(OIE)
y
que
provoca
grandes
pérdidas
económicas
en
los
países
afectados.
El
agente
causal
de
la
enfermedad
es
el
virus
de
la
peste
porcina
africana
(VPPA),
un
virus
para
el
que
todavía
hoy
no
existe
vacuna.
El
VPPA
permanece
endémico
desde
su
origen
en
el
África
subsahariana,
mantenido
en
un
ciclo
silvestre
entre
los
cerdos
salvajes
y
las
garrapatas,
infectando
ocasionalmente
a
cerdos
domésticos,
altamente
susceptibles
a
la
enfermedad.
Desde
que
en
el
año
2007
el
virus
volviera
a
entrar
en
la
Europa
continental,
no
ha
parado
de
expandirse
desde
Georgia
por
todo
el
Cáucaso
y
Rusia,
alcanzando
en
2014
a
varios
países
de
la
Unión
Europea.
El
principal
objetivo
de
esta
Tesis
fue
desarrollar
una
nueva
vacuna
frente
a
la
PPA
basada
en
la
manipulación
genética
del
virus.
Estos
fueron
los
principales
logros
conseguidos:
i)
la
deleción
del
gen
de
la
hemaglutinina
o
CD2
viral
del
genoma
de
la
cepa
virulenta
BA71,
atenúa
dramáticamente
su
patogenia
in
vivo.;
ii)
El
virus
delecionado
de
CD2v,
BA71.ΔCD2,
es
capaz
de
conferir
protección
frente
a
la
infección
letal
con
el
virus
homólogo
virulento
BA71,
así
como
frente
al
virus
heterólogo
virulento
E75,
de
una
manera
dosis
dependiente;
iii)
La
dosis
más
elevada
ensayada
de
BA71.ΔCD2:
106
UFP,
protegió
totalmente
a
los
animales
frente
a
la
infección
letal
con
uno
u
otro
aislado
de
VPPA;
iv)
La
protección
cruzada
observada
tras
inmunizar
con
BA71.ΔCD2
correlaciona
con
la
capacidad
que
este
virus
tiene
de
inducir
células
T-‐CD8+
que
in
vitro
reconocen
tanto
a
BA71
como
a
E75,
mientras
que
los
virus
atenuados
hasta
ahora
probados
sólo
protegían
y
reconocían
únicamente
a
virus
homólogos;
iv)
La
inoculación
de
106
UFP
de
BA71.ΔCD2
fue
capaz
de
proteger
al
100%
de
los
cerdos
vacunados
frente
a
la
infección
con
una
dosis
letal
del
virus
heterólogo
Georgia07,
actualmente
circulando
por
Europa.
Los
resultados
obtenidos
durante
esta
Tesis
avalan
la
idea
de
que
obtener
una
vacuna
frente
a
PPA
es
posible,
si
bien
es
esencial
aumentar
su
seguridad
y
dotarla
de
la
capacidad
de
inducir
una
respuesta
inmunológica
que
permita
diferenciar
a
los
animales
vacunados
de
los
infectados;
clave
sobre
todo
pensando
en
su
utilización
en
zonas
libres
de
la
enfermedad. / African
swine
fever
(ASF)
is
a
highly
infectious
hemorrhagic
disease
of
compulsory
declaration
to
the
World
Animal
Health
(OIE)
and
causes
important
economical
losses
in
affected
countries.
The
causative
agent
of
the
disease
is
African
swine
fever
virus
(ASFV),
a
large
and
complex
virus
against
which
there
is
no
effective
vaccine
available
and
therefore,
its
control
and
eradication
relies
on
the
rapid
diagnostic
of
the
disease
and
culling
of
infected
and/or
exposed
animals
to
the
virus.
ASF
remains
endemic
in
sub-‐Saharan
Africa
where
the
virus
is
in
a
sylvatic
cycle
between
wild
pigs
and
ticks,
occasionally
infecting
highly
susceptible
domestic
pigs.
The
virus
re-‐entered
Continental
Europe
in
2007
and
since
then,
the
virus
has
circulated
from
Georgia
to
the
rest
of
the
Caucasian
Regions,
Russia
and
more
recently
has
entered
the
European
Union
borders.
The
main
objective
of
this
Thesis
was
developing
a
new
vaccine
strategy
against
ASF,
based
on
the
genetic
manipulation
of
the
ASFV
genome.
The
main
findings
obtained
can
be
summarized
as
follows:
i)
the
deletion
of
the
hemagglutinin
gene
or
viral
CD2,
strongly
attenuated
the
ASFV-‐BA71
virulent
strain
in
vivo;
ii)
BA71.ΔCD2,
a
live
attenuated
virus
defective
for
CD2v,
is
able
to
confer
in
vivo
protection
in
a
dose-‐dependent
manner
against
the
lethal
challenge
with
either
the
homologous
BA71
virus
or
the
heterologous
E75
virus;
iii)
Inoculation
with
the
higher
dose
tested
of
BA71.ΔCD2,
106
PFU,
conferred
complete
protection
against
BA71
and
E75;
iv)
the
cross-‐protection
induced
by
BA71.ΔCD2
correlated
with
its
ability
to
induce
specific
CD8+
T-‐cells
capable
to
in
vitro
recognize
both
BA71
and
E75
viruses;
an
effect
observed
for
the
first
time
for
ASFV-‐attenuated
viruses,
capable
only
to
confer
protection
against
homologous
viruses;
v)
Inoculation
of
106
PFU
of
BA71.ΔCD2
protected
100%
of
the
immunized
pigs
against
lethal
challenge
with
the
virulent
strain
Georgia07,
currently
circulating
in
Europe.
The
encouraging
results
obtained
during
this
Thesis
open
new
expectations
and
strength
our
opinion
about
the
possibility
of
obtaining
a
vaccine
against
ASFV.
Despite
these
promising
findings,
this
vaccine
prototype
should
be
refined
to
obtain
a
safer
vaccine
capable
also
of
inducing
a
differential
immune
response
from
circulating
ASF
viruses;
a
must
in
Veterinary
vaccines
against
diseases
of
compulsory
declarations.
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Inhibición de las etapas tempranas de ciclo replicativo del virus de la inmunideficiencia humana tipo1 (VIH-1): mecanismo de acción y posible estratégia terapéuticaCabrera Navarro, Cecilia 01 June 2001 (has links)
Recientes progresos en el conocimiento de la patogénesis de la enfermedad causada por el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH-1) junto con el desarrollo de potentes agentes antiretrovirales han resultado en una abundancia de opciones de tratamiento para los individuos infectados por este virus, y entre estos progresos, los avances en el conocimiento del proceso por el cual el VIH-1 entra en la célula huésped, han señalado este punto como una diana para el desarrollo de nuevas drogas que añadir al actual armamento terapéutico. Este trabajo esta centrado en el proceso de entrada viral, en su posible inhibición y en las consecuencias del bloqueo de alguno de sus pasos. AR177 (Zintevir) y las albúminas cargadas negativamente son dos clases de compuestos de naturaleza aniónica. Nosotros mostramos evidencias directas de que ambos compuestos interaccionan con la molécula gp120. Esto nos permite sugerir un modo de acción común para ambas clases de compuestos: la unión de dichas moléculas a la glucoproteína gp120, acción que previene una asociación estable entre el VIH-1 y las células CD4+. Los biciclanes y los aminoglicosidos conjugados a L-argininas son dos clases de agentes antivirales catiónicos. La fuerte interacción con CXCR4 aquí mostrada, indica que el mecanismo de acción de ambas clases de compuestos es el bloqueo del correceptor CXCR4. La naturaleza catiónica de estos compuestos podría conducir a interacciones electrostáticas con los residuos cargados negativamente de CXCR4, impidiendo de este modo la interacción de la glucoproteína de la envuelta de VIH con el correceptor CXCR4. Frente al bloqueo del receptor de quimiocinas CXCR4, en un modelo experimental que trataría de reflejar lo que ocurriría in vivo, el VIH-1 evoluciona de dos formas muy diferentes. Con concentraciones subóptimas del antagonista, y sin la posibilidad de utilizar otro correceptor, el virus adquiere un gran número de mutaciones en la glucoproteína de la envuelta que le permite crecer sin cambiar de correceptor Con concentraciones óptimas del antagonista, y en presencia del receptor CCR5, se da un cambio de fenotipo de tipo X4 a fenotipo de tipo R5 y se previene el cambio de fenotipo de tipo R5 a tipo X4, sugiriendo que el tratamiento de pacientes VIH-positivos con un antagonista de CXCR4 podría revertir el fenotipo viral de tipo X4 a un fenotipo menos patogénico de tipo R5 prolongándose así la fase asintomática de la enfermedad. En conjunto, nuestros resultados muestran que el bloqueo del proceso de entrada del virus de la inmunodeficiencia humana nos puede ofrecer una nueva oferta de fármacos antivirales que no sólo mejorarían las terapias anti-VIH actualmente existentes, sino que nos pueden ayudar a aumentar el conocimiento del proceso de infección del VIH, además de ayudarnos a diseñar nuevas drogas quizá capaces de llegar a la erradicación de la infección por el virus de la inmunodeficiencia humana.
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Description of a novel species of Torque teno sus virus (TTSuV) and first insights on immunization against TTSuVs in naturally infected pigsJiménez Melsió, Alexandra 13 November 2015 (has links)
Els anellovirus són un grup de virus de cadena senzilla d’ADN amb una elevada diversitat genètica i que infecten a vertebrats. Els Torque teno sus virus (TTSuV) son ubics i és l’espècie d’anellovirus específica que infecta els porcs. S’han descrit 3 espècies víriques diferents, anomenades TTSuV1a i TTSuV1b dins del gènere Iotatorquevirus i TTSuVk2a, dins el gènere Kappatorquevirus. Aquests virus son genèticament molt diferents (>56% de diversitat de seqüencia nucleotídica) però comparteixen la mateixa organització del genoma i estratègia d’expressió. L ‘infecció de TTSuV en porcs es caracteritza per una virèmia persistent. Els TTSuVs no es consideren patogènics, però es creu que juguen un paper en la co-infecció amb altres agents infecciosos que causen malalties porcines importants. L'impacte real dels TTSuVs sobre la salut dels porcs, si n’hi ha , segueix sent objecte de debat.
L'objectiu principal d'aquesta Tesi fou caracteritzar la variabilitat de TTSuV i explorar el desenvolupament de possibles prototipus vacunals enfront els TTSuVs.
El primer estudi descriu la caracterització genètica d'una nova espècie de TTSuV, anomenada Torque teno sus virus k2b (TTSuVk2b). Segons l'anàlisi filogenètica, aquest nou virus pertany al gènere Kappatorquevirus, el mateix al qual pertany TTSuVk2a. Es van desenvolupar tècniques quantitatives de PCR basades en la tecnologia de SybrGreen pels estudis epidemiològics i per l’estudi de la distribució geogràfica. En concret, es va desenvolupar una tècnica que quantificava la càrrega total de TTSuV (TTSuV broad-spectrum qPCR) i tres més que quantificaven la càrrega viral específica de cada espècie de TTSuV. D'altra banda, es va estudiar la prevalença i la càrrega d'ADN vírica en animals afectats amb per circovirosi porcina (CP). L'estudi epidemiològic va revelar que TTSuVk2b es distribueix a tot el món, encara que és menys abundant que TTSuV1 i TTSuVK2a. TTSuVk2b es va associar amb la CP, una malaltia porcina d'importància econòmica molt significativa.
El segon estudi contenia dos objectius: d'una banda, l'expressió de les proteïnes TTSuVs; per l'altra banda, l’avaluació de l'impacte d’una vacuna experimental multivalent enfront les 4 espècies de TTSuVs conegudes, utilitzant com a model l’infecció natural de TTSuV en porcs. Les proteïnes recombinants ORF1, ORF1-A, ORF2 i ORF3 dels quatre TTSuVs coneguts es van expressar amb èxit mitjançant un sistema d'expressió de baculovirus. Per altra part, la vacuna experimental multivalent (formada per les proteïnes dels gens ORF1 i ORF3) va ser administrada per via intramuscular i intradèrmica utilitzant dos esquemes de vacunació diferents (dues o tres dosis). La seroconversió i els títols vírics en sang es van mesurar a partir de 3 fins a 15 setmanes d'edat, utilitzant respectivament l'ELISA indirecte basat en proteïnes del virus expressades en baculovirus i tècniques de PCR quantitativa per detectar i quantificar els nivells de virèmia de cada espècie TTSuV, respectivament. Aquest estudi va mostrar que la vacuna multivalent induïa anticossos anti-TTSuV, però aquest prototipus vacunal no era capaç de controlar la virèmia durant l’infecció natural de TTSuV.
Finalment, en el tercer estudi es va avaluar l’immunització enfront TTSuVk2a durant l’infecció natural en porcs. L’immunització va consistir en una combinació d'ADN i proteïnes víriques per augmentar les possibilitats d'activació de respostes immunitàries tant cel·lulars com humorals. Es van utilitzar tècniques de PCR quantitativa per detectar i quantificar els nivells de virèmia de cada espècie de TTSuV, mentre que l’inducció d'anticossos específics va ser monitoritzada mitjançant ELISA indirecte. El grup vacunat va mostrar una seroconversió i una reducció significativa de les càrregues víriques de TTSuVk2a en comparació amb el grup control. Aquest estudi va demostrar per primera vegada que la virèmia per TTSuV pot ser controlada a través de l’ús d’una combinació que inclou ADN i proteïnes recombinant.
En general, aquesta Tesi Doctoral contribueix a augmentar el coneixement dels TTSuVs mitjançant la descripció d’una nova espècie vírica, la qual pot estar associada al desenvolupament de malalties del porc, com s’ha indicat per TTSuVk2a. A més, l’infecció per TTSuV pot ser controlada mitjançant l'administració d'una vacuna d'ADN i proteïnes recombinats del virus, mentre que la vacuna basada en múltiples proteïnes (multivalent) no va ser eficient. / Anelloviruses are a highly diverse group of circular single-stranded DNA viruses infecting vertebrates. Torque teno sus viruses (TTSuV) are ubiquitous pig-infecting anelloviruses. Three different viral species have been described, namely TTSuV1a and 1b within the genus Iotatorquevirus and TTSuVk2a, within the genus Kappatorquevirus. These viruses are genetically very distinct (>56% sequence diversity) but share similar genome organization and expression strategy. TTSuV infection in pigs is distributed worldwide, and is characterized by a persistent viremia. TTSuV themselves are considered non-pathogenic; however, it is believed that these viruses play a role in co-infection with other economically important viral porcine infections. Apparently, TTSuV infection can influence the development or may contribute to the pathogenesis of various porcine diseases during co-infection. The real impact of TTSuV on the pig health, if any, is still under debate.
The present Thesis aimed to characterize a novel TTSuV species and to explore possible ways of vaccination against TTSuVs.
The first study describes the discovery, genetic characterization and epidemiology of a novel TTSuV species, named Torque teno sus virus k2b (TTSuVk2b). According to phylogenetic analysis, this new virus belongs to the Kappatorquevirus genus, belonging to the same genus as TTSuVk2a. Quantitative PCR techniques based on SybrGreen technology were developed; one for quantification of total TTSuV load (TTSuV broad-spectrum qPCR) and others for quantification of each TTSuV species separately. These techniques were used for epidemiological studies and assess the geographical distribution. Moreover, prevalence and viral DNA load were determined in porcine circovirus type 2-systemic disease (PCV2-SD)-affected animals and healthy counterparts, since previous studies have associated another kappatorquevirus species, to the disease.
The epidemiological study revealed that TTSuVk2b is worldwide distributed, although less abundant and displaying lower viral DNA titres in serum than TTSuV1 and TTSuVk2a. TTSuVk2b was associated with PCV2-systemic disease (PCV2-SD), which revealed that the two kappatorquevirus species are both genetically and biologically related.
The second study contained two objectives. On one hand, TTSuV proteins were expressed in a baculovirus-based platform; on the other hand, the impact of a multivalent experimental vaccine was evaluated in a natural TTSuV infection model of pigs. The ORF1, ORF1-A, ORF2 and ORF3 recombinant proteins of all four known TTSuVs were successfully expressed in a baculovirus expression system. In additional, the multivalent experimental vaccine containing ORF1 and ORF3 proteins was administered by intramuscular and intradermal routes using two different vaccination schedules (twice or three times). Seroconversion and viral titres in blood were measured from 3 weeks until 15 weeks of age, using the indirect ELISA based on baculoviruses proteins and species-specific qPCRs, respectively. This study showed that vaccination induced anti-TTSuV antibodies; however the multivalent vaccine was not able to control viremia during TTSuV natural infection.
Finally, in the third study, the immunization against TTSuVk2a during natural infection was evaluated using a different approach. The immunizations consisted of a combination of DNA and protein to increase the possibilities of activating both cellular and humoral immune responses. Quantitative PCR techniques were used to detect and quantify the viremia levels of each TTSuV species, while the induction of specific antibodies was monitored by indirect ELISA. The vaccinated group showed a seroconversion and a significant reduction of the TTSuVk2a viral loads compared to the control group. This study demonstrated for the first time that TTSuV viremia can be controlled by a combined DNA and protein immunization.
Overall, the present Thesis contributes to increase the knowledge on TTSuV by means of describing a novel species, which may be involved in disease progression in co-infection with other pig pathogens. Moreover, TTSuV infection can be controlled by the administration of a combined DNA/protein immunization while a multivalent protein based vaccine was not efficient.
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Development of artificial viruses for nanomedicine and gene therapySaccardo, Paolo 20 February 2015 (has links)
La convergencia de diversas disciplinas como la biotecnología, biología molecular e ingeniería genética en el desarrollo de vehículos terapéuticos a escala nanometrica para la entrega de moléculas terapeuticas, se plantea como una herramienta con un elevado potencial en el campo de la nanomedicina. El mayor reto de estos nanovehiculos es permitir una eficaz entrega de ácidos nucleicos, proteínas o incluso fármacos, con una elevada especificidad celular para poder así disminuir la dosis administrada y por eso reducir sus toxicidad. En el caso de los ácidos nucleicos, la especificidad de entrega y la protección de los mismos de las nucleasas son los puntos clave para prever el desarrollo de estos sistemas. Sin embargo, el uso de vectores virales que parecían contener todos los elementos necesarios para aplicar la terapia génica extensivamente, ha topado con serios problemas de toxicidad e inmunogenicidad que limitan su uso. Así pues, el desarrollo de vectores de entrega no víricos, degradables y de diverso origen como dendrímeros, liposomas, polímeros, proteínas modulares o virus-like particles (VLPs), entre otros, se ha revelado como un campo de investigación que promete aportar las herramientas necesarias para desarrollar vehículos auto ensamblables “inteligentes” capaces de superar las barreras impuestas por el sistema biológico y llegar al tejido o compartimiento celular diana sin provocar las reacciones adversas que limitan el utilizo de sistemas virales.
En el óptica de estudiar la optimización de nanovehiculos autoensamblabels de origen proteicos para la terapia génica, hemos explorado por un lado la caracterización de VLPs obtenidas mediante la expresión del la proteína VP1 de la capside viral del human JC virus tanto en E.coli, como en células de insecto. Por otro lado hemos estudiado la optimización del proceso de producción y autoensamblado de proteínas multifuncionales y evaluado su capacidad de unir y proteger los acidos nucleicos de la degradación por parte de proteasas.
Así pues, diferentes entornos genéticos del sistema de control de calidad en E. coli han evidenciado la alteración del rendimiento de producción y de calidad conformacional en el ensamblado de las VLPs del virus JC. En este tesis hemos explorado los efectos de la chaperona DnaK en la producción y calidad conformacional de las VLPs formadas por la proteína VP1 a través de tres cepas caracterizadas por la presencia/ausencia/sobre expresión de la chaperona DnaK. Se ha observado que la ausencia de esta chaperona promueve una mayor rendimiento de producción pero al mismo tiempo ha demostrado efectos negativos en el ensamblaje de las VLPs.
El mismo concepto se ha aplicado en estudios en células de insecto, co-produciendo la proteína VP1 y las chaperonas bacterianas DnaK/DnaJ. En este caso el rendimiento de producción se ha visto afectado por la presencia de las chaperonas contrariamente a la calidad conformacional que se ha visto beneficiada.
Paralelamente, estudios sobre las propiedad arquitectónicas de la proteína modular R9-GFP-H6 y sus interacciones con el ADN ha permitido establecer las condiciones optímales para la interacción de sus dominios peliotropicos, resultante en el auto ensamblado de esta proteína en complejos ADN/nanoparticulas capaces de proteger el ADN de la acción de proteasas. Además se ha propuesto un modelo bioinformática de las nanoestructuras estudiadas. Consecuentemente a la caracterización de la R9-GFP-H6, diferentes modelos de proteína modula auto-ensamblables derivada de esta han sido estudiados para evaluar sus eficacias a la hora de unir y transportar ADN al núcleo celular. En esta tesis se ha propuesto una modificación del protocolo de purificación que permite aumentar sensiblemente la eficacia de las diferentes nanoparticulas implicadas.
Por lo tanto, en todos estos trabajos, queda reflejado que el desarrollo de virus artificiales para nanomedicina y terapia génica es un proceso fascinante y multidisciplinario donde las nanoparticulas de origen proteicos, sean proteínas modulares o virus like particles, están siendo concebidas como una herramienta extremadamente potente para la obtención de productos eficientes, seguros y comercialmente atractivos. Con esta tesis, entonces, se pretende entrar a fondo en las técnicas de desarrollo y mejora del proceso productivo de novedosas nanoestructuras proteicas para sus utilizo en nanomedicina. / The convergence of different field as biotechnology, molecular biology and genetic engineering in the development of a nano-scale therapeutical vector became matter of interest because of their nanomedical applications. The major challenge of nanovectors is obtain a good delivery of nucleic acid, therapeutic proteins or drugs, with high cell specificity and low side effects. In this way, viral vectors allow an extremely efficient delivery but are also responsible of severe side effects. Because of this main limitation, the development of artificial virus derived from either dendrimers, liposomes, polymers, modular proteins or virus like particles (VLPs) is considered an interesting and promising research field.
In this thesis we expose our studies in the optimization of protein self-assembling nanoparticles. From one side we produced and characterized VLPs derived form the major capsid protein VP1 of the human JC virus both in E. coli and insect cells protein factories. On the other side we studied the optimization of the self-assembling and the purification process of multi-domain self-assembling proteins derived by paradigmatic protein R9-GFP-H6, which is described to form nanoparticles.
Different genetic backgrounds for protein quality control system in E. coli have shown to alter the protein production yield and conformational quality of artificial virus assembly. We discuss in this thesis the effects of the prokaryotic DnaK chaperone on VP1 production yield and VLPs conformation quality. For this purpose we used three genetic backgrounds including, wild type expression, over-expression and absence of expression of DnaK molecular chaperone. Surprisingly, in the absence of the molecular chaperone the production yield of VP1 is enhanced but has negative effects on VLPs assembly. Moreover we tested different buffer formulations in order to establish the optimal salt concentration and pH for VLP organization, stabilization and conformation. The same concept where applied for insect cell system, exploring the effects in yield and conformational quality of VP1 hJCV VLPs upon re-hosting DnaK/DnaJ chaperones. Results showed a lowering in production yield upon chaperone co-expression but an increase in VLPs conformational quality.
At the same time architectural properties of the paradigm protein R9-GFP-H6 and its interactions with DNA were studied in order to obtain a suitable protein-based artificial virus for gene delivery. It has been observed that in presence of DNA and at slightly acidic pH, R9-GFP-H6 proteins organize in two distinct populations. Microscopy observations showed a supramolecular organization of DNA/nanoparticle complexes, revealing the 9 Arginine and 6 Histidines blocks as promising pleyotropic domains. Moreover, in optimized conditions, R9-GFP-H6 protein has also showed an effective DNA protection against proteases. Finally, we purposed potential structural models of R9-GFP-H6/DNA complexes, based on bioinformatics analysis and experimental data.
Subsequently we explored the nucleic acid contaminants in non-viral protein based nanovector production process of R9-GFP-H6 derivative proteins. Enzymatic downstream treatment with nucleases has revealed a good strategy to solve the limitations derived from nucleic acid contamination.
All together, these works allows having a general overview of non-viral nanoparticles approach in gene delivery and permitting to understand better the difficulties in the production process.
With this thesis, then, we claim to discuss and develop newly production and purification methods in order to develop efficient artificial virus for nanomedicine and gene therapy.
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