Orientador: Celso Eduardo Benedetti / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-17T23:36:50Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Domingues_MarianeNoronha_D.pdf: 24489370 bytes, checksum: 8029060db192a79e81b19764465f2ca7 (MD5) Previous issue date: 2011 / Resumo: O cancro cítrico, causado pelo fitopatógeno Xanthomonas axonopodis pv. citri (Xac), constitui uma doença que afeta a maioria das espécies do gênero Citrus ocorrendo praticamente em todos os continentes e se destaca como uma ameaça à citricultura brasileira. A bactéria utiliza a proteína efetora do tipo III PthA para modular a transcrição na planta hospedeira e promover o desenvolvimento dos sintomas da doença. PthA pertence a família AvrBs3/PthA e contém um domínio central de repetições de 34 aminoácidos que media interações proteína-proteína e proteína-DNA. Elucidar como a PthA ativa a transcrição é de grande importância para o esclarecimento do seu modo de ação e da patogenicidade de Xac. Este trabalho teve como principal objetivo confirmar in vivo e in vitro interações entre PthA de Xac e proteínas de laranja doce selecionadas num screening de duplo-híbrido em leveduras. Além da interação com a proteína ?-importina, conhecida por mediar a importação nuclear de AvrBs3, são descritas neste trabalho interações de PthA com proteínas de citros envolvidas no enovelamento e ubiquitinação do tipo K63. PthAs 2 e 3 interagem preferencialmente com uma ciclofilina (Cyp) de citros e com TDX, uma proteína que contém um domínio tetratricopeptídeo (TPR) e um domínio tiorredoxina (TRX). Constatou-se que PthAs 2 e 3, e não 1 e 4, interagem com um complexo de conjugação a ubiquitina formado por Ubc13 e uma enzima de conjugação a ubiquitina variante (Uev) requerido para o processo de ubiquitinação K63 e no reparo de DNA lesionado. Cyp, TDX e Uev interagem entre si e as proteínas Cyp e Uev estão localizadas no núcleo de células de planta, assim como as variantes de PthA de Xac. Além disso, Ubc13 e Uev complementam o fenótipo de reparo no DNA de cepas de leveduras mutantes, indicando que estão envolvidas em processos de ubiquitinação K63 e reparo no DNA. Como PthA2 afetou o crescimento de cepas de levedura na presença de um agente alquilante do DNA, sugere-se que PthA2 inibe ubiquitinação K63 requerida em vias de reparo aos danos no DNA, e não é alvo deste processo como acreditava-se inicialmente. A proteína Cyp de citros também foi capaz de complementar o fenótipo de leveduras mutantes na maquinaria transcricional, de tal forma que PthAs poderiam aumentar as taxas de transcrição através da modulação da atividade de um complexo proteico associado com controle da transcrição / Abstract: Citrus canker, caused by the pathogen Xanthomonas axonopodis pv. citri (Xac), is a disease that affect most species of the genus Citrus occurring in virtually every continent, and stands as a threat to the Brazilian citrus industry. The bacterium uses a type III effector protein PthA to modulate transcription in the host plant and promote the development of disease symptoms. PthA proteins belong to the AvrBs3/PthA family and carry a domain comprising tandem repeats of 34 amino acids that mediates protein-protein and protein-DNA interactions. Elucidate how PthA activates transcription is of great importance for the elucidation of its mode of action and pathogenicity of Xac. This study aimed to confirm in vivo and in vitro interactions between Xac protein PthA and sweet orange proteins in a yeast two-hybrid screening. Here, in addition to the interaction with the ?- importin protein, known to mediate the nuclear import of AvrBs3, we described new interactions of PthAs with citrus proteins involved in folding and K63-linked ubiquitination. PthAs 2 and 3 preferentially interact with a citrus cyclophilin (Cyp) and with TDX, a tetratricopeptide domaincontaining thioredoxin. It was found that PthAs 2 and 3, but not 1 and 4, interact with the ubiquitinconjugating enzyme complex formed by Ubc13 and ubiquitin-conjugating enzyme variant (Uev), required for K63-linked ubiquitination and DNA repair. We show that Cyp, TDX and Uev interact with each other, and that Cyp and Uev localize to the nucleus of plant cells. Furthermore, the citrus Ubc13 and Uev proteins complement the DNA repair phenotype of the yeast mutants, strongly indicating that they are also involved in K63-linked ubiquitination and DNA repair. How PthA2 affected the growth of yeast cells in the presence of a DNA damage agent, suggests that PthA2 inhibits K63-linked ubiquitination required for DNA repair, and is not the target of this process as it was believed initially. The citrus protein Cyp was also able to complement the phenotype of yeast mutants in the transcriptional machinery, such that PthAs could increase the rates of transcription by modulating the activity of a protein complex associated with control of transcription / Doutorado / Bioquimica / Doutor em Biologia Funcional e Molecular

Orientador: Ljubica Tasic / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Quimica / Made available in DSpace on 2018-08-09T16:14:23Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Lopes_ThaisPereira_M.pdf: 827343 bytes, checksum: a4f6f9404835341a96ecd4f5ca467c69 (MD5) Previous issue date: 2007 / Resumo: A bactéria gram-negativa Xanthomonas axonopodis pv. citri (Xac) é responsável pelo cancro cítrico, uma doença de grande importância econômica em todo o mundo. Seus mecanismos de virulência ainda são pouco conhecidos, mas acredita-se que o processo de translocação das proteínas de virulência para a célula da planta hospedeira seja realizado por meio dos sistemas de secreção, principalmente do tipo III e hipoteticamente do tipo IV, onde se destaca o papel das chaperones secretórias. O alvo do nosso estudo é uma proteína hipotética, a XACb0032, que em ensaios de duplo híbrido, apresentou interação com a também hipotética XACb0033 anteriormente indicada como possível chaperone do sistema secretório tipo IV (TTFS). Ambas as proteínas hipotéticas são codificadas pelo locus virB do plasmídeo pXAC64. Os estudos estruturais apresentados iniciaram-se com a clonagem em pET23a, seguidos de testes de expressão desta proteína utilizando cepas de Escherichia coli, BL21(DE3)pLysS e RP códon plus. A expressão da XACb0032 foi bem sucedida utilizando a cepa RP códon plus. Os problemas encontrados para purificar a insolúvel XACb0032 foram resolvidos utilizando a sua co-expressão com a XACb0033. Após dois passos de purificação, obtivemos o complexo das proteínas (XACb0032/XACb0033) puro e em quantidades satisfatórias para análises espectroscópicas. O complexo destas proteínas foi analisado por dicroismo circular (CD), emissão de fluorescência (estática e dinâmica), ressonância magnética nuclear (RMN) e espalhamento de raios-X a baixo ângulo (SAXS). Todos os dados obtidos indicaram que o complexo purificado exibe a estrutura enovelada e que após a adição de adenosina difosfato (ADP) ocorre uma mudança evidente na sua forma e no seu tamanho, indicando uma possível quebra do complexo XACb0032/XACb0033 após a liberação de ADP na célula. Portanto, podemos supor que o sistema de secreção do tipo IV deve funcionar da seguinte maneira: 1. Ligação da chaperone XACb0033 à XACb0032 mantendo-a em uma conformação semi-desenovelada; 2. Ligação do complexo ao ATP; 3. Reconhecimento do sistema ATP + complexo pelo TTFS, logo a ATPase cliva o ATP; 4. Formação do ADP e sua presença promove a dissociação da XACb0032 do complexo; 5. Possível secreção da proteína alvo, ou seja, a XACb0032 poderia passar através do canal de secreção até atingir a célula eucariótica / Abstract: Xanthomonas axonopodis pv. citri (Xac) is the causative agent of citrus canker, a disease of significant economic importance worldwide. The molecular bases of the virulence mechanism are still unknown, but is believed that transfer of bacterial virulence proteins directly into the host cell cytoplasm is mediated by protein secretion systems, mainly type III and hypotheticaly type IV. The target of our study was XACb0032. This protein, in two hibrid system, interacted with XACb0033, a protein previously annoted as a possible cytoplasmatic chaperone of type four secretion system (TFSS). Both proteins are hypothetic and encoded by virB locus on pXAC64 plasmid. Structural studies were initiated by pET23a cloning; followed by expression tests with Escherichia coli strands BL21(DE3)pLysS and RP. The XACb0032 RP-expression was successful, however, the protein was insoluble. This problem was solved with its co-expression with XACb0033. After two purification steps, the pure protein complex has been analysed by following spectroscopic methods: circular dichroism (CD), fluorescence emission (static and dinamic), nuclear magnetic ressonance (NMR) and small angle X-ray scattering (SAXS). Our results indicate that the complex shows a folded structure and that after ADP addition, a drastic change occured in the complex size and shape, that might indicate complex breaking upon ADP production in cell. Based on these observations, we can provide the following model for TFSS pathway concerning these proteins: 1. The chaperone (XACb0033) binds to the XACb0032 to keep it in a semiunfolded conformation; 2. This complex binds with ATP; 3. ATP bound to complex docks onto the TFSS apparatus and ATPase hydrolysis ATP; 4. ADP is formed and its presence provides that XACb0032 protein dissociates from complex; 5. The XACb0032 could be able to pass through the needle into the eukaryotic cell / Mestrado / Quimica Organica / Mestre em Química

A captação de maltose em bactérias é feita por um sistema transportador do tipo ABC composto por uma proteína ligadora de substrato (MalE), duas proteínas transmembrana e uma ATPase. No presente trabalho descrevemos a clonagem, expressão e análise bioquímica e estrutural da proteína MalE da bactéria fitopatogênica Xanthomonas axonopodis pv citri (Xac) O gene malE de Xac foi clonado em vetor de expressão pET28a, a proteína recombinante foi expressa em Escherichia coli e purificada por cromatografia de afinidade ao níquel. Amostras da proteína solúvel foram analisadas quanto à estrutura secundária, interação com possíveis ligantes, estabilidade frente a diferentes condições físico-químicas. Ensaios de cristalização possibilitaram a obtenção de cristais em diferentes condições, um deles apresentou grupo espacial P6122, mas não foi possível resolver a estrutura. Com base nas estruturas conhecidas de ortólogos de MalE, geramos um modelo estrutural para a proteína de Xac e foram feitas análises quanto à interação com trealose e maltose. Modelos estruturais dos componentes transmembrana (LacF e LacG) e ATPase (UgpC) do sistema transportador de maltose de Xac também foram gerados. Os resultados representam uma contribuição importante para o conhecimento sobre a fisiologia e sistemas de transporte de Xac. / Maltose uptake in bacteria is mediated by an ABC transporter comprising a substrate binding protein (MalE), two transmembrane proteins, and one ATPase. In the present study, we describe the cloning, expression and biochemical as well as structural analyses of the MalE protein of the phytopagen Xanthomonas axonopodis pv citri (Xac). The malE gene of Xac was cloned in the pET28a expression vector, the recombinant protein was expressed in Escherichia coli and, subsequently, purified by nickel affinity chromatography. Samples of soluble protein were analyzed regarding secondary structure, interaction with putative ligants and stability under different physico-chemical conditions. Crystallization trials were carried out under different conditions, one particular condition yielded crystal with a P6122space group, but the structure was not solved. Based on known ortholog structures, a structural model for Xac MalE was obtained allowing interaction with modeled threhalose and maltose. Structural models the transmembrane (LacF and LacG) and ATPase (UgpC) components were also obtained. The present results represent an important contribution to the knowledge of the physiology and transporter systems found in Xac.

Orientador: Ljubica Tasic / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Química / Made available in DSpace on 2018-08-19T07:18:19Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Fattori_Juliana_D.pdf: 11382370 bytes, checksum: c763644c24af47a0076a054c0186f7b1 (MD5) Previous issue date: 2011 / Resumo: O presente estudo teve por objetivo a caracterização estrutural de quatro possíveis chaperonas de secreção da bactéria Xanthomonas axonopodis pv. citri (Xac). Esta caracterização é importante para entender as funções destas proteínas e consequentemente compreender os mecanismos de virulência da Xac que é a causadora do cancro cítrico. Das quatro proteínas estudadas, a XACb0033 é considerada uma possível chaperona de secreção do sistema de secreção do tipo IV; a XAC1346 são possíveis chaperonas de secreção do sistema de secreção do tipo III e a XAC1990, foi identificada em 2007 como uma proteína do sistema flagelar (FlgN). As quatro proteínas, clonadas em pET23a, foram expressas em E. coli, purificadas e obtidas enoveladas conforme as análises de dicroísmo circular (CD). Por CD também se observou um alto conteúdo helicoidal na estrutura secundária das proteínas. Elas foram caracterizadas por filtração em gel analítica, espectrometria de massas, técnicas de difusão de ressonância magnética nuclear (DOSY-NMR) e espalhamento de raios-X a baixo ângulo (SAXS). Por SAXS obteve-se um modelo do envelope molecular de duas proteínas que foi condizente com a estrutura tridimensional obtida por bioinformática. Baseando-se nos resultados obtidos foi possível especular a classificação da XAC0419 como provável chaperona secretória da classe I e a FlgN (XAC1990) foi classificada como uma chaperona flagelar (classe III); e para a XACb0033 observou-se similaridade estrutural com a VirE1, que é a única chaperona secretória do sistema de secreção do tipo IV conhecida até o momento / Abstract: The aim of this study was the structural characterization of four possible secretion chaperones from the bacterium Xanthomonas axonopodis pv. citri (Xac). This characterization is very important to better understand the function of such proteins and the virulence mechanisms from Xac, which is the bacterium responsible for provoking the citrus canker. Among the target proteins, XACb0033 is a possible secretion chaperone from type IV secretion system, XAC0419 and XAC1346 are possible secretion chaperones from type III secretion system and XAC1990 was earlier identified as a flagellar protein (FlgN). All four target proteins, cloned into pET23a, were expressed in E. coli, purified and found folded as observed in the circular dichroism analyses (CD). It was also verified (CD experiments) that these proteins have a high helical content. These proteins were further characterized by analytical gel filtration, mass spectrometry (MS), diffusion techniques in nuclear magnetic resonance (DOSY-NMR) and small angle X-ray scattering (SAXS). Molecular envelops were built for two target proteins applying the SAXS data. These envelops were in good agreement with the 3D structures predicted by bioinformatics. Finally, XAC0419 was considered a possible class I secretion chaperone based on the obteined results. XAC1990 (FlgN) was confirmed as a flagellar chaperone (class III), while obtained results for XACb0033 pointed structural similarity with VirE1, the unique type IV secretion system chaperone known so far / Doutorado / Quimica Organica / Doutor em Ciências

Orientador: Ljubica Tasic / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Química / Made available in DSpace on 2018-08-20T16:55:17Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Prando_Alessandra_D.pdf: 9977861 bytes, checksum: 15d25bce7d95433f95b938e68fdeaac8 (MD5) Previous issue date: 2012 / Resumo: Até o momento, pouco se sabe sobre os mecanismos de virulência da bactéria Xanthomonas axonopodis pv. citri (XAC), agente causador do cancro cítrico. Acredita-se que chaperonas de secreção (CS) estão envolvidas no processo de patogenicidade de XAC primeiramente formando complexos com fatores de virulência e auxiliando no encaminhamento desses para os sistemas de secreção utilizando o ATP como fonte de energia. Neste trabalho foram adquiridos dados de fluorescência de emissão, dicroísmo circular, desenovelamento térmico e de ressonância magnética nuclear de H NMR e de 2D {N,H} HSQC de duas proteínas da XAC, a XAC1990 (FlgN) e XACb0033. Para ambas proteínas foram propostas estruturas 3D usando a análise de footprinting com restrições SASA e rmsd. Para as estruturas propostas foi verificado que os dados de fluorescência corroboram com a estrutura 3D não ocorrendo o mesmo para os dados de CD e NMR que revelaram baixo conteúdo helicoidal além de ausência de estrutura 3 D. A interação da proteína FlgN com a sua proteína parceira FlgK também foi sugerida através das análises de CD e fluorescência. Na segunda parte do trabalho foram estudadas as interações entre a proteína Hsp90 da laranja com diferentes ligantes aplicando a técnica de Saturation Transfer Difference (STD-NMR) e espectroscopia de fluorescência. Estas análises revelaram dados que corroboraram com o modelo proposto e, além disso, indicaram que os hidrogênios H-8 e H-2 da adenina e H-1'da ribose estão localizados no sítio ligante da proteína com os fosfatos orientados para fora. Através da fluorescência foram calculados os valores de Kd e foi verificado que a geldanamicina é um potente inibidor de Hsp90 da laranja / Abstract: So far, the Xanthomonas axonopodis pv. citri (XAC) mechanisms of bacterial virulence is unknown. It is believed that secretion chaperones (CS) are involved in the XAC's virulence process by first forming complexes with virulence factors, and assisting in their presentation to corresponding secretion systems using ATP as a source of energy. Fluorescence emission, circular dichroism, thermal unfolding and nuclear magnetic resonance NMR H and 2D {N,H} HSQC data from two proteins of XAC, XAC1990 (FlgN) and XACb0033 were collected. For both proteins, 3D structures were proposed using the footprinting analysis with RMSD and SASA restrictions. For the proposed structures were verified which the fluorescence data were consistent with the 3D structure. The CD and NMR data revealed low-helical content and absence of 3D structure. The interaction of the protein FlgN with its partner, FlgK, was suggested by CD and fluorescence analysis. In the second part, the interactions between the orange's Hsp90 protein with different ligants using Saturation Transfer Difference (STD-NMR) and fluorescence spectroscopy techniques were studied. These analyzes revealed which the data were consistent with the proposed model and moreover showed that the adenine's hydrogens H-8 and H-2 and ribose's hydrogen H-1'are located in the protein binding site with the phosphate driven out. By fluorescence values were calculed Kd and it was verified that geldanamycin is a potent inhibitor of orange's Hsp90 / Doutorado / Quimica Organica / Doutor em Ciências

Submitted by Caroline Xavier (caroline.xavier@pucrs.br) on 2017-06-30T17:30:00Z No. of bitstreams: 1 DIS_JULIANA_LOPES_HORSTMANN_COMPLETO.pdf: 1711527 bytes, checksum: 7681ac709a014d574046b6207b8a9728 (MD5) / Approved for entry into archive by Caroline Xavier (caroline.xavier@pucrs.br) on 2017-06-30T17:30:08Z (GMT) No. of bitstreams: 1 DIS_JULIANA_LOPES_HORSTMANN_COMPLETO.pdf: 1711527 bytes, checksum: 7681ac709a014d574046b6207b8a9728 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-06-30T17:30:17Z (GMT). No. of bitstreams: 1 DIS_JULIANA_LOPES_HORSTMANN_COMPLETO.pdf: 1711527 bytes, checksum: 7681ac709a014d574046b6207b8a9728 (MD5) Previous issue date: 2017-03-31 / Coordena??o de Aperfei?oamento de Pessoal de N?vel Superior - CAPES / The plant growth promoting rhizobacteria (PGPR) can increase agricultural productivity by promoting growth through production of plant hormones, facilitating the uptake of nutrients and chemicals on the soil, as well as inhibiting plant stress factors. Streptomyces spp. (Stm) are bacteria with great biotechnological potential, because in addition to its growth promotion and plant defense induction, they are also known as great producers of secondary metabolites, including antibiotics and phenazines. Soybean [Glycine max (L) Merrill] is one of the main legume crop grown around the world and Brazil is the second largest producer. Its production is affected by many diseases, among which bacterial pustule caused by the pathogen Xanthomonas axonopodis pv. glycines (Xag). The objective of this project was to evaluate isolates of Streptomyces spp. obtained from the rhizosphere of Fabaceae plants regarding characteristics of PGPR, as well as the modulation capacity of soybean defenses in response to the phytopathogen Xag. Eleven isolates of Streptomyces spp. were screened for PGPR traits by siderophores production, 1-aminocyclopropane-1-carboxylate (ACC) deaminase, indole-3-acetic acid (IAA) and phenazines. For a taxonomic identification and growth evaluation of soybean plants, three isolates were selected for their biochemical characteristics. The growth promoting assay was performed in greenhouse using bacterized seeds with the selected isolate and sterile distilled water was use for the control. Length, fresh and dry weight from shoot and root at 15, 30 and 45 days of cultivation were the evaluated parameters. For evaluation of the induction capacity of defense mechanisms of soybean plants, the isolate that obtained the best performance in the growth promotion test was selected. Seeds of soybeans, from sensitive cultivars and resistant to Xag, were bacterized with the selected Stm isolate and grown under greenhouse conditions. The plants were challenged with Xag 15 days after emergence. The treatments consisted of (a) plants treated with sterile distilled water (absolute control); (b) plants bacterized with Stm CLV45 (Stm45); (c) water-treated and Xag challenged plants; and (d) plants bacterized with StmCLV45 and challenged with Xag (Stm45+Xag). The enzymatic responses related to the defense pathways were evaluated biochemically, by analyzing the activity of phenylalanine ammonia lyase (PAL) and by the production of phenolic compounds at times 0, 24, 48, 72 and 144 hours post infection (hpi) of Xag. The expression of the genes related to the defense in Xag challenged soybean plants was determined by the relative expression of the genes PAL, JAZ, ERF5 and PR1 by qPCR at times 0, 12, 24 and 48 hpi. The results of the biochemical analysis indicated the isolates CLV42, CLV44 and CLV46 as the major producers of siderophores and CLV41, CLV45 and CLV46 isolates with higher ACC deaminase activity. All isolates were able to produce IAA, highlighting the isolate CLV45, which produced 398.53 ?g AIA g-1 cell. Phenazine pyocyanin (PYO) was also detected in all isolates, but the same did not occur for the 1-carboxylic acid phenazine (PCA), only produced by CLV41, CLV43 and CLV45. The isolates CLV42, CLV44 and CLV45 were selected for their PGPR characteristics for the growth promotion trial of greenhouse soybean plants and taxonomically characterized as species of the genus Streptomyces. None of the isolates evaluated in the trial caused a growth deficit in soybean plants. The CLV45 isolate significantly promoted the growth of soybean shoots in 36.63%, corroborated by the highest dry mass, 17.97%, in relation to the control group, being selected for soybean defense pathways induction. Expression of PAL gene was moderately enhanced in susceptible Stm45+Xag plants at 12 hpi, followed by increase of PAL enzyme activity from 48 to 144 hpi, although corresponding accumulation of phenolic compounds was not recorded. In the resistant cultivar, the highlighted expression of PAL in Stm45+Xag plants resulted in high activity of this enzyme. Enhanced expression of ERF5 and decrease on JAZ gene at 12 hpi in Stm45+Xag plants from both cultivars suggested that ET and JA play a concert role on induced systemic defense by Streptomyces sp. CLV45 against Xag in soybean. / As rizobact?rias promotoras de crescimento de plantas (PGPR) podem aumentar a produtividade agr?cola, atuando atrav?s da promo??o de crescimento vegetal por meio de fitorm?nios reguladores de crescimento, facilitando a capta??o de nutrientes e de compostos qu?micos no solo, bem como inibindo fatores de estresse vegetal. Bact?rias do g?nero Streptomyces spp. (Stm) apresentam grande potencial biotecnol?gico, pois al?m de promoverem o crescimento e a indu??o de defesa vegetal, tamb?m s?o conhecidas pela grande produ??o de metab?litos secund?rios, incluindo antibi?ticos e fenazinas. A soja [Glycine max (L.) Merrill] ? uma das principais leguminosas cultivadas no mundo, sendo o Brasil o segundo maior produtor. Sua produ??o ? afetada por in?meras doen?as, como a P?stula bacteriana causada pelo fitopat?geno Xanthomonas axonopodis pv. glycines (Xag). O objetivo deste trabalho foi avaliar 11 isolados de Streptomyces spp. oriundos da rizosfera de plantas de Fabaceae quanto ?s caracter?sticas de PGPR, bem como, ? capacidade de modula??o das vias de defesa de plantas de soja em resposta ? fitobact?ria patog?nica Xag. Os isolados foram avaliados quanto ?s caracter?sticas de PGPR pela produ??o de sider?foros, de ?cido indolac?tico (AIA), da enzima 1-aminociclopropano-1-?cido carbox?lico (ACC) desaminase e de fenazinas. Para a identifica??o taxon?mica e a avalia??o da promo??o de crescimento de plantas de soja foram selecionados tr?s isolados com caracter?sticas de PGPR. O ensaio de promo??o de crescimento ocorreu em casa de vegeta??o por meio da microbioliza??o das sementes pelos isolados selecionados e o controle com ?gua destilada est?ril. Os par?metros avaliados foram: comprimento, massa fresca e seca, de parte a?rea e raiz, aos 15, 30 e 45 dias de cultivo. Para a avalia??o da capacidade de indu??o dos mecanismos de defesa de plantas de soja, foi selecionado o isolado que obteve o melhor desempenho no ensaio de promo??o de crescimento. Sementes de soja, de cultivar sens?vel e resistente ? Xag, foram microbiolizadas com o isolado de Stm selecionado e cultivadas em casa de vegeta??o. As plantas obtidas foram desafiadas com Xag, 15 dias ap?s a sua emerg?ncia. Os tratamentos consistiram de (a) sementes tratadas com ?gua destilada est?ril (controle absoluto); (b) sementes microbiolizadas com StmCLV45 (Stm45); (c) sementes tratadas com ?gua destilada est?ril e plantas desafiadas com Xag (Xag); e (d) sementes microbiolizadas StmCLV45 e plantas desafiadas com Xag (Stm45+Xag). As respostas enzim?ticas relacionadas ?s vias de defesa foram avaliadas bioquimicamente, pela an?lise da atividade da fenilalanina am?nia liase (PAL) e pela produ??o dos compostos fen?licos, nos tempos 0, 24, 48, 72 e 144 horas p?s inocula??o (hpi) da Xag. A express?o dos genes relacionados ? defesa das plantas de soja desafiadas com Xag foi determinada pela express?o relativa de JAZ, ERF5, PAL e PR1 por qPCR, nos tempos 0, 12, 24 e 48 hpi. Os resultados da an?lise bioqu?mica indicaram os isolados CLV42, CLV44 e CLV46 como maiores produtores de sider?foros e os isolados CLV41, CLV45 e CLV46 com maior atividade de ACC desaminase. Todos os isolados foram capazes de produzir AIA, com destaque para o isolado CLV45, que produziu 398,53 ?g AIA g-1 de c?lulas. A fenazina piocianina (PYO) tamb?m foi detectada em todos os isolados, entretanto o mesmo n?o ocorreu para a fenazina 1-?cido carbox?lico (PCA), somente produzida por CLV41, CLV43 e CLV45. Os isolados CLV42, CLV44 e CLV45 foram selecionados por suas caracter?sticas de PGPR para o ensaio de promo??o do crescimento de plantas de soja em casa de vegeta??o e caracterizados taxonomicamente como esp?cies do g?nero Streptomyces. Nenhum dos isolados avaliados no ensaio causou d?ficit de crescimento em plantas de soja. O isolado CLV45 promoveu significativamente o crescimento de parte a?rea de plantas soja, em 36,63%, corroborado pela maior massa seca, 17,97%, em rela??o ao grupo controle, sendo selecionado para avalia??o nas vias de defesa da soja. A express?o do gene PAL foi moderadamente aumentada em plantas suscet?veis Stm45+Xag em 12 hpi, seguido por aumento da atividade da enzima PAL de 48 a 144 hpi, embora o ac?mulo correspondente de compostos fen?licos n?o tenha sido registrado. Na cultivar resistente, a express?o de PAL em plantas Stm45+Xag resultou em alta atividade desta enzima. A express?o aumentada de ERF5 e a diminui??o de express?o do gene JAZ em 12 hpi em plantas Stm45+Xag de ambas as cultivares sugeriram que etileno e ?cido jasm?nico desempenharam fun??o na defesa sist?mica induzida por Streptomyces sp. CLV45 contra Xag em plantas de soja.

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:31:00Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2006-04-28Bitstream added on 2014-06-13T20:21:38Z : No. of bitstreams: 1 teixeira_ec_dr_araiq.pdf: 2441746 bytes, checksum: 6a8b98becf92d1426314457c9b30825c (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / O presente trabalho teve como principal objetivo realizar estudos funcionais na bactéria Xac, estudando o possível envolvimento dos genes copA, copB e cutC no mecanismo de resistência a cobre nesta bactéria. Estes estudos funcionais envolveram: análise da expressão dos genes durante o crescimento na presença de cobre por Northern e Western blots e por eletroforese bi-dimensional, produção e purificação das proteínas recombinantes e produção de anticorpos, inativação de um dos genes (copA) para avaliar a participação da proteína CopA no mecanismo de resistência a cobre e análise da interação das proteínas de resistência a cobre com outras proteínas de Xac através do ensaio de duplo híbrido de leveduras. Os resultados obtidos mostraram que a linhagem mutante infecta a planta, mas os sintomas são mais retardados na presença do metal, quando comparada à linhagem selvagem. O crescimento das células mutantes na ausência e presença de cobre in planta indicou maior sensibilidade ao cobre pelas células mutantes. Na tentativa de verificar se as proteínas CopA, CopB e CutC interagem com outras proteínas de Xac, um ensaio de duplo híbrido de leveduras foi realizado. Através deste ensaio, algumas proteínas foram identificadas, as quais necessitam de estudos de caracterização adicionais. / Xanthomonas axonopodis pv. citri (Xac) is the causal agent of the citrus canker, a serious disease that affects the most commercial citrus cultivars causing serious economic impacts. Symptoms include canker lesions, leading to abscission of fruit and leaves and general tree decline. By sequencing the genome of this bacterium (ONSA Network, FAPESP, Brazil), a better knowledge of this microorganism and its molecular interactions with the host might be elucidated. For this, we analyzed the gene expression during growth in the presence of copper by Northern and Western blots, 2D-electrophoresis, production and purification of the CopA, CopB, and CutC recombinant proteins, inactivation of the copA gene to evaluate the participation of CopA protein in the copper resistance mechanism, and protein-protein interactions assays by the yeast two-hybrid assay. Results showed that the mutant strain infects the plant, but the lesions formation was retarded in the presence of copper. The mutant strain showed more sensitivity to copper than the wild type strain during growth in planta. In order to verify whether the CopA, CopB, and CutC proteins interact with other proteins of Xac, a yeast two-hybrid assay was performed. By this assay, some proteins were identified, which need further characterizations.

Orientador: Bruno Ettore Pavan / Resumo: O Feijão comum (Phaseolus vulgaris L.) é uma das principais fontes alimentares no Brasil, agregado tanto por valores culturais como nutricionais. Seu cultivo pode ser encontrado pequenos e grandes produtores, e em diferentes níveis tecnológicos, e se estende por todo o território Nacional. O potencial produtivo do feijoeiro está em muito ligada a sanidade de plantas, tendo os patógenos como os principais responsáveis pelas quedas em produção. O trabalho objetivou verificar a interação genótipo x ambiente, procedendo com a estratificação ambiental de épocas de semeadura afim de recomendar a melhor época que possibilite a discriminação entre os genótipos e a seleção dos genótipos mais adaptados e estáveis em relação ao ataque de Mancha Angular e Crestamento Bacteriano Comum em cerrado de baixa altitude. Os experimentos foram conduzidos no período de: Junho, Agosto, Outubro e Dezembro de 2015 e Março e Abril de 2016, na Fazenda de Ensino, Pesquisa e Extensão da Faculdade de Engenharia de Ilha Solteira (FEIS), situada no município de Selvíria-MS. O delineamento experimental adotado foi em blocos casualizados, onde foram usados 20 genótipos, sendo 5 deles comerciais, IAC – Una, IAC – Imperador, IAC – Formoso, IAC – Milênio, IAC – Alvorada; e 15 provenientes do programa de melhoramento da FEIS. Para a fonte de variação “ambiente” foram utilizadas as seis épocas de semeadura. Os caracteres avaliados foram: incidência de Crestamento Bacteriano Comum e Mancha Angular. Os parâmetros ge... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Common Bean (Phaseolus vulgaris L.) is one of the main food sources in Brazil, aggregated both by cultural and nutritional values. Its cultivation can be found both small and large producers, and at different technological levels, and extends throughout the national territory. The productive potential of the bean plant is closely related to plant health, with pathogens being the main cause of falls in production. The objective of this work was to verify the genotype x environment interaction, proceeding with the environmental stratification of sowing times in order to recommend the best season that allows discrimination between the genotypes and the selection of the most adapted and stable genotypes in relation to the attack of angular spot and blight bacterial in cerrado of low altitude. The experiments were conducted in the period of: June, August, October and December of 2015 and March and April of 2016, in the Fazenda de Ensino, Pesquisa e Extensão da Faculdade de Engenharia de Ilha Solteira (FEIS), located in the municipality of Selvíria-MS . The experimental design was randomized blocks, where 20 genotypes were used, 5 of them commercial, IAC - Una, IAC - Imperador, IAC - Formoso, IAC - Milênio, IAC - Alvorada; and 15 from the FEIS breeding program. For the "environment" variation source, the six sowing times were used. The evaluated characters were: incidence of Bacterial and Angular Spotting. The genetic parameters and variance components were obtained by the REML / B... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:28:36Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2005-06-03Bitstream added on 2014-06-13T18:35:00Z : No. of bitstreams: 1 bonini_m_me_botfca.pdf: 503952 bytes, checksum: 1553a755d247df6ec4852dd6104b7a70 (MD5) / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / Empresa Privada / O presente trabalho teve por objetivo avaliar a produção e a sensibilidade de 48 isolados de Xanthomonas axonopodis pv. citri e de 14 isolados de Xanthomonas spp. à bacteriocinas. Estudos foram realizados para verificar o efeito da temperatura, tempo de incubação e do tipo do meio de cultura sobre a produção de bacteriocina por isolados de X. axonopodis pv. citri. Todos isolados de X. axonopodis pv. citri não foram sensíveis às bacteriocinas produzidas por eles, não sendo essas afetadas pelo meio BDA, nutriente ágar + NaCl e YPDA, nos diferentes tempos e temperaturas de incubação. Porém, isolados de X. axonopodis pv. passiflorae foram sensíveis às bacteriocinas produzidas por 25 isolados de avaliados e o isolado de X. campestri pv. campestris e o de X. axonopodis pv. manihotis apresentaram sensibilidade variável. Dos 25 isolados de X. axonopodis pv. citri apenas cinco não foram inibidos pelas bacteriocinas produzidas por dois isolados de X. axonopodis pv. passiflorae. As bacteriocinas produzidas pelos isolados de X. axonopodis pv. citri (FDC-806) e de X. axonopodis pv. passiflorae (Mar 2850-A) foram termolábeis e resistentes à lisozima e sensíveis a DNAse. A bacteriocina produzida pelo isolado de X. axonopodis pv. passiflorae foi resistente à ação de proteinase K, tripsina e RNAse enquanto que a produzida pelo isolado de X. axonopodis pv. citri foi sensível a essas enzimas. / The objective of this work was to evaluate the production and sensitivity of 48 Xanthomonas axonopodis pv. citri strains and 14 Xanthomonas spp. strains to bacteriocins. A number of studies were carried out to verify the effect of temperature, incubation time, and type of culture medium on bacteriocine yield by X. axonopodis pv. citri strains. None of the X. axonopodis pv. citri strains were sensitive to the bacteriocins produced by themselves, and were not affected by the PDA, nutrient agar + NaCl, and YPDA media, at the different incubation times and temperatures studied. However, X. axonopodis pv. passiflorae and strains were sensitive to the bacteriocins produced by the 25 Xac strains evaluated, while a X. campestri pv. campestris and X. axonopodis pv. manihotis strains showed variable sensitivity. Of the 25 X. axonopodis pv. citri strains, only five were not inhibited by the bacteriocins produced by the two X. axonopodis pv. passiflorae strains. The bacteriocins produced by X. axonopodis pv. citri (FDC-806) and X. axonopodis pv. passiflorae (Mar 2850-A) were thermolabile and resistant to lysozyme and sensitive to DNAse. The bacteriocin produced by the X. axonopodis pv. passiflorae was resistant to the action of proteinase K, trypsin and RNAse, while the bacteriocin produced by the X. axonopodis pv. citri isolate was sensitive to those enzymes.

Submitted by Marco Antônio de Ramos Chagas (mchagas@ufv.br) on 2017-04-24T14:18:22Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 179014 bytes, checksum: 6dc994175521b9e665bebeec3986f34a (MD5) / Made available in DSpace on 2017-04-24T14:18:22Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 179014 bytes, checksum: 6dc994175521b9e665bebeec3986f34a (MD5) Previous issue date: 2003-06-27 / Estudos sobre a patologia de sementes de feijão e a dinâmica temporal de epidemias do crestamento bacteriano comum do feijoeiro foram realizados com o objetivo de melhor conhecer a doença nas condições brasileiras. Em um primeiro estudo avaliou-se a incidência de Xanthomonas axonopodis pv. phaseoli (Xap) em 19 lotes de sementes provenientes, em sua maioria, do Distrito Federal. As sementes foram avaliadas pelos métodos de semeio direto e de inoculação do extrato de sementes em plantas suscetíveis, em duas condições ambientes, casa-de-vegetação e câmara de crescimento (30°C). Em 16 dos 19 lotes avaliados observou-se contaminação com Xap. Os métodos de plantio direto e extrato de sementes foram eficientes e de uso prático em laboratórios de rotina. Em um segundo estudo avaliou-se a transmissão de Xap, das sementes para as plântulas de feijão, em quatro cultivares e uma linhagem de feijão. Estudou-se ainda o efeito da idade de vagens na contaminação das sementes. Ambos os ensaios foram realizados duas vezes. Xap foi transmitida da semente para as plântulas, em todas as cultivares avaliadas. Além disso, com a maturação das vagens, houve redução significativa na produção de sementes sintomáticas. Finalmente, estudou-se a dinâmica temporal de epidemias do crestamento bacteriano comum do feijoeiro, em Viçosa, MG e no Distrito Federal. Foram avaliados os componentes epidemiológicos taxa de progresso, valor máximo de severidade e a área abaixo da curva de progresso da doença. Tentou-se, ainda, correlacionar dados de temperatura, precipitação e umidade aos de severidade da doença no campo. Detectou-se uma relação entre a severidade da doença no campo e a fenologia da cultura de feijão, além da correlação da temperatura, precipitação e a severidade. Porém, a umidade relativa não foi correlacionada aos dados de severidade obtidos. / Seed pathology of beans and temporal dynamics of common halo blight studies were done to better know about the disease in the Brazilian conditions. The first work concerned to the contamination of bean seeds by Xanthomonas axonopodis pv. phaseoli was evaluated in 19 samples from Cerrados Brazilian Savana region, Brazil. Growing- on test and extraction followed by inoculation of suspension in bean susceptible plants were the two techniques used to assess the seeds. Growing-on tests were conducted in two environmental conditions: greenhouse and growing chamber at 30°C. X. axonopodis pv. phaseoli was found in sixteen samples. Seeds were placed in sterilized distilled water for bacterial extraction and the suspension obtained was inoculated in bean susceptible plants. Occurrence of symptoms was observed and the pathogen was detected in 16 samples. In the second work seed transmission of X. axonopodis pv. phaseoli was evaluated in some bean cultivars often used in comercial crops in Brazil. Two assays had been carried out and the results showed high rate of seed transmission of X. axonopodis pv. phaseoli in the cultivars. Rates of transmission ranged from 5,66 to 86,36% according to each cultivar. The effect of phenology of pods in seeds contamination was studied. Results showed that as younger as pods are, higher is the incidence of symptomatic seeds. Finally temporal dynamics of bean halo common blight epidemics were analyzed in two Brazilian locations, Federal District (Cerrados Savanna Region) and Viçosa, MG. Three epidemiological components were compared: disease progress rate (r), maximum intensity of disease (Ymax) and area under the viiidisease progress curve (AUDPC). Among the Gompertz, logistic, and monomolecular models, the monomolecular model fitted better disease severity data over time in Viçosa experiments. Disease severity was related to plant phenology, mean temperature, and rain intensity. However no correlation was found between disease severity and relative humidity. / Tese importada do Alexandria