Orientador: Jane Megid / Banca: Hélio Langoni / Banca: Marcos Bryan Heinemann / Resumo: A utilização de métodos sensíveis e específicos para o diagnóstico da raiva constitui uma importante ferramenta para o controle e profilaxia dessa enfermidade. A Reação em Cadeia pela Polimerase através de Transcriptase-Reversa (RT-PCR) tem sido utilizada com bons resultados no diagnóstico do vírus rábico, mesmo quando as amostras estão em estágio de decomposição. Adicionalmente as técnicas moleculares têm sido utilizadas para estudos epidemiológicos possibilitando um melhor conhecimento da epidemiologia viral. O presente trabalho teve como objetivo avaliar as técnicas de RT-PCR e hnRT-PCR para a detecção do vírus rábico em estudos retrospectivos, para isso foram avaliadas 101 amostras cerebrais de diferentes espécies animais armazenadas por diferentes períodos, recém-descongeladas e mantidas em temperatura ambiente por 72 horas para decomposição. Os resultados das técnicas de RT-PCR e hnRT-PCR foram comparados com resultados prévios da Imunofluorescência Direta (IFD) e Inoculação Intracerebral em Camundongos (IC). Das 50 amostras positivas testadas, 26 (52%) apresentaram resultados positivos para a RT-PCR e 45 (90%) com a associação da hnRT-PCR quando realizadas em amostras recentemente descongeladas. Das amostras em decomposição foram analisadas 48 previamente positivas; onde 17 (34,3%) apresentaram resultado positivo para a RT-PCR e 36 (75%) com a associação da hnRT-PCR. Não foram encontrados resultados falso-positivos nas amostras negativas submetidas às técnicas de biologia molecular. A hnRT-PCR apresentou maior sensibilidade em relação à RT-PCR nas amostras recém-descongeladas e em decomposição. Os resultados sugerem a viabilidade de sua aplicação em estudos retrospectivos em materiais descongelados e decompostos. / Abstract: The use of methods, both sensitive and specific, for rabies diagnosis are important tools for the control and prophylaxis of the disease. Reverse-Transcriptase Polymerse Chain Reaction (RT-PCR) has been used in rabies diagnosis with good results, even in decomposed materials. Additionally, molecular techniques have been used for epidemiological studies and better knowledge of viral epidemiology. The aim of this work was to evaluate the RT-PCR and hnRT-PCR in rabies virus detection in retrospectives studies. RT-PCR and hnRT-PCR were evaluated in 151 brain samples from different animal species, thawed and left at room temperature for 72 hours for decomposition. The RT-PCR and hnRT-PCR results were compared with preview results from Fluorescent Antibody Test and Mouse Inoculation Test. From the 50 positive fresh samples, 26 (52%) were positive for RT-PCR and 45 (90%) for hnRT-PCR. From the 48 positive decomposed samples, 17 (34, 3%) were positive for RT-PCR and 36 (75%) for hnRT-PCR. No false-positives results were found in the negatives samples submitted to the molecular techniques. These results show that the hnRT-PCR was more sensitive than RT-PCR, and both techniques presented lower sensibility in decomposed samples. The hnRT-PCR presented greater sensibility than the standards techniques (IFD e IC) in decomposed materials for rabies diagnosis. These results suggest the viability of the application of molecular techniques in thawed and decomposed materials for retrospective studies. / Mestre

Orientador: Marcel Agenor Pavan / Banca: Renate Krause Sakate / Banca: Francisco Murilo Zerbini Junior / Banca: Olivier Le Gall / Banca: Ivan G. Maia / Resumo: A família Sequiviridae é constituída por dois gêneros: Waikavirus e Sequivirus. Os vírus apresentam partículas isométricas com aproximadamente 30nm de diâmetro e uma única fita de RNA sentido positivo, sendo que o genoma dos waikavírus é poliadenilado e dos sequivírus não. Dandelion yellow mosaic virus (DaYMV) foi relatado infectando alface em diferentes países da Europa e classificado no gênero Sequivirus, porém dados moleculares não estão disponíveis para este vírus. No Brasil, um vírus isométrico infectando alface foi isolado por Marinho et al., (1982) no Distrito Federal e denominado de Lettuce mottle virus (LeMoV). Um provável isolado deste vírus isométrico foi descrito mais tarde no estado de São Paulo por Stangarlin (1995), sendo encontrado frequentemente em infecções mistas com o Lettuce mosaic virus (LMV). Em ensaios de microscopia eletrônica utilizando antissoro policlonal específico para Dandelion yellow mosaic sequivirus (DaYMV) e extrato foliar de plantas infectadas pelo LeMoV, foi verificada uma reação sorológica parcial (Chaves, 1999), indicando que o LeMoV possivelmente seria um membro do gênero Sequivirus, família Sequiviridae. Um protocolo funcional de purificação tanto para o LeMoV como para o DaYMV foi desenvolvido e sequências parciais do genoma de ambos os vírus foram obtidas usando preparações virais purificadas e... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: The Sequiviridae family is constituted by two genus: Waikavirus and Sequivirus. The virus have approximately 30nm of diameter and a single-stranded of positive sense RNA. The genome of waikavirus is polyadenylated and of sequivirus not. Dandelion yellow mosaic virus (DaYMV) was reported in different countries of the Europe infecting lettuce and classified in the Sequivirus genus however, molecular data are not available for this virus. In the region of Federal District, Brazilan isometric virus infecting lettuce was isolated by Marinho et. al., (1982) and called of Lettuce mottle virus (LeMoV). Probable a strain of this isometric virus was described later in the Sao Paulo state by Stangarlin (1995), frequently found in mixed infections with the Lettuce mosaic virus (LMV). Using specific polyclonal antiserum for Dandelion yellow mosaic sequivirus (DaYMV) and foliar extract of plants infected for the LeMoV, a partial serological reaction was verified for this virus (Chaves, 1999), indicating that the LeMoV could be possibly a member of Sequivirus genus, Sequiviridae family. A functional protocol of purification was developed for LeMoV and DaYMV and partial genome sequences for both virus was obtained using virus purified preparation and degenerated primers for the Sequiviridae family. Sequences of the LeMoV-AF197 and the DaYMV-DSM2 were analyzed and showed a high identity with other members of the family. Universal primers that detect both viruses and specifics primers for LeMoV and DaYMV were used in diagnosistic tests based on RT-PCR. The specific primers amplified one fragment of 300bp for the LeMoV and 331bp for the DaYMV, being highly specific for diagnosis because no antiserum with good properties are available for these viruses. Different sequivirus proceeding from Brazil (BR11), Chile (Ch36), Holland (DSM2) and France (2227) were also evaluated in this work... (Complete abstract click electronic access below) / Doutor

Orientador: Deilson Elgui de Oliveira / Banca: Ricardo Sobhie Diaz / Banca: Celso Teixeira Mendes Júnior / Resumo: A história natural de infecção pelo HIV e a progressão para a aids podem variar entre diferentes indivíduos, possivelmente devido a fatores genéticos, entre eles os polimorfismos de nucleotídeo simples (SNPs). SNPs localizados em regiões promotoras de genes que codificam citocinas podem afetar a síntese e a regulação dessas moléculas, resultando em alterações nas respostas imunitárias. O presente estudo buscou avaliar as frequências e os possíveis efeitos de SNPs nas posições -589 e -1098 da região promotora do gene da IL-4 e SNPs nas posições -238 e -862 da região promotora do gene do TNF-α em pacientes portadores do HIV. Amostras de DNA de 157 pacientes foram obtidas através de células mononucleares de sangue periférico e a genotipagem dos SNPs foi realizada pela técnica de High Resolution Melting (HRM). Foi observado que pacientes portadores de TT em SNP/pIL-4 -589 apresentaram contagem de linfócitos T CD8 + menor em relação aos portadores de CC (p=0.0104). Além disso, portadores de TT em SNP/pIL-4 -1098 apresentaram contagem de linfócitos T CD8 + maior em comparação aos portadores de GT (p=0.0053). Em relação a SNP/pTNF-α -238, as proporções de pacientes portadores de GG e GA diferiu entre os pacientes sem HAART e pacientes com HAART e sem falha terapêutica (p=0.0205). Assim, os resultados obtidos no presente estudo fortalecem a hipótese de que SNPs em genes de citocinas podem alterar a história natural da infecção pelo HIV e o curso clínico da doença, principalmente devido a alterações no balanço da produção de citocinas pro- e antiinflamatórias. / Abstract: The natural history of HIV infection and its progression towards aids may vary considerably among different individuals, possibly due to genetic factors, such as single nucleotide polymorphisms (SNPs). In cytokines genes promoters, SNPs may affect protein synthesis and regulation, resulting in more or less efficient immune responses against HIV. The present study evaluated the frequencies and possible effects of SNPs in the IL-4 gene promoter at positions -589 and -1098 and in the TNF-α gene promoter at positions -238 and -862 in HIV-infected patients from Brazil. DNA samples from 157 patients were obtained from peripheral blood mononuclear cells, and SNPs genotyping was performed by High Resolution Melting analysis (HRM). Patients carrying TT at SNP/pIL-4 -589 had lower circulating T CD8 + cells compared to CC carriers (p=0.0104). Moreover, carriers of TT at SNP/pIL-4 -1098 had more circulating T CD8 + cells compared to GT carriers (p=0.0053). Regarding SNP/pTNF-α -238, GG and GA proportions were significantly different between patients without HAART and patients on HAART without therapeutic failure (p=0.0205). In conclusion, these results provide compelling evidence that the presence of SNPs in cytokine-coding genes do modify the natural history of HIV infection, mainly due to changes in the balance between pro- and anti-inflammatory cytokines. / Mestre

Resumo: O presente estudo investigou a ocorrência de anticorpos contra o vírus da arterite eqüina, utilizando a técnica de soroneutralização viral em 1.400 eqüinos criados nas Mesorregiões Macro Metropolitana Paulista e Campinas, pertencentes a 42 municípios do estado de São Paulo (SP), Brasil entre os meses de janeiro de 2007 a dezembro de 2008. Do total das amostras, 80 (5,71%) apresentaram anticorpos para o vírus (títulos entre 4 e 4096). Dentre os 42 municípios amostrados, 15 (35,7%) apresentaram pelo menos um animal sororeagente. Foram analisadas 238 propriedades das quais 41 apresentaram ao menos um animal sororeagente. A ocorrência de animais reagentes foi maior em cavalos destinados ao esporte, particularmente das raças de Salto e Quarto de Milha e foi semelhante entre machos e fêmeas. A ocorrência também foi maior em animais acima de 24 meses de idade. Os resultados obtidos sugerem a circulação do vírus nos criatórios amostrados e alertam para o impacto econômico- sanitário da doença para a eqüideocultura do estado de São Paulo / Abstract: This study investigate the occurence of arteritis virus antibodies using virus neutralization teste in 1,400 equines from Campinas and Macro Metropolitan Paulista Mesoregions which belong to the 42 cities located on State of Sao Paulo, Brazil between january of 2007 until december of 2008. All the samples, 80 (5.71%) showed antibodies to equine arteritis virus (titers ranging from 4 to 4096). Among the 42 cities, 15 (35.7%) presented at least one positive animal to equine arteritis virus. Were studied 238 farms, and from these 41 showed at least one soropositive animal. The prevalence was higher in sport horses like Jumping Horses, Quarter Horses and was similar between females and males. The seropositive ocurrence was higher in animals above 24 months of age. These results suggest the circulation of virus among horse population in farms sampled and alert to sanitary and economical importance of this disease for the Sao Paulo State equine husbandry / Orientador: Alexandre Secorun Borges / Coorientador: Márcio Garcia Ribeiro / Banca: Wilson Roberto Fernandes / Banca: João Pessoa Araújo Junior / Mestre

Orientador: Paulo Inácio da Costa / Banca: Iguatemy Lourenço Brunetti / Banca: Fernanda de Freitas Aníbal / Resumo: Os perfis metabólicos correlacionam-se com a infecção pelo VHC e são prognósticos da resposta viral em pacientes crônicos. Porém, pouco se sabe a respeito da associação entre perfis lipídicos e carga viral do VHC entre infecções dos genótipos 1, 2 ou 3. Portanto, o objetivo deste trabalho foi estudar a influência da viremia e dos genótipos do VHC sobre o metabolismo lipídico através das variações de lipoproteínas séricas (colesterol total, LDL, HDL, VLDL, triglicérides) e apolipoproteína B (Apo B) em hepatopatas crônicos, avaliando se o VHC predispõe os indivíduos ao aparecimento de complicações vasculares. O grupo amostral constituiu-se de um total de 150 pacientes crônicos do VHC com genótipos 1, 2 ou 3, e de um grupo controle de 20 indivíduos saudáveis (10 homens e 10 mulheres) em idade adulta (20 à 50 anos). Os níveis séricos de HDL (28%), VLDL (26%) e triglicérides (26%) nos portadores crônicos do VHC se mostraram diminuídos em relação ao grupo controle, enquanto os níveis de LDL (25%) e Apo B (29%) se mostraram elevados, resultados que foram mais importantes nos portadores do genótipo 3a. Observou-se correlação positiva entre a viremia e alterações nos níveis de apo B (r = 0,5763) nos portadores do genótipo 1b. Assim, foi pressuposto que o risco de pacientes portadores do VHC desenvolverem complicações vasculares é elevado, pois 1% de redução nos níveis de LDL está associado com uma redução de 2-3% no risco de desenvolvimento de doenças cardíacas, e como cerca de 90% da proteína na LDL se constitui de apo B, sua concentração plasmática indica o número total de partículas potencialmente aterogênicas. Desta forma, o perfil lipídico auxilia no diagnóstico da severidade da infecção hepática causada pelo VHC e ainda atua como um bom sinal prognóstico. / Abstract: The metabolic profiles correlate with the hepatitis C virus infection and are prognostics for the viral reply in chronic patients. However, little is known regarding the distinguishing association between lipid profiles and hepatitis C viral load in patients carrying genotypes 1, 2 or 3. Therefore, the objective of this work was to study viremia and genotypes on the lipid metabolism through the serum lipoprotein variations (total cholesterol, LDL, HDL, VLDL, triglycerides) and apolipoprotein B (Apo B) in chronic carriers of this infection, evaluating if the HCV premakes the individual to the lipidic disequilibrium and favors the appearance of vascular complications. The amostral group consisted of 150 HCV chronic patients with genotypes 1, 2 or 3, and a control group consisted of 20 healthful individuals (10 men and 10 women) in adult age (20 to 50 years). The levels of HDL (28%), VLDL (26%) and triglycerides (26%) of the HCV chronic patients were lower than the control group, while the LDL levels (25%) and the Apo B levels (29%) were higher. These findings were more significant in the genotype 3a carrying patients. Positive correlation occurred between the viremia and the alterations in the Apo B levels (r = 0.5763) in the genotype 1b carrying patients. Consequently it was inferred that the risk of HCV patients to develop vascular complication is elevated. In general, 1% of reduction in the LDL levels is associated with a reduction of 2-3% in the risk of development of cardiac illnesses, and, as about 90% of the protein in the LDL is constituted of apo B, its plasmatic concentration indicates the total potentially atherogenics particles number. The lipid profile aids in the diagnosis of the severity of the hepatic infection and equally acts as a good signal prognostic, therefore its analysis must be carried through in all the cases of advanced hepatic infection. / Mestre

Orientador: João Pessoa Araújo Júnior / Banca: Lenice do Rosário de Souza / Banca: Alexandre Secorum Borges / Resumo: O Vírus da Imunodeficiência Felina (FIV) é um lentivírus que causa uma síndrome de imunodeficiência em gatos domésticos. O FIV tem sido particularmente utilizado em estudos de resistência viral aos análogos de nucleosídeos devido a Transcriptase Reversa (TR) apresentar propriedades físicas, catalíticas e sensibilidade às drogas semelhantes à TR do HIV. Os objetivos desse trabalho foram tratar com AZT gatos naturalmente infectados com o FIV, fazer o monitoramento da carga viral e DNA proviral por PCR em tempo real e monitoramento genético por seqüenciamento. Dos 12 animais infectados, 6 receberam o AZT na dose de 10mg/kg/dia e 6 receberam placebo. Durante 96 dias de tratamento, o plasma e sangue destes animais foram analisado com relação à carga viral e concentração relativa de DNA proviral utilizando-se a técnica de quantificação relativa por PCR em tempo real com SYBR Green, desenvolvida por nossa equipe. Além disso, foi realizado o sequenciamento genético da região que codifica a TR de 3 dos animais. Foi realizada com sucesso a padronização da PCR em tempo real para quantificação relativa do FIV. Não houve diferença estatisticamente significativa da carga viral ou do DNA proviral entre os grupos tratado e controle. O seqüenciamento genético revelou a presença de lisina na posição 41 do sítio ativo da TR. A presença deste aminoácido confere até 4 vezes menor sensibilidade ao AZT em mutantes do HIV. Por possuir alta estabilidade genética, supomos que os vírus dos demais animais não sequenciados possuem também a 41-lisina A presença da 41-lisina pode ser uma das possíveis explicações para a falha do tratamento com AZT. Outra hipótese é a de que a dose fornecida não foi adequada. / Abstract: Feline Immunodeficiency Virus (FIV) is a lentivirus which causes a progressive disruption of the host's immune functions. FIV has been particularly used as a model for studies in retroviral resistance to nucleoside analogs because its similarities in physical properties, catalytic and sensitivity in comparison with HIV/RT. The aims of this work were to treat cats naturally infected with FIV, quantify viral load and proviral DNA by real time quantitative PCR with SYBR Green and analyze the viral nucleotide sequence. From 12 animals naturally infected, 6 received AZT at a dose of 10mg/kg/day and 6 received placebo. During 96 days of treatment, viral load and concentration of proviral DNA were measured by relative quantitative real time PCR developed by our staff. The nucleotide sequence of the RT encoding region was also achieved for 3 animals. The real time PCR relative quantification was successfully standardized for FIV. There was no significant statistical difference between treated and control groups. The nucleotide sequence revealed a lysine at position 41 on the enzyme active site. This lysine confers 4-fold decreased sensitivity to AZT in HIV RT-mutants. FIV subtype B has high genetic stability and we purposed that the other virus not sequenced have the same amino acid and hypothesized that this mutations can be one of the reasons determining the failure of the treatment. The other hypothesis is that the dose was not adequate. / Mestre

Orientador: Maurício Lacerda Nogueira / Banca: Fátima Pereira de Souza / Banca: Cleslei Fernando Zanelli / Banca: Eurico de Arruda Neto / Banca: Luciana Barros de Arruda / Resumo: O vírus da Febre Amarela (YFV) pertence ao gênero Flavivirus e causa uma importante doença. Nos últimos anos, uma alarmante ressurgência da circulação viral e expansão do vírus em áreas endêmicas têm sido detectadas na África e América do Sul. NS5 é uma proteína viral não estrutural com duas atividades essenciais para a replicação viral, uma de metiltransferase e outra de RNA Polimerase dependente de RNA (RdRp). Para o melhor entendimento dos mecanismos de replicação viral, interações entre NS5 e proteínas celulares têm sido amplamente estudadas. Assim, os objetivos desse estudo foram caracterizar a interação da proteína NS5 e eIF3L, avaliar a função de eIF3L na replicação do vírus da febre amarela, e caracterizar estruturalmente a proteína eIF3L. Métodos. Para identificar a interação de NS5 YFV com eIF3L, foi realizado ensaios em sistema duplo-híbrido usando RdRp NS5 YFV contra eIF3L. Para o mapeamento da interação, foram construídos mutantes deletantes de RNApol e analisados em sistema duplo-híbrido. A região de interação de RNApol foi segmentada em três fragmentos e analisada na presença de eIF3L. Para mapear os resíduos de NS5 críticos para a interação, foi realizada mutagênese sítio-dirigida no segmento 3 de ID. A interação foi analisada em ensaios in vitro e em cultura de células de mamíferos. A significância de eIF3L para a replicação do YFV foi investigada usando superexpressão de eIF3L em células BHK21-RepYF17D LucNeoIres. A proteína eIF3L foi purificada usando uma combinação de cromatografia de afinidade e de exclusão molecular para subsequente caracterização estrutural. Resultados. Nesse estudo, foi caracterizada a interação de NS5 com o fator eucariótico de início de tradução... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Yellow fever virus (YFV) belongs to the Flavivirus genus and causes an important disease. An alarming resurgence of viral circulation and expansion of the YFV endemic zones have been detected in Africa and South America in recent years. NS5 is a viral protein that contains the methyltransferase and RNA-dependent RNA polymerase domains, which are essential during viral replication. Interactions among NS5 and cellular proteins have been studied for the understanding of viral replication. The aim of this study was to characterize the interaction of NS5 protein with EIF3L and evaluate the role of EIF3L in yellow fever replication. Methods. To identify the interaction of YFV NS5 with cellular proteins, we performed a two-hybrid screen using YFV NS5 RdRp domain as bait and a human cDNA library. For mapping the interaction, RNApol deletions mutants were performed and analyses in two-hybrid system. The RNApol region of interaction was segmented in three fragments and analyses into yeast containing eIF3L. To map residues of NS5 that are critical for its interaction, we performed a site-direct mutagenesis in segment 3 of ID. The interaction was confirmed in vitro assays and by in vivo coimmunoprecipitations. The significance of eIF3L for replication of YFV was investigated using overexpression of eIF3L in BHK21-RepYF17D LucNeoIres cells. eIF3L was purified using a combination of affinity and subsequent size exclusion chromatography for subsequent structural characterization. Results. In this work we describe and characterize the interaction of NS5 with the translation factor eIF3L. The interaction between NS5 and eIF3L was confirmed by in vitro binding and in vivo coimmunoprecipitation assays. This interaction occurs in a region (Interaction Domain of RNApol domain) that is conserved in several... (Complete abstract click electronic access below) / Doutor

Resumo: O pimentão (Capsicum annuum L.) está entre as dez hortaliças mais consumidas no Brasil. Dois potyvirus são verificados nesta cultura, o Potato virus Y (PVY) e o Pepper yellow mosaic virus (PepYMV). Foi avaliada entre outubro de 2007 a novembro de 2008, a ocorrência de potyvirus infectando Capsicum spp. nos municípíos de Pirajú, Pirajuí, Paranapanema, Santa Cruz do Rio Pardo, Sorocaba, São Miguel Arcanjo, Itapetininga, Reginópolis, Lins, Iacanga e Mogi-Mirim, do Estado de São Paulo. Das 408 amostras coletadas, 105 foram positivas para a presença de potyvirus utilizando-se antissoro antipotyvirus (Agdia). Em algumas amostras foi detectada a presença de infecção mista com o Cucumber mosaic virus (CMV) e begomovírus. A inoculação de cinqüenta e um isolados na série diferencial de Capsicum spp contendo os genes pvr21, pvr22 e Pvr4, dos quais dez foram provenientes da Empresa Sakata Seed Sudamérica, possibilitou a classificação de dois isolados em patótipo 0, três em patótipo 1, seis em patótipo 1.2, onze em patótipo 1.2.3 e treze em patótipo 1-3 de PVY. Dezesseis isolados não puderam ser classificados em patótipos. Não foi verificada correlação entre local de coleta e ocorrência de um patótipo específico, evidenciando grande variabilidade biológica dos isolados de potyvirus no campo. Nenhum dos isolados coletados ocasionou sintomas evidentes em plantas de pimentão Rubia R e Magali R, indicando que a resistência conferida por estes híbridos ainda é efetiva contra os isolados de potyvirus predominantes no campo. Um par de primers PepNib (5' GWTSGYYGMMTTGGATGATG 3') e PepUTR (5' AGTAGTACAGGAAAAGCC 3') foi 2 obtido para amplificação completa da região codificadora da proteína capsidial de PVY e PepYMV. Analisando-se esta região do genoma viral, pôde-se constatar predominância da espécie PepYMV. O PVY foi encontrado somente em coletas... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: The sweet pepper (Capsicum annuum L.) is one of the ten most consumed vegetables in the country. In Brazil, two potyviruses are verified in this culture, the Potato virus Y (PVY) and the Pepper yellow mosaic virus (PepYMV). Between October 2007 and November 2008, the occurrence of potyvirus infecting Capsicum spp. was evaluated on plants collected from Piraju, Pirajuí, Paranapanema, Santa Cruz do Rio Pardo, Sorocaba, São Miguel Arcanjo, Itapetininga, Reginópolis, Lins, Iacanga and Mogi-Mirim, in Sao Paulo State. Among the 408 collected samples, 105 were positive for the presence of potyvirus using antipotyvirus antiserum (Agdia). The presence of mixed infection with the Cucumber mosaic virus (CMV) and begomovirus was also verified. The inoculation of fifty one isolates on the series of Capsicum spp. containing the genes pvr21, pvr22 and Pvr4, ten of them isolates from the Sakata Seed Sudamerica Company, made it possible the classification of these isolates in different pathotypes. Two isolates were classified as pathotype 0, three in pathotype 1, six in 4 pathotype 1.2, eleven in pathotype 1.2.3 and thirteen in pathotype 1.3 of PVY. Sixteen isolates were not able to be classified in pathotypes of PVY. No correlation could be made between the origin of the isolate and the presence of an specific pathotype, indicanting a greet biological variability between the potyvirus isolates. None of the isolates collected in the field caused symptoms in Rubia R and Magali R, indicating that the resistance provided by these hybrids is still effective against the predominant isolates of potyvirus. A pair of primer PepNib (5' GWTSGYYGMMTTGGATGATG 3') and PepUTR (5' AGTAGTACAGGAAAAGCC 3') were obtained for the complete amplification of the capsid protein region of PVY and PepYMV isolates. PepYMV was the prevalent species of potyvirus found infecting sweet peppers. The PVY was found only... (Complete abstract click electronic access below) / Orientador: Renate Krause Sakate / Coorientador: Marcelo Agenor Pavan / Banca: Antonio Carlos Maringoni / Banca: Ricardo Gioria / Mestre

Orientador: Fátima Pereira de Souza / Banca: Karina Alves de Toledo / Banca: José Roberto Ruggiero / Resumo: O Vírus Sincicial Respiratório Humano (hRSV) foi identificado em 1957 e mesmo após vários anos de investigação, nenhuma vacina foi desenvolvida. Acredita-se que a chave de inibição da ação viral são suas glicoproteínas de membrana, em especial a proteína de fusão (F), que com auxílio da proteína de ligação (G), é responsável pela instalação do hRSV na célula hospedeira. Há evidências experimentais de que compostos como flavonóides e glicosaminoglicanos podem diminuir a infecção viral, sendo então a proteína F um bom alvo para a ação destes compostos. O presente estudo utilizou de ferramentas de bioinformática para verificar as possíveis regiões de interação da proteína F com a Heparina Sulfatada e Flavonóides. Os programas de bioinformática foram utilizados para: modelagem dos compostos, caracterização e previsão da estrutura secundária da proteína, modelagem da estrutura terciária e docking molecular entre o modelo da proteína F e as estruturas tridimensionais dos Flavonóides e da Heparina Sulfatada. Modelos válidos foram obtidos para as estruturas tridimensionais dos flavonóides e para o modelo completo da proteína F. As características da proteína incluem um alto nível de conservação na seqüência de aminoácidos e, especialmente, em seus sítios de ligação. O docking da proteína com a Heparina, e o virtual screening da biblioteca de Flavonóides e a estrutura da proteína, resultaram em sítios de interação com grande potencial de inibição, uma vez que concordam com evidências experimentais descritos na literatura. A Heparina liga-se ao sítio de clivagem II, importante região para obtenção da atividade de fusão da proteína. Os Flavonóides podem se ligar a região hidrofóbica que desestabiliza... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Human Respiratory Syncytial Virus (hRSV) was identified in 1957 and even after several years of research, no vaccine has been developed yet. It is believed that the key to the inhibition of viral action is its membrane glycoproteins, including the Fusion Protein (F), responsible for the installation of the hRSV in the host cell. There are evidences that compounds such as flavonoids and glycosaminoglycans can decrease the viral infection, and F protein can be a good target for the action of these compounds. The present study checked the possible sites of interaction between F protein and heparin and flavonoids, using computational tools. Bioinformatics programs were used for: modeling compounds, characterization and prediction of protein secondary structure, tertiary structure modeling and the docking between the protein model and the structures of flavonoids and sulfated heparin. Valid models were obtained for flavonoids structures and the complete model of F protein. The characteristics of the protein include a high level of conservation in amino acid sequence and especially in its binding sites. The heparin docking and virtual screening of flavonoids resulted in interaction sites with great potential for inhibition, since they agree with other studies and experimental evidence of F protein inhibition. This study shows that compounds such as sulfated heparin and flavonoids interact in important sites of F protein. Heparin binds to the cleavage site II and flavonoids can bind to the hydrophobic site that destabilizes the formation of the six-helix-bundle region. Both regions are important for conformational changes that F protein undergoes to get its fusion activity. Docking showed that molecular interactions are likely to occur and selected the best candidates for a possible inhibitor. These evidences... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre

Orientador: Luzia Helena Queiroz da Silva / Banca: Wagner André Pedro / Banca: Wilson Uieda / Resumo: A riqueza de espécies da fauna de morcegos e a ocorrência de vírus rábico foram avaliadas em área urbana (municípios da região de Araçatuba) e florestal (fragmento localizado no município de Valparaíso-SP), ambos localizados na região noroeste do Estado de São Paulo. Os morcegos da área urbana foram recebidos diretamente no laboratório de diagnóstico de raiva da UNESP - Campus de Araçatuba no período de 2006 a 2007. Morcegos da área florestal foram capturados mensalmente, no período de um ano de coletas em 2007, resultando em uma baixa diversidade de espécies. As amostras das duas áreas foram submetidas ao exame de diagnóstico de raiva, por meio das técnicas de imunofluorescência direta (IDF) e inoculação intracerebral em camundongos. Foram analisados 968 morcegos pertencentes a quatro famílias, Phyllostomidae, Noctilionidae, Molossidae e Vespertilionidae. Os morcegos observados em ambas as áreas no período de 2007 resultaram em uma similaridade na composição das espécies representada pela família Phyllostomidae. Morcegos da família Molossidae foram registrados na sua maioria em áreas urbanas, observando-se somente uma espécie no fragmento Florestal. A taxa de positividade na área urbana no período de 2006 a 2007 foi de 0,72%, inferior à média registrada em estudos anteriores, sendo os casos positivos em morcegos de hábito alimentar frugívoro e insetívoro. Todos os morcegos da área florestal foram negativos para o diagnóstico da raiva. O estudo pode contribuir para o conhecimento da diversidade de morcegos e a epidemiologia da raiva na região. / Abstract: The species richness of bat fauna and the ocurrence of rabies virus were studied in urban (municipal districts from Araçatuba region) and natural (forest fragment in Valparaiso town) environments, both located in the Northwestern Sao Paulo State. Bats from the natural forest were collected with mist nets in four different areas: forest, boarding areas, natural clearings in the woods and areas close to water and food sources. Urban samples were composed by bats, sent to UNESP Rabies Laboratory, for rabies virus research by fluorescent antibody test (FAT) and mouse inoculation test (MIT). A total of 968 bats belonging to four families, Phyllostomidae, Noctilionidae, Molossidae e Vespertilionidae, were analyzed. The results obtained from both areas showed a closed similarity in the composition of species and some particularities in the distribution of species according to trophic guilds in bats from Phyllostomidae family. Most of bats from the Molossidade family were recorded in urban areas, with only one species in the forest fragment. Considering all samples, 0,72% was rabies positive, a lower index compared to the mean index registered in the last years. All the positive cases occurred in frugivorous and insectivorous bats. This study was important to improve the knowlegment of bat diversity and rabies epidemiology in this specific region. / Mestre