Introduction: Recent advances in posterior lamellar keratoplasty necessitated the preparation of posterior corneal lamellae even in the Czech Republic. The aim of this work was to introduce and standardize a novel method of manual preparation of corneal lamellae for Descemet Membrane Endothelial Keratoplasty with a Stromal rim (DMEK-S) in an ocular tissue bank. After setting the criteria for endothelial quality, we obtained a licence to provide the tissues for transplantation purposes. The obtained results were analysed after two years. Furthermore, a novel lamellar insertion technique using a cartridge was assessed. The potentials for the long-term storage of posterior corneal lamellae by the vitrification in liquid ethane was studied using human amniotic membrane as a model tissue. Material and Methods: Corneoscleral buttons stored in tissue cultures were used to prepare lamellae consisting of a central zone of endothelium and Descemet membrane supported by a stromal rim at the periphery. The manual preparation was performed on an artificial anterior chamber using the big bubble technique. Endothelial quality was assessed before storage, before and immediately after preparation as well as after 2 days of storage at 31řC. A group of 12 corneas with a live endothelial cell density ≥ 2500 cells/mm2...

Different cryoprotectant media for cryopreservation of embryos has been tested on model species, i.e. common carp (Cyprinus carpio) and common tench (Tinca tinca). The aim of the study was to obtain such cryoprotectants, which will be acceptable for freezing embryos up to the temperature {--}196 oC. Cryoprotectants of 10 % and 20 % methanol or 10 % and 20 % glycerin have been tested on the tench for 21 minutes of incubation on embryos of four stages, meaning at 11, 17, 23 and 29-hrs after activation of gametes. The results showed that the tench embryos were most resistant either to low temperature and or to the application of cryoprotectants in the stage of 29-hrs post gametes activation. On the other hand lower resistances were obtained in the stage of 11-hrs post gamete activation. Embryos of carp 2, 6, 22, 24 and 42-hrs after gametes activation at temperature 18 and 22 oC have been used for testing of concentration series of cryoprotectant methanol and two solutions marked VS1 and VS2 after previous disruption of egg envelope in enzyme alcalaze solution. Results showed linear decreasing resistance of embryos depending on increasing concentration of cryoprotectant methanol. Hatching success even at highest concentration of solution VS1 and VS2 has not declined below 70 %. Achieved results with solution VS2 have been subsequently used for freezing of carp embryos by special methods in cryobiology {--} vitrification. First results showed up to 4 % success of survival after freezing of embryos at {$-$}196 oC.

A produção in vitro (PIV) de embriões bovinos é uma das biotécnicas de reprodução que mais evoluíram nas últimas duas décadas. No Brasil, a associação com a técnica de aspiração folicular guiada por ultra-som determinou uma significativa disseminação do uso comercial da PIV. A produção em larga escala de embriões PIV associada à dificuldade em criopreservá-los, determinou que um número significativo desses embriões passasse a ser descartado nas atividades de campo, gerando prejuízos aos produtores e técnicos envolvidos no processo. Os experimentos realizados no âmbito desta tese tiveram como objetivo identificar e propor soluções para um aproveitamento mais eficiente dos ovócitos e embriões PIV. Em virtude da qualidade dos embriões poder ser influenciada pelo sistema de produção in vitro, foi realizado um experimento (Capítulo 1) para determinar a capacidade dos embriões derivados de dois sistemas de PIV em resistir à vitrificação. Entretanto, nas condições testadas, não foram verificadas influências significativas do efeito do sistema de PIV. No segundo experimento (Capítulo 2), buscou-se identificar a influência da solução crioprotetora sobre a taxa de sobrevivência embrionária in vitro e in vivo. Os resultados obtidos revelaram um efeito significativo da solução de vitrificação sobre a sobrevivência in vitro, por outro lado as taxas de prenhez foram semelhantes. Estes resultados também comprovaram a viabilidade do método de transferência direta desenvolvido neste experimento. Finalmente, em um terceiro grupo de experimentos (Capítulo 3), foi determinada a viabilidade da vitrificação de ovócitos imaturos usando duas estratégias de resfriamento. Não foram observadas diferenças entre os tratamentos. Entretanto, a obtenção de produtos nascidos de embriões vitrificados, derivados de ovócitos imaturos vitrificados, confirma a viabilidade de criopreservação desses ovócitos como alternativa para programação das atividades de PIV. / The in vitro production (IVP) of bovine embryos has achieved an important development during the last two decades. In Brazil the large scale use of the follicular aspiration guided by ultrasonography has determined a significant improvement in the in vitro embryo production as a commercial tool. The difficulties to cryopreserve bovine oocytes and IVP embryos are at the moment the greatest barrier impairing the efficient application of this reproductive biotechnology which results in the disposal of large numbers of bovine IVP embryos. Considering these factors, this Thesis aimed to highlight new approaches to reduce embryo disposal and improve the pregnancies rates after the cryopreservation of bovine immature oocytes and IVP blastocysts. The first experiment (Chapter 1) was designed to observe the cryotolorance of embryos produced by two different IVP systems. The tested in-vitro systems did not show differences in the cryotolerance by in vitro production system. A second experiment (Chapter 2), was carried out to determine in vitro and in vivo embryo survival rates of IVP blastocysts cryopreserved using different vitrifications solutions. The results showed a significant vitrification solution effect on in vitro survival, however, when in vivo, the pregnancy rates were not different. This experiment also verified the feasibility of the direct transfer method for vitrified embryos. Finally, in a third experiment (Chapter 3) the viability of the vitrification of immature oocytes was determined using two cooling strategies. Differences among the treatments were not observed. However, calves born from the transfer of vitrified embryos, derived from vitrified immature oocytes, highlighted that the increase in cryopreservation efficiency of immature oocytes may be an important alternative to improve the IVP commercial application.

Submitted by (edna.saturno@ufrpe.br) on 2016-10-21T12:27:30Z No. of bitstreams: 1 Paula Fernanda Barbosa Araujo Lemos.pdf: 3078966 bytes, checksum: 8a115f68bff79f88ab9763ce148e7321 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-10-21T12:27:30Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Paula Fernanda Barbosa Araujo Lemos.pdf: 3078966 bytes, checksum: 8a115f68bff79f88ab9763ce148e7321 (MD5) Previous issue date: 2010-02-25 / Conselho Nacional de Pesquisa e Desenvolvimento Científico e Tecnológico - CNPq / The possibility of using a practical, fast and effective protocol for embryo cryopreservation such as glazing, may stimulate the application of the technique associated with embryo transfer by a larger number of teams at field level. However, it is necessary to develop specific protocols that result in increased embryonic viability. The objective of this study was to identify the damage caused by cryopreservation, assessing the morphological and ultrastructural feasibility of goat and sheep embryos undergoing cryopreservation of classic and vi trification in OPS (Open Pulled Straw). In experiment 1, embryos (N = 246) were obtained from superovulated Boer goats. The embryos were randomly divided into three groups: control group (n = 75) - freezing the classic method, DMSO group (n = 74) - vitrification and Group DF (n = 74) - vitrification. Embryos in the classic metod group were frozen using automatic freezing. Before freezing the embryos were left five minutes in the stabilizing solution of Ethylene glycol (EG). The embryos of the second group were placed in a DMSO solution containing 10% EG and 10% dimethyl sulfoxide (DMSO) and then transferred to a vitrification solution with 20% EG and 20% DMSO +0.5 sucrose. The embryos ofthe third group were placed in a balanced so lution containing 10% EG and 10% Dimethylformamide (DF) and then transferred to a vitrification solution with 20% EG and 20% sucrose +0.5 DF. In experiment 2, sheep embryos (N = 186) were obtained from superovulated Santa Ines ewes. The embryos were randomly divided into three groups: control group (n = 55) - freezing the classic method, DMSO group (n = 54) - vitrification and Group DF (n = 55) - vitrification. Embryos in the classic metod group were frozen using automatic freezing. Before freezing the embryos were left five minutes in the stabilizing solution of Ethylene glycol (EG). The embryos of the second group were placed in a DMSO solution containing 10% EG and 10% dimethyl sulfoxide (DMSO) and then transferred to a vitrification solution with 20% EG and 20% DMSO+0.5 sucrose. The embryos of group three were placed in a balanced solution containin g 10% EG and 10% Dimethylformamide (DF) and then transferred to a vitrification solution with 20% EG and 20% sucrose +0.5 DF. The embryos were evaluated by analysis of embryonic viability by the use of fluorescent probes, in this case propidium iodide and Hoechst 33342 Results indicate that in goat embryos, the control group maintained most of its viable cells after thawing with 33 33% of samples injured. Of embryos in the DMSO group, 26.66% had totally damaged cells. The DF group had 60% of samples with lesions. The ultrastructural study by transmission electron microscopy showed that the vitrified embryos had a greater preservation of cells. The vitrified embryos with DMSO had higher rates of in vitro survival (47.36%), followd by embryos glazed with the DF with a lower in vitro survival rate (31.58%), and lastly embryos frozen by the traditional method (25%). In sheep embryos found in theanalysis by fluorescent probe, cells in t he control group remained viable in all embryos analyzed, a similar result occurred with the DF group, where 80% of samples were deemed feasible, other than the DMSO group, which had 50% viability. The ultrastructural study showed that the findings were similar between the control and DF groups. Embryos vitrified with DF had higher rates of in vitro survival (53.33%) and in vivo (45%), the glazed with DMSO had an in vitro survival rate (26.66%) and in vivo (30%) and embryos frozen by the traditional method (33.33%) in vitro and (40%) in vivo. It can be concluded that the vitrification solution containing 20% ethylene glycol + 20% dimethylsulfoxide + 0.5 M sucrose is an effective method for cryopreservation of goat embryos produced in vivo. However, in sheep embryos, the combination of 20% ethylene glycol + 20% dimethylformamide + 0.5 M sucrose was the best cryoprotectant regarding embryo viability, demonstrating to cause less damage to thecytoskeleton and cell organelles, and presenting a satisfactory pregnancy rate. / A possibilidade de utilizar um protocolo de criopreservação prático, rápido e eficaz, como a vitrificação, estimularia a aplicação da técnica associada à transferência de embriões por um maior número de equipes em nível de campo. Porém, faz-se necessário o desenvolvimento de protocolos específicos que resultem no incremento da viabilidade embrionária. O objetivo deste trabalho foi identificar os danos causados pela criopreservação, avaliando a viabilidade morfológica e ultra-estrutural de embriões caprinos e ovinos submetidos a criopreservação pelo método clássico e pela vitrificação em OPS (Open Pulled Straw). No experimento 1, os embriões (N=246) foram obtidos de cabras da raça Boer superovuladas. Os embriões foram distribuídos aleatoriamente em três grupos: Grupo Controle (n= 75) - congelação pelo método clássico, Grupo DMSO (n= 74) – vitrificação e Grupo DF(n= 74) – vitrificação. Os embriões destinados ao congelamento clássico foram congelados utilizando congelador automático de embriões. Antes da congelação os embriões ficaram cinco minutos estabilizando nasolução de Etilenoglicol (EG). Os embriões do grupo DMSO foram equilibrados em solução de 10% de EG e 10% de Dimetilsulfóxido (DMSO) e depois transferido para solução de vitrificação com 20% EG e 20%DMSO +0,5 sacarose. Os embriões do grupo DF foram equilibrados em solução de 10% de EG e 10% de Dimetilformamida (DF) e depois transferido para solução de vitrificação com 20% EG e 20% DF+0,5 sacarose. No experimento 2, os embriões ovinos (N=186) foram obtidos de ovelhas da raça Santa Inês superovuladas. Os embriões foram distribuídos aleatoriamente em três grupos: Grupo Controle (n= 55) - congelação pelo método clássico, Grupo DMSO (n=54) – vitrificação e Grupo DF (n= 55) – vitrificação. Os embriões destinados ao congelamento clássico foram congelados utilizando congelador automático de embriões. Antes da congelação os embriões ficaram cinco minutos estabilizando na solução de Etilenoglicol (EG). Os embriões do grupo DMSO foram equilibrados em solução de 10% de EG e10% de Dimetilsulfóxido (DMSO) e depois transferido para solução de vitrificação com 20% EG e 20% DMSO+0,5 sacarose. Os embriões do grupo DF foram equilibrados emsolução de 10% de EG e 10% de Dimetilformamida (DF) e depois transferido para solução de vitrificação com 20% EG e 20% DF+0,5 sacarose. Os embriões foram avaliados por meio da análise da viabilidade embrionária pelo uso de sondas fluorescentes, utilizou-se Iodeto de Propídeo e Hoechst 33342, verificou-se nos embriões caprinos, que o grupo controle mantiveram grande parte das suas células integras após o descongelamento, 33,33% das amostras apresentaram-se lesionadas. Os embriões do grupo DMSO analisados, 26,66% estavam com suas células totalmente danificadas. O grupo DF apresentou 60% das amostras com lesões. O estudo ultra-estrutural por microscopia eletrônica de transmissão demonstrou que os embriões vitrificados revelaram uma maior preservação das células. Os embriões vitrificados com DMSO tiveram maiores taxas de sobrevivência in vitro (47,36%), os vitrificados com DF tiveram uma taxa de sobrevivência in vitro (31,58%), os congelados pelo métodoclássico obtiveram in vitro (25%). Nos embriões ovinos verificamos na análise por sonda fluorescente, que as células do grupo controle mantiveram viáveis em todos os embriões analisados, resultado semelhante ocorreu com o grupo DF, onde 80% das amostram foram consideradas viáveis, diferente do grupo DMSO, que tiveram 50% de viabilidade. O estudo ultra-estrutural demonstrou que os achados foram semelhantes entre os grupos controle e DF. Os embriões vitrificados com DF tiveram maiores taxas de sobrevivência in vitro (53,33%) e in vivo (45%), os vitrificados com DMSO tiveram uma taxa de sobrevivência in vitro (26,66%) e in vivo (30%) e os congelados pelo método clássico obtiveram (33,33%) in vitro e (40%) in vivo. Podemos concluir que, a solução de vitrificação contendo 20% de etilenoglicol + 20% de dimetilsulfóxido + 0,5M sacarose é um método eficiente para a vitrificação de embriões caprinosproduzidos in vivo. Entretanto em embriões ovinos, a associação de 20% de etilenoglicol + 20% de dimetilformamida + 0,5M de sacarose, foi o crioprotetor que apresentou melhor viabilidade embrionária, demonstrando causar menos lesões ao citoesqueleto e as organelas celulares, como isso apresentando um índice de gestação satisfatório.

Made available in DSpace on 2014-10-09T12:50:56Z (GMT). No. of bitstreams: 0 / Made available in DSpace on 2014-10-09T13:58:30Z (GMT). No. of bitstreams: 1 11106.pdf: 6970470 bytes, checksum: 75dd1652faa57785066487ced8605c9d (MD5) / Tese (Doutoramento) / IPEN/T / Instituto de Pesquisas Energeticas e Nucleares - IPEN/CNEN-SP

Made available in DSpace on 2014-10-09T12:43:23Z (GMT). No. of bitstreams: 0 / Made available in DSpace on 2014-10-09T14:09:43Z (GMT). No. of bitstreams: 1 06528.pdf: 7080627 bytes, checksum: 21b5c941bd62d915113928c48d6e1209 (MD5) / Tese (Doutoramento) / IPEN/T / Instituto de Pesquisas Energeticas e Nucleares - IPEN/CNEN-SP

Avaliou-se neste estudo o efeito do tratamento com somatotrofina recombinante bovina (bST) na população folicular, na taxa de recuperação e qualidade dos oócitos e na produção in vitro de embriões bubalinos. A hipótese foi de que o bST aumenta o número de folículos recrutados e a qualidade oocitária, melhorando a eficiência da técnica de aspiração folicular em fêmeas bubalinas. Foram utilizadas 10 novilhas bubalinas, sendo que o grupo bST (n=5) recebeu 500mg de bST em intervalos regulares, enquanto o grupo Controle (n=5) não recebeu tratamento adicional. Ambos os grupos foram submetidos a 10 sessões de aspiração duas vezes por semana. Foram quantificados o número total de folículos e o tamanho destes a cada sessão. Os oócitos recuperados foram quantificados e classificados de acordo com a sua qualidade (A, B, C, D, E), sendo os A+B+C considerados de boa qualidade. Os embriões produzidos foram vitrificados, e uma parte destes, transferidos em tempo fixo. Foram colhidas amostras de sangue para mensuração de IGF-I plasmático durante o estudo. O bST aumentou o número de folículos observados (12,2 vs. 8,7; p<0,05) e o número de oócitos recuperados (5,2 vs. 4,1; p=0,07), no entanto não afetou a qualidade destes, bem como a sua capacidade de desenvolvimento (p>0,05). Observou-se efeito significativo (p<0,05) de sessão de aspiração no número de folículos observados, de folículos aspirados e de oócitos recuperados. As concentrações plasmáticas de IGF-I não apresentaram efeito de tratamento (p>0,05), no entanto sofreram efeitos de sessão e também da interação entres sessão e tratamento (p<0,05). Obteve-se taxa de concepção de 10,53 % (2/19) após a inovulação dos embriões, gerando o nascimento de dois bezerros normais. Os resultados são sugestivos de que o tratamento com bST aumenta o número de folículos recrutados por onda de crescimento folicular, demonstrando seu potencial em aumentar a eficiência da técnica de aspiração folicular na espécie bubalina / The aim of this experiment was evaluated the effect of recombinant bovine somatotropin (bST) on follicular population, oocyte recovery rates and quality, and on in vitro buffaloes embryo production. The hypothesis was that bST improves the number of follicles per follicular growth wave and oocyte quality, enhancing the results in buffalos females submitted to ovum pick-up programs. A total of ten heifers were assigned in two experimental groups (bST Group that received 500mg of bST in regular intervals and Control Group that did not received any additional treatment). Both groups were submitted to 10 OPU sessions twice weekly (every 3 or 4 days). The number of follicles and its diameters were recoded in all OPU. The oocytes harvest were counted and classified in five categories (A, B, C, D, E). The A+B+C categories were considered as good quality oocyte. The embryos produced were vitrified and some of these embryos were transferred of fixed time. Blood samples for IGF-I were obtained every once weekly. The bST improved the follicular population (12.2 vs. 8.7; p<0.05) and the number of oocytes per session (5.2 vs. 4.1; p=0.07), however the treatment did not affect the oocyte quality and its in vitro development capacity (p>0.05). A significant effect (p<0.05) of OPU session was observed in follicular population, number of aspirated follicles and number of oocyte recovered. The plasma IGF-I was not affected (p>0.05) by treatment, however presented a significant effect of OPU session and also of the treatment by OPU session interaction (p<0.05). The conception rate was 10.5% (2/19) and two healthy and normal calves were born from transferred embryo. These results indicate the viability of bST treatment to improve the follicular recruitment and its potential application in buffaloes donors submitted to OPU programs

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Até o momento a literatura não determinou qual o melhor estadio de maturação (imaturo ou maduro) para que o oocito mantenha sua competência para o desenvolvimento reprodutivo após a criopreservação. O objetivo deste estudo foi determinar em qual estadio meiótico (imaturo -VG (vesícula germinativa) ou maduro- MII (metáfase II)) o oócito é menos susceptível ao dano na criopreservação, utilizando modelo experimental bovino. Foram utilizados ovários de vacas abatidas em matadouro, após a aspiração dos folículos, os oócitos imaturos (VG) foram selecionados para a maturação in vitro e vitrificação, e foram divididos em três grupos: 1) oócitos maturados in vitro e não submetidos à vitrificação (CONTROLE); 2) oócitos vitrificados imaturos (VG), descongelados e submetidos à maturação in vitro (CRIO-MIV); 3) oócitos maturados in vitro (MII), vitrificados e descongelados (MIV-CRIO). Os oócitos foram avaliados quanto a: a)maturação nuclear pela técnica de orceína acética; b) integridade da zona pelúcida (ZP) através de microscopia de polarização; c) viabilidade oocitária pela técnica de DEAD-LIVE; d) desenvolvimento embrionário (taxa de clivagem, produção e eclosão de blastocistos) através da fertilização in vitro (FIV) e ativação partenogenética (AT). Não houve diferença na capacidade de maturação nuclear entre os oócitos frescos e descongelados no grupo CRIO-MIV (p=0,23). Em relação à zona pelúcida a totalidade dos oócitos (100%) nos três grupos apresentou leitura de zona pelúcida positiva, não havendo correlação com evolução embrionária posterior. Na análise de viabilidade celular pelo DEAD-LIVE verificou-se que houve redução da viabilidade do grupo MIV-CRIO (27%) quando comparado com controle (84%) (p<0,0001). Na análise do potencial de desenvolvimento embrionário o grupo controle apresentou melhores taxas de clivagem após FIV (80%) e AT (58%), do que os grupos CRIO-MIV (28%; p<0,0001; 28%; p=0,0002, respectivamente) e MIV-CRIO (26%; p<0,0001; 22%, p<0,0001,respectivamente). As taxas de formação de blastocisto e eclosão após FIV nos grupos CRIO-MIV, MIV-CRIO e após AT no grupo MIV-CRIO foram nulas. Houve a produção e eclosão de apenas um blastocisto no grupo CRIO-MIV após AT. No modelo experimental utilizado, o procedimento de vitrificação comprometeu parcialmente a viabilidade dos oócitos medida pela técnica de DEAD- LIVE e completamente o desenvolvimento embrionário subseqüente, independente do estadio de maturação meiótica (VG ou MII) durante a criopreservação. No entanto, oócitos vitrificados em estadio de VG e submetidos à MIV foram meioticamente competentes e progrediram até o estadio de MII, sugerindo que o dano não compromete a capacidade de maturação nuclear do oócito. Este estudo não conseguiu determinar qual o melhor estadio meiótico oocitário para criopreservação, já que os dois estadios meióticos (VG e MII) se mostraram igualmente prejudicados pela criopreservação em relação à capacidade reprodutiva. / Until the present literature has not achieved a consensus regarding the best maturation stage for oocyte to maintain their reproductive capacity after cryopreservation. The aim of this study was to determine, using an experimental bovine model, in which stage of development (VG stage, immature, or MII stage, post-maturation in vitro) the oocyte is less susceptible to damage during cryopreservation. Immature oocytes (VG) from the ovaries of slaughtered cows were selected for in vitro maturation or vitrification and divided into three groups. The first group (CONTROL) consisted of immature oocytes, matured in vitro without vitrification; the second group (CRYO-IVM) consisted of vitrified immature oocytes thawed and submitted to in vitro maturation; and the third group (IVM-CRYO) consisted of matured in vitro oocytes submitted to vitrification and thawing. The oocytes were evaluated for: nuclear maturation by acetic orcein staining; integrity of the zona pellucida using a polarized microscope; cell viability by the Dead-Live technique; and embryo development (cleavage, production and hatching rate) by in vitro fertilization and parthenogenetic activation. There was no difference in capacity of nuclear maturation between fresh and thawed oocytes (p=0.23). Regarding the zona pellucida (ZP), all oocytes (100%) of all three groups (control, CRYO-IVM and IVMCRYO) presented a positive ZP reading, with no correlation with later embryo evolution. DEAD-LIVE analysis of cell viability revealed reduction of viability in the IVM-CRYO group (27%) compared to control (84%) (p<0.0001) and to the CRYO-IVM group (56%) (p=0.017), with no difference between the last two groups (p=0.055). Analysis of the potential for embryo development by means of in vitro fertilization showed that the control group presented better cleavage and blastocyst formation rates than the CRYO-IVM (p<0.0001 and p<0.0001, respectively) and the IVM-CRYO (p<0.0001 and p=0.0004, respectively) groups. Analyzing the potential for embryo development the control group presented better cleavage by means of in vitro fertilization (80%) and parthenogenetic activation (58%) than the CRYOIVM (28%; p<0,0001; 28%; p=0,0002, respectively) and the IVM-CRYO groups (26%; p<0,0001; 22%, p<0,0001,respectively) Analysis of blastocyst formation rates and hatching after FIV and AT in CRYO-IVM and IVM-CRYO groups were null. Vitrification of bovine oocytes causes great impairment of their reproductive capacity regardless of the stage of maturation at the time of freezing. However the vitrified immature oocytes submitted to IVM maintained their capacity of nuclear maturation, as they achieved MII stage. This study was not able to determine which stage was better in reducing crio damage, as both stages (VG and MII) presented equally impaired by the process.

Introdução. A criopreservação de oócitos é importante, tanto para a tentativa de preservação da fertilidade feminina, como nos tratamentos de reprodução assistida. Hipotetizamos que novas formulações de meios crioprotetores, contendo biomoléculas que participam da estrutura e funcionalidade celular, em particular da função mitocondrial e da dinâmica do sistema de membranas, poderiam melhorar a criotolerância e segurança da vitrificação. Objetivos. Este estudo teve como objetivo investigar os efeitos do meio padrão de vitrificação (T4) e T4 suplementado com L-carnitina (LC), LC-ácidos graxos (T4-AG) e LC-AGfosfatidilcolina (T4-PC) sobre a sobrevida e qualidade de oócitos criopreservados, mensurada por parâmetros do desenvolvimento in vitro de embriões, como número de núcleos totais (NT), de células na massa celular interna (MCI) e trofectoderma (TE) dos blastocistos oriundos de oócitos vitrificados nestes meios, assim como sobre os padrões de atividade mitocondrial oocitária. Materiais e métodos. Estudo experimental usando o camundongo da cepa C57BL/6 como modelo. Oócitos maturados in vivo, foram distribuídos em 5 grupos: controle a fresco (CT) e 4 grupos vitrificados: T4, T4-LC, T4-AG e T4-PC. Após a desvitrificação, foi analisada a sobrevida oocitária e os oócitos viáveis foram submetidos a fertilização in vitro ou utilizados para análise da atividade mitocondrial, por meio da análise de espécies reativas de oxigênio (EROs) intracelular por Intensidade de Fluorescência emitida pelo diacetato de 2,7- diclorodihidrofluoresceína, metabolismo oxidativo pela autofluorescência de dois fluoróforos endógenos [dinucleótideo de flavina adenina oxidado e o dinucleotideo reduzido de nicotinamida adenina (fosfato)] e potencial de membrana mitocondrial por Intensidade de Fluorescência (IF) emitida pelo JC1. Os oócitos dos 5 grupos submetidos a FIV foram cultivados por 96 horas, sendo comparados entre os grupos: taxa de fertilização e formação de blastocisto, assim como o número de NT, células MCI e TE e tamanho dos blastocistos. Resultados. A taxa de sobrevivência dos oócitos vitrificados em T4 foi superior a dos demais grupos T4-LC, T4-AG e T4-PC (respectivamente 100%, 97,07%, 96,75% e 97,95%). A taxa de fertilização do grupo CT (77,5%) foi superior a dos grupos T4, T4-LC e T4-PC, não diferindo do grupo T4-AG. Não foram evidenciadas diferenças estatisticamente significativas nas taxas de formação de blastocistos entre os grupos CT, T4, T4-LC, T4-AG e T4-PC (58,07%, 48,05%, 47,44%, 57,89% e 51,06%,respectivamente). Comparando-se o número NT e de células do TE dos blastocistos, observou-se que o os valores do grupo controle foram maiores do que o dos outros 4 grupos, que não apresentaram diferenças entre si. O número de células da MCI dos blastocistos do grupo controle foi superior ao dos grupos T4 e T4-LC e similar ao dos grupos T4-AG e T4- PC. Para o perfil de atividade mitocondrial, foram analisados 15 oócitos/grupo. Os níveis de EROs foram maiores no grupo CT comparado ao grupo T4 e menor quando comparado aos grupos T4-LC e T4-AG, mas sem diferença significativa em relação ao grupo T4-PC. Para Resumo analise do estado redox, o grupo CT teve maiores valores do que a dos grupos T4, T4-LC e T4- AG e o grupo T4-PC foi maior do que a dos outros quatro grupos. Para o potencial de membrana mitocondrial, o grupo CT teve maiores valores do que a do grupo T4-LC, menor do que a do grupo T4 e sem diferença estatisticamente significativa com a dos grupos T4-AG e T4-PC. Conclusão. O número de NT, células do TE e tamanho do blastocistos foram inferiores nos grupos vitrificados/desvitrificados em meio padrão e suplementados comparados ao controle. Porém, o número de células da MCI não foi diferente entre o grupo controle e os vitrificados T4- AG e T4-PC, sugerindo que a suplementação dos meios padrão com LC, AG e PC possa melhorar a competência do oócito e a subsequente qualidade embrionária, o que precisa ser melhor investigado antes da aplicação clínica dos novos meios. Apesar dos oócitos vitrificados no meio T4 terem apresentado taxa de sobrevivência estatisticamente superior a dos demais grupos, sugerimos que estas diferenças não apresentariam potencial relevância clínica. Os resultados de atividade mitocondrial revelam que há uma diferença importante entre oócitos controle e vitrificados com ou sem suplementos na eficiência da função mitocondrial, regulação do estado redox e controle intracelular das EROs, demonstrando que mais trabalhos são necessários para entender esta via metabólica e os diferentes efeitos dos meios de vitrificação. / Introduction. Cryopreservation of oocytes is important, both for the attempt to preserve female fertility and for assisted reproduction treatments. We hypothesize that novel cryoprotective formulations containing biomolecules that participate in cellular structure and functionality, particularly mitochondrial function and membrane system dynamics, could improve cryotolerance and safety of vitrification. Objeticve. The objective of this study was to investigate the effects of the standard vitrification medium (T4) and T4 supplemented with L-carnitine (LC), LC-fatty acids (T4-AG) and LC-AGphosphatidylcholine (T4-PC) on survival and quality of cryopreserved oocytes, measured by in vitro embryo development parameters, such as number of total nuclei (NT), cells in the internal cell mass (ICM) and trophoectoderma (TE) of the blastocysts derived from vitrified oocytes in these media, as well as on the patterns of oocyte mitochondrial activity. Materials and methods. Experimental study using the C57BL/6 mouse as a model. Matured in vivo oocytes were distributed into 5 groups: fresh (CT) control and four vitrified groups: T4, T4-LC, T4-AG and T4-PC. After devitrification, oocyte survival was analyzed and viable oocytes were submitted to in vitro fertilization or used for analysis of mitochondrial activity, through the analysis of intracellular reactive oxygen species (ROS) by Fluorescence Intensity emitted by diacetate of 2, 7-dichlorodihydrofluorescein, oxidative metabolism by the autofluorescence of two endogenous fluorophores [oxidized flavin adenine dinucleotide and the reduced dinucleotide of nicotinamide adenine (phosphate)] and mitochondrial membrane potential by Fluorescence Intensity (FI) emitted by JC1. The oocytes of the 5 groups submitted to IVF were cultured for 96 hours, being compared between the groups: fertilization rate and blastocyst formation, as well as number of NT, MCI and TE cells and size of blastocysts. Results. The survival rate of vitrified oocytes in T4 was higher than in the other groups T4-LC, T4-AG and T4-PC (respectively 100%, 97.07%, 96.75% and 97.95%). The fertilization rate of the CT group (77.5%) was higher than that of the T4, T4-LC and T4-PC groups, not differing from the T4-AG group. There were no statistically significant differences in the rates of blastocyst formation between the groups CT, T4, T4-LC, T4-AG and T4-PC (58.07%, 48.05%, 47.44%, 57.89% and 51.06%, respectively). Comparing the NT and TE cells of the blastocysts, it was observed that the values of the control group were higher than that of the other 4 groups, which did not present differences between them. The number of MCI cells from the blastocysts of the control group was higher than that of the T4 and T4-LC groups and similar to that of the T4-AG and T4-PC groups. For the mitochondrial activity profile, 15 oocytes/group were analysed. The levels of EROs were higher in the CT group compared to the T4 group and lower when compared to the T4-LC and T4-AG groups, but without significant difference in relation to the T4-PC group. For the analysis of the redox state, the CT group had higher values than the T4, T4-LC and T4-AG groups and the T4-PC group was higher than the other four groups. For the mitochondrial membrane potential, the CT group had higher values than the T4-LC group, lower than the T4 group and without a statistically significant difference with the T4-AG and T4-PC groups. Conclusion. The number of NT, TE cells and blastocyst size were lower in the vitrified/devitrified groups in standard medium and supplemented compared to control. However, the MCI cell number was not different between the control group and the vitrified T4-AG and T4-PC, suggesting that the supplementation of the standard media with LC, GA and CP could improve oocyte competence and subsequent embryo quality, which needs to be better investigated before the clinical application of the new media. Although vitrified oocytes in the T4 medium had a statistically higher survival rate than the other groups, we suggested that these differences would not present potential clinical relevance. The results of mitochondrial activity reveal that there is an important difference between control and vitrified oocytes with or without supplements in the efficiency of mitochondrial function, regulation of the redox state and intracellular control of ROS, demonstrating that more work is needed to understand this metabolic pathway and the different effects of the vitrification media.