O ferro é essencial para a sobrevivência das bactérias, estando envolvido em vários processos metabólicos. Apesar de sua baixa solubilidade, as bactérias dispõem de sistemas eficientes e específicos para captação, utilização e armazenamento desse metal, ao mesmo tempo controlando adequadamente a concentração de ferro livre no meio, para evitar seus potenciais efeitos tóxicos. Xylella fastidiosa é uma bactéria gram-negativa que coloniza o xilema de uma diversidade de plantas cultivadas e silvestres em várias partes do mundo, sendo o agente causador de uma série de doenças em plantas economicamente importantes como citros, videiras e café. Alguns mecanismos de virulência de X. fastidiosa já foram elencados, entre esses a formação de biofilme, que promoveria a oclusão do xilema e consequente estresse hídrico para a planta. Postula-se que a captação de ferro por X. fastidiosa, causando redução da concentração desse metal no xilema das plantas infectadas, seja uma das estratégias utilizadas pela bactéria em seu processo de infecção. Nosso objetivo neste trabalho foi de investigar o processo de captação de ferro por X. fastidiosa e avaliar em maior detalhe o efeito da concentração de ferro no crescimento e na expressão de fatores de virulência dessa bactéria, expandindo os estudos anteriormente realizados em nosso grupo. Para tal propusemos: (i) avaliar a capacidade de X. fastidiosa produzir sideróforos, pequenas moléculas quelantes de ferro; (ii) investigar, em condições de cultivo com diferentes concentrações de ferro, o perfil de expressão de alguns genes de X. fastidiosa que possam ser integrantes do stimulon do ferro; (iii) analisar o efeito da concentração de ferro no crescimento e formação de biofilme por X. fastidiosa. Observamos que X. fastidiosa parece produzir um composto quelante de ferro que pode ser um sideróforo e elencamos alguns genes que poderiam estar envolvidos na síntese desse composto. Confirmamos que ferro é necessário para o crescimento de X. fastidiosa, sendo que em alta concentração de ferro foi observada maior deposição de biofilme pela cultura bacteriana. Interessantemente também foi observado que as células crescidas em meio com pouco ferro secretaram mais exopolissacarídeos totais na fração do biofilme, o que estabelece uma relação entre as concentrações de ferro no meio com a expressão de um fator de virulência essencial para o desenvolvimento da infecção por X. fastidiosa. / Iron is an essential nutrient for bacteria, being involved in many metabolic processes. Despite its low solubility, bacteria present efficient and specific systems for uptake, utilization and storage of iron, meanwhile controlling metal concentration adequately to prevent potential toxic effects of free iron. Xylella fastidiosa is a Gram-negative bacterium which colonizes the xylem of a wide range of crops and wild species of plants worldwide. This bacterium is the agent of several diseases affecting economically important crops, such as citrus, grapevine and coffee. Among the proposed X. fastidiosa virulence mechanisms is the formation of biofilm which may occlude xylem vessels causing hydric stress. It is postulated that iron uptake might cause reduction of its concentration within the xylem of infected plants therefore constituting a virulence strategy during bacterial infection process. Our aims in this work were to investigate the process of iron uptake in X. fastidiosa and to evaluate the effect of iron concentration in the growth and morphology of this bacterium, expanding previous studies. For this we set to: (i) investigate the capacity of X. fastidiosa in producing siderophores, small biomolecules utilized for iron quelation; (ii) evaluate, under culture conditions at different iron concentrations, the expression profile of candidate genes that might be part of the iron stimulon; (iii) analyse the effect of iron concentration in growth and biofilm formation of X. fastidiosa. We observed that X. fastidiosa seems to produce a compound with iron quelating ability, such as a siderophore, and we point to a group of genes that might be involved in the synthesis of this compound. We confirmed that iron is necessary for growth of X. fastidiosa. At high concentrations of iron we observed higher biofilm production. Interestingly, we also observed that when grown in low iron concentration, X. fastidiosa secretes more exopolysaccharides (EPS) associated with the biofilm, suggesting a link between iron concentration and expression of an essential virulence factor to the infection process of X. fastidiosa.

Orientador: Mônica Alonso Cotta / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Física Gleb Wataghin / Made available in DSpace on 2018-09-02T02:33:05Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Monteiro_MoniellenPires_D.pdf: 5193520 bytes, checksum: fab290a9074ae3dd188d4ebb636ff0e7 (MD5) Previous issue date: 2017 / Resumo: Nesta tese investigamos processos de adesão da Xylella fastidiosa, bactéria gram-negativa, fitopatógena, que forma biofilmes no xilema de plantas. O trabalho teve como objetivos entender alguns aspectos do processo de adesão bacteriana e do mecanismo de transporte de células e biofilmes em sistemas que simulam os vasos do xilema. Consideramos em particular as estratégias utilizadas pela X.fastidiosa para aderir à superfície, dentre elas, a secreção de substâncias poliméricas extracelulares (EPS), a presença de adesinas fimbriais (pili) e afimbriais (XadA1) e moléculas sinalizadoras de detecção de quórum (relacionadas à formação de agregados). Como ponto de partida quantificamos as propriedades elásticas do sistema composto pelo EPS e células bacterianas, em diferentes tempos de cultivo bacteriano. Para isso utilizamos medidas de espectroscopia de força e Raman confocal durante os estágios iniciais de adesão celular e formação de agregados. Mostramos que a rigidez do sistema célula/EPS diminui progressivamente com o aumento do tempo de crescimento bacteriano. Verificamos que existe uma mudança no valor de rigidez em diferentes partes da célula, região polar e corpo bacteriano; os menores valores de rigidez encontrados no polo sugerem uma resposta mecânica mais flexível nesta região, associada com o ponto de adesão inicial da célula à superfície. No estudo de adesão e mobilidade da X.fastidiosa, utilizamos dispositivos microfluídicos modificados quimicamente, via funcionalização de superfície (em microcanais Polidimetilsiloxano/vidro) e via introdução de molécula de detecção de quórum (em microcanais impressos em poliácido láctico), para tornar o ambiente mais próximo ao do xilema da planta. Foram feitas funcionalizações de superfície com uma celulose sintética, simulando a composição química dos vasos do xilema (majoritariamente composto por celulose), e com a adesina XadA1, e observamos os efeitos sobre a adesão, crescimento e mobilidade celular. Verificamos que a adesina XadA1 aumenta a densidade bacteriana se comparada às demais superficies, além de aumentar a força de adesão bacteriana à superfície. Quanto a inserção de molécula sinalizadora, observamos que a presença destas moléculas no cultivo bacteriano aumenta a densidade celular e altera a forma de pequenos agregados / Abstract: In this thesis we investigated the adhesion processes of Xylella fastidiosa, a gram-negative, phytopathogenic bacterium that forms biofilms in the xylem of plants. The objective of this work was the understanding of several aspects of the bacterial adhesion process, as well as the mechanism of cell and biofilm transport in systems that simulate xylem vessels. In particular, we considered the strategies used by X.fastidiosa to adhere to a surface; among them, the secretion of extracellular polymeric substances (EPS), the presence of fimbrial (pili) and afimbrial (XadA1) adhesins and quorum detection molecules (related to cluster formation). As a starting point we quantified the elastic properties of the system composed of EPS and bacterial cells, at different times of bacterial culture. For this purpose, we used force spectroscopy and confocal Raman measurements during the initial stages of cell adhesion and cluster formation. We have shown that stiffness decreases progressively with increasing bacterial growth time. We observed that stiffness values varied along different parts of the cell, polar region and bacterial body. The lower stiffness values found at the pole suggest a more flexible mechanical response in this region, associated with the initial adhesion point of the cell to the surface. For the investigation on X.fastidiosa adhesion and mobility, we used chemically modified microfluidic devices via surface functionalization (in Polydimethylsiloxane / glass microchannels) and via the introduction of a quorum detection molecule (in microchannels printed on polylactic acid) to make the environment more closely resemble the plant xylem. Surface functionalizations were performed with a synthetic cellulose, simulating the chemical composition of xylem vessels (mainly composed of cellulose), and the XadA1 adhesin, and we observed the effects on cell adhesion, growth and mobility. Our results showed that immobilized XadA1 increased the bacterial density when compared to other surfaces studied; furthermore, it increased the bacterial adhesion force to the surface. Regarding the addition of the signaling molecules, we observed that their presence in the bacterial culture increases cell density and changes the shape of small clusters / Doutorado / Física / Doutora em Ciências / 2010/51748-7 / 479486/2012-3 / FAPESP / CNPQ

A Escaldadura das Folhas da Ameixeira (EFA) é uma das principais doenças que prejudicam a produção de ameixas no Brasil. Ela é causada pela bactéria Xylella fastidiosa (Wells) cujos potenciais vetores são cigarrinhas (Hemiptera: Cercopidae e Cicadellidae, Cicadellinae). Sabe-se que existem diversas espécies de cicadelídeos e cercopídeos em pomares de ameixeira, mas faltam informações sobre as plantas hospedeiras desses insetos e sua importância epidemiológica. Esta pesquisa teve por objetivo associar as cigarrinhas potenciais vetoras com as plantas de ameixeira e com plantas infestantes da vegetação de cobertura dos pomares. Para tal, realizaram-se amostragens de cigarrinhas em três pomares de ameixeira no município de Paranapanema-SP, no período de setembro/2012 a abril/2013, usando-se três métodos distintos: a) rede de varredura em plantas infestantes; b) armadilhas adesivas amarelas colocadas na copa das ameixeiras a 0,5 e 2 m acima do solo; e c) amostragens visuais em ameixeiras e certas plantas infestantes. As cigarrinhas coletadas foram triadas e identificadas em laboratório e os resultados obtidos foram submetidos à análise faunística. Para verificar se as plantas infestantes eram hospedeiras da X. fastidiosa, experimentos de inoculação mecânica foram feitos para tentar estabelecer infecção pela bactéria nas plantas de Bidens pilosa L., Parthenium hysterophorus L., Raphanus sativus L., Euphorbia heterophylla L., Sida rhombifolia L., Solanum americanum Mill. e Lantana camara L. Após meses da inoculação, as plantas foram testadas por PCR e isolamento primários para detectar a infecção por X. fastidiosa. Avaliou-se, também, a ocorrência de transmissão de X. fastidiosa de ameixeiras paras plantas infestantes, por cigarrinhas sabidamente vetoras, Sibovia sagata (Signoret) e Macugonalia cavifrons (Stål). Nas amostragens com rede de varredura, encontraram-se 72 espécies de cigarrinhas associadas às plantas infestantes dos pomares de ameixeiras, pertencentes às famílias Achilidae, Cercopidae, Cicadellidae, Delphacidae, Derbidae, Dictyopharidae, Flatidae e Membracidae. As cigarrinhas foram observadas em um total de oito espécies herbáceas de dicotiledôneas e sete monocotiledôneas. As plantas infestantes que abrigam maiores números de cigarrinha são Paspalum notatum Flügge, Parthenium hysterophorus L. e Raphanus sativus L. Dentre as espécies com potencial de transmitir X. fastidiosa, o cercopídeo Deois schach (Fabricius) e o cicadelíneo Plesiommata corniculata Young predominaram nas plantas infestantes dos pomares de ameixeira, podendo ter um papel chave em uma eventual disseminação primária de X. fastidiosa dessas plantas para ameixeira. Os cicadelíneos Acrogonia citrina Marucci & Cavichioli e Oncometopia facialis (Signoret) predominaram em capturas com armadilhas adesivas amarelas na copa das ameixeiras, o que sugere sua participação na disseminação secundária de X. fastidiosa entre árvores de ameixeira. O. facialis foi visualizada nos ramos de ameixeiras e de Lantana camara L. As plantas infestantes Solanum americanum Mill e L. camara permitem colonização por X. fastidiosa após inoculação mecânica. A cigarrinha Sibovia sagata (Signoret) é capaz de transmitir X. fastidiosa de ameixeira para S. americanum. / Plum Leaf Scald (PLS) is one of the major diseases that impair the production of plums in Brazil, caused by the xylem-limited bacterium Xylella fastidiosa (Wells), whose potential vectors in plums are sharpshooter leafhoppers (Hemiptera: Cicadellidae, Cicadellinae) and spittlebugs (Hemiptera: Cercopidae). A number of leafhoppers and and spittlebugs have been reported in Brazilian plum orchards, but their host plants and role in PLS epidemiology are largely unknown. The goal of this research was to investigate the association of potential hopper vectors with plum trees and weedy plants in the ground vegetation of orchards, in order to determine key vector species and weeds involved in PLS epidemiology. Therefore, a hopper survey was carried out in three plum orchards in the municipality of Paranapanema, SP, from September/2012 to April/2013, using three sampling methods: a) sweep net on weed species of the ground vegetation; b) yellow sticky cards placed on the plum canopy at 0.5 and 2 m above ground; and c) visual inspections of plum trees and some weeds. The collected hoppers were sorted and identified in the laboratory, and the data were submitted to faunistic analysis. To check if the weeds were hosts of plum strains of X. fastidiosa, bacterial suspensions were mechanically inoculated in Bidens pilosaL., Parthenium hysterophorus L., Raphanus sativus L., Euphorbia heterophylla L., Sida rhombifolia L., Solanum americanum Mill. Lantana camara L. The plants were assayed for infection of X. fastidiosa by PCR and culture at 2 months after inoculation. Transmission assays of X. fastidiosa from plum to weeds were carried out using two sharpshooter vectors, Sibovia sagata (Signoret) e Macugonalia cavifrons (Stål). The sweep net samplings revealed 72 species of seven hopper families (Achilidae, Cercopidae, Cicadellidae, Delphacidae, Derbidae, Dictyopharidae, Flatidae and Membracidae) associated with eight dicotyledoneous and seven monocotyledoneous weeds in the ground vegetation, with prevalence of Cicadellidae and Cercopidae. Among the potential hopper vectors, the spittlebug Deois schach (Fabricius) and the sharpshooter Plesiommata corniculata Young were predomimant species on the weed species, suggesting that they may play a key role in a possible primary spread of X. fastidiosa from weeds to plum. Paspalum notatum Flügge, Parthenium hysterophorus L. and Raphanus sativus L. were the weed species with the largest hopper populations. The sharpshooters Acrogonia citrina Marucci & Cavichioli e Oncometopia facialis (Signoret) were prevalent species trapped by the yellow sticky cards on the plum canopy, indicating that they may be involved in secondary spread of X. fastidiosa between plum trees in that region. O. facialis was visually detected on branches of plum trees and on the weed Lantana camara L. The weeds Solanum americanum Mill e L. camara allow colonization by X. fastidiosa after mechanical inoculation.The sharpshooter Sibovia sagata (Signoret) transmitted X. fastidiosa from plum to S. americanum.

A bactéria Xylella fastidiosa (X. fastidiosa) é um patógeno de planta que causa a clorose variegada dos citros, também conhecida como amarelinho. Xylella fastidiosa é uma bactéria limitada ao xilema, sendo transmitida de planta a planta através de insetos vetores. Através da determinação experimental da seqüência primária de algumas proteínas marcadamente expressas pela X. fastidiosa e a comparação destas com seqüências de ácidos nucléicos do genoma identificou entre elas três ORFs codificadoras de proteínas que podem estar relacionadas à patogenicidade desta bactéria no seu hospedeiro. No entanto, a função biológica destas proteínas ainda não foi funcionalmente caracterizada. Para investigar o papel biológico e realizar estudos de estrutura e função, as ORFs correspondentes as proteínas hidroxinitrila liase, corismato sintase e proteína D do sistema de transporte e secreção Tat foram clonadas, seqüenciadas e expressas em Escherichia coli. As proteínas recombinantes expressas foram purificadas por cromatografia de afinidade e suas identidades verificadas por seqüenciamento. As proteínas purificadas foram encontradas como uma única banda em SDS-PAGE. As proteínas recombinantes, pela primeira vez isoladas, foram caracterizadas em termos de estabilidade conformacional e comportamento estrutural frente a mudanças de pH e temperatura utilizando-se as espectroscopias de dicroísmo circular e fluorescência. O sucesso na construção do gene sintético e na clonagem em vetores de expressão de E. coli resultou em quantidade satisfatória de expressão das proteínas recombinantes. Duas delas apresentaram-se na formas solúveis, facilmente purificadas e ativas e permitindo suas caracterizações. / Xylella fastidiosa is the causal agent of citrus variegated chlorosis, also known as \"amarelinho\". Xylella fastidiosa inhabits exclusively the xylem vessels, and is transmitted by sharpshooter vectors. The experimental determination of the primary sequence of some markedly expressed proteins for X. fastidiosa and the comparison with the nucleic acids sequence of its genome aided the identification of three of them as being proteins involved in host pathogenicity. However, the biological role of these proteins should be assigned experimentally. In order to investigate the biological role, function and structure, ORFs corresponding to hydroxynitrile liase, chorismate synthase and type V secretory pathway proteins were cloned, sequenced and expressed in Escherichia coli. The expressed recombinant proteins were purified by immobilized metal affinity chromatography (Ni-NTA resin) and their identities were verified by protein sequencing. The purified proteins were found as a single band on SDS-PAGE. The successful cloning and heterologous expression of recombinant HNL in E. coli resulted in a satisfactory amount of expressed protein. Two of the expressed recombinant proteins were soluble, easily purified, and isolated in an active form. X. fastidiosa recombinant proteins, for the first time isolated, were characterized according to enzyme conformational stability and structural behavior as a function of pH and temperature using circular dichroism and fluorescence spectroscopy.

Muitas das proteínas de valor biomédico relevante são encontradas em baixas concentrações em suas fontes nativas. O alto nível de expressão de proteínas recombinantes em E. coli, muitas vezes gera o acúmulo de proteínas como agregados insolúveis no citoplasma e/ou periplasma da bactéria, denominados de corpos de inclusão (CI). A alta pressão tem sido amplamente utilizada no estudo da conformação das proteínas,ela modula as interações proteína-proteína e proteína-solvente através de mudanças no volume das mesmas, promovendo a entrada de água nas cavidades não expostas da molécula e promovendo hidratação e solubilização dos agregados. O presente trabalho teve como objetivo a renaturação de proteínas recombinantes expressas como CI em Escherichia coli usando alta pressão hidrostática como condição branda de dissociação dos agregados. As tiorredoxinas TsnC e TrxA, a proteína YbbN e a proteína comigratória com bacterioferritina (Bcp), todas de Xylella fastidiosa, foram estudadas neste trabalho. As condições de renaturação foram otimizadas, utilizando-se diferentes proporções do par redox, concentrações de GdnHCl, presença de aditivos e esquemas de descompressão. Para a quantificação e análise da eficácia do processo de renaturação das proteínas sob pressão foram utilizadas as técnicas de microscopia eletrônica de varredura dos CI e de SDS-PAGE, e ensaios de atividade enzimática das proteínas. A TsnC foi renaturada em Tris HCl 50 mM com proporção de 10GSH:1GSSG em concentração final de 10 mM, 0,75 M GdnHCl, na presença de 0,5 M de Triton-X e a pressão utilizada foi de 2,4 kbar por 1 hora e 30 minutos seguida de descompressão direta e incubação por 16 horas em pressão atmosférica. O rendimento final de obtenção de TsnC solúvel foi altíssimo, de até 89,9%. A renaturação de proteína YbbN, nunca antes descrita, foi obtida em tampão de renaturação Tris HCl 50 mM, na presença de 0,5 M de L-Arginina e a pressão utilizada foi de 2,4 kbar por 1 hora e 30 minutos seguida de descompressão direta e incubação por 16 horas em pressão atmosférica. A proteína YbbN, que apresentou atividade de tioredoxina, foi renaturada com rendimento de até 98% a partir da proteína insolúvel nos CI. Foi possível a solubilização da tiorredoxina TrxA e Bcp sob alta pressão hidrostática em tampão de renaturação Tris HCl 50 mM, utilizando diferentes proporções do par redox na concentração final de 10 mM e 1,5 M de GdnHCl, porém não foi possível obter a atividade biológicas destas proteínas. Mostramos também que a L-Arginina apresenta efeito auxiliar na solubilização dos CI induzida pela alta pressão, e ao mesmo tempo se mostrou altamente protetora contra a inativação da atividade da YbbN promovida pela incubação em altas temperaturas, o que sugere que a presença deste aminoácido pode ter alta aplicabilidade juntamente com a aplicação de altas pressões para elevar os rendimentos de renaturação de proteínas recombinantes a partir de CI. / Many of the relevant proteins are found in low concentrations in their native sources. The high level expression of recombinant heterologous proteins in Escherichia coli often causes their accumulation as insoluble aggregates in the cytoplasm or periplasm of bacteria in a mainly inactive form, known as inclusion bodies (IB). The high pressure has been widely used to study the conformational states of proteins. It modulates the protein-protein and protein-solvent interactions by changing the volume of the system, promoting the entrance of water into the cavities unexposed to water, exposing hydrophobic regions and promoting solubilization of the aggregates. The present study aimed to refold recombinant proteins expressed in E. coli as IB using high hydrostatic pressure as a mild condition for IB dissociation. The thioredoxins TsnC, TrxA and Ybbn and the protein comigratory with bacterioferritin (Bcp) of Xylella fastidiosa were studied in this work. The conditions for refolding were optimized for proportions of the redox pair, GdnHCl concentration, presence of additives and schemes for decompression. To analyze the effectiveness of the process of refolding under pressure we have used, scanning electron microscopy of the IB and SDS-PAGE and enzymatic activity assays for quantification and analysis of the solubilized proteins. The TsnC was renatured in 50 mM TrisHCl at a ratio of 10GSH: 1GSSG in 10 mM final concentration, 0.75 M GdnHCl in the presence of 0.5M Trito X-100 and application of 2.4 kbar for 1.5 hours, followed by direct decompression and incubation for 16 h at atmospheric pressure. The final yield of soluble and biological active TsnC was very high, up to 89,9%. The refolding of protein YbbN was obtained by application of 2.4 kbar for 1.5 h to an IB suspension in buffer 50 mM Tris HCl, in the presence of 0.5 M L-arginine, followed by direct decompression and incubation for 16 h at atmospheric pressure. We also show that L-arginine had a highly protective effect on the inactivation of biological activity of YbbN promoted by incubation at high temperatures.The final yield of refolded YbbN, that present thioredoxin activity, was also very high: 98%. TrxA and Bcp thioredoxins were solubilized at 2.4 kbar and step decompression. However, these proteins did not present biological activity. We also show that L-arginine has an auxiliary effect on the solubilization of IB induced by high pressure, while its presence proved highly protective against inactivation of the enzymatic activity promoted by incubation at high temperatures. These results suggest that the presence of this amino acid can have high applicability to increase the yield of refolding of recombinant proteins from the IC at high pressure.

Xylella fastidiosa é uma bactéria fitopatogênica, responsável por doenças em diversas plantas de importância econômica. Diversas cepas têm sido estudadas, porém, pouco se sabe a respeito da resposta a estresses ambientais em X. fastidiosa. Utilizando a tecnologia de microarranjos de DNA, verificou-se a resposta global aos estresses térmico, salino e osmótico em nível de transcrição. Os experimentos foram realizados em séries temporais, os perfis de expressão gênica dos genes diferencialmente expressos foram agrupados e validados por RT-PCR quantitativo. No choque térmico, 261 genes foram induzidos (9,7%) e 222 genes foram reprimidos (8,3%). Dentre os genes altamente induzidos, destacam-se os que codificam proteínas de choque térmico (Hsps), que previnem a desnaturação e a formação de agregados protéicos ou degradam polipeptídeos irreversivelmente desnaturados. A partir da determinação do início de transcrição de seis genes altamente induzidos no choque térmico, propôs-se um consenso para promotores dependentes do fator sigma alternativo que controla a resposta ao choque térmico, sigma32. Observou-se também a indução de genes relacionados ao estresse extracitoplasmático, que são regulados pelo fator sigma alternativo sigmaE. No choque osmótico e salino, os genes codificando a maioria das Hsps foram reprimidos na exposição prolongada a esses estresses, indicando que a resposta não é mediada por sigma32 ou sigmaE. Dos 142 genes induzidos tanto no estresse salino como osmótico, 57% codificam proteínas hipotéticas ou hipotéticas conservadas, indicando uma possível função na resposta a estes estresses. Observou-se a repressão de genes relacionados à síntese protéica e ao metabolismo intermediário nos três estresses analisados, além da indução de genes relacionados à virulência como toxinas e adesinas, revelando a complexa rede de genes envolvida na resposta a estresses ambientais. Para auxiliar a análise de dados de microarranjos de DNA, foram desenvolvidas três ferramentas de bioinformática: HTself, utilizada na determinação de genes diferencialmente expressos; BayGO, utilizada na análise categorias funcionais altamente representadas dentre os genes de interesse e SpotWhatR, uma plataforma que integra programas utilizados nas diversas etapas da análise e pré-processamento de dados de microarranjos, com uma interface de fácil utilização. Estas ferramentas foram utilizadas com sucesso e estão disponíveis livremente para outros pesquisadores. / Xylella fastidiosa is a phytopathogenic bacterium responsible for diseases in many economically important crops. Although different strains have been studied, little is known about X. fastidiosa stress responses. To investigate X. fastidiosa genes involved in heat, salt and osmotic shock responses, we performed a whole genome microarray analysis in time-course experiments. The expression profiles of the differentially expressed genes were grouped and their expression patterns were validated by quantitative RT-PCR experiments. During heat shock, 261 genes were induced (9.7%) and 222 genes were repressed (8.3%). Among the differentially expressed genes, the ones presenting the highest induction ratios encode heat shock proteins (Hsps), which prevents protein misfolding and aggregation or promote the degradation of the irreversibly denatured polypeptides. We determined the transcription start sites of six heat shock inducible genes and analyzed their promoter regions, which allowed us to propose a putative consensus for sigma32 promoters in X. fastidiosa. We also observed the induction of genes related to the extracytoplasmic stress response, that are regulated by the alternative sigma factor sigmaE. During prolongued exposure to salt and osmotic stress, genes encoding most of the Hsps were repressed, indicating that the response is not mediated by sigma32 or sigmaE. Among the 142 genes induced by both salt and osmotic stress, 57% encode hypothetical or conserved hypothetical proteins, indicating a possible role of these genes in the stress response. In addition, we observed the repression of genes related to protein biosynthesis and intermediary metabolism during the three stresses tested, besides the induction of genes related to virulence such as toxins and adhesins, revealing the complex network of genes that work together in response to environmental stresses. To facilitate the microarray data analysis process, we developed three bioinformatics tools: HTself, which is used to determine the differentially expressed genes; BayGO, which aims at finding over-represented gene categories and SpotWhatR, a system that integrates programs used in different steps of microarray data analysis in a user-friendly interface. These tools were successfully used and are freely available to the research community.

O ferro é essencial para a sobrevivência das bactérias, estando envolvido em vários processos metabólicos. Apesar de sua baixa solubilidade, as bactérias dispõem de sistemas eficientes e específicos para captação, utilização e armazenamento desse metal, ao mesmo tempo controlando adequadamente a concentração de ferro livre no meio, para evitar seus potenciais efeitos tóxicos. Xylella fastidiosa é uma bactéria gram-negativa que coloniza o xilema de uma diversidade de plantas cultivadas e silvestres em várias partes do mundo, sendo o agente causador de uma série de doenças em plantas economicamente importantes como citros, videiras e café. Alguns mecanismos de virulência de X. fastidiosa já foram elencados, entre esses a formação de biofilme, que promoveria a oclusão do xilema e consequente estresse hídrico para a planta. Postula-se que a captação de ferro por X. fastidiosa, causando redução da concentração desse metal no xilema das plantas infectadas, seja uma das estratégias utilizadas pela bactéria em seu processo de infecção. Nosso objetivo neste trabalho foi de investigar o processo de captação de ferro por X. fastidiosa e avaliar em maior detalhe o efeito da concentração de ferro no crescimento e na expressão de fatores de virulência dessa bactéria, expandindo os estudos anteriormente realizados em nosso grupo. Para tal propusemos: (i) avaliar a capacidade de X. fastidiosa produzir sideróforos, pequenas moléculas quelantes de ferro; (ii) investigar, em condições de cultivo com diferentes concentrações de ferro, o perfil de expressão de alguns genes de X. fastidiosa que possam ser integrantes do stimulon do ferro; (iii) analisar o efeito da concentração de ferro no crescimento e formação de biofilme por X. fastidiosa. Observamos que X. fastidiosa parece produzir um composto quelante de ferro que pode ser um sideróforo e elencamos alguns genes que poderiam estar envolvidos na síntese desse composto. Confirmamos que ferro é necessário para o crescimento de X. fastidiosa, sendo que em alta concentração de ferro foi observada maior deposição de biofilme pela cultura bacteriana. Interessantemente também foi observado que as células crescidas em meio com pouco ferro secretaram mais exopolissacarídeos totais na fração do biofilme, o que estabelece uma relação entre as concentrações de ferro no meio com a expressão de um fator de virulência essencial para o desenvolvimento da infecção por X. fastidiosa. / Iron is an essential nutrient for bacteria, being involved in many metabolic processes. Despite its low solubility, bacteria present efficient and specific systems for uptake, utilization and storage of iron, meanwhile controlling metal concentration adequately to prevent potential toxic effects of free iron. Xylella fastidiosa is a Gram-negative bacterium which colonizes the xylem of a wide range of crops and wild species of plants worldwide. This bacterium is the agent of several diseases affecting economically important crops, such as citrus, grapevine and coffee. Among the proposed X. fastidiosa virulence mechanisms is the formation of biofilm which may occlude xylem vessels causing hydric stress. It is postulated that iron uptake might cause reduction of its concentration within the xylem of infected plants therefore constituting a virulence strategy during bacterial infection process. Our aims in this work were to investigate the process of iron uptake in X. fastidiosa and to evaluate the effect of iron concentration in the growth and morphology of this bacterium, expanding previous studies. For this we set to: (i) investigate the capacity of X. fastidiosa in producing siderophores, small biomolecules utilized for iron quelation; (ii) evaluate, under culture conditions at different iron concentrations, the expression profile of candidate genes that might be part of the iron stimulon; (iii) analyse the effect of iron concentration in growth and biofilm formation of X. fastidiosa. We observed that X. fastidiosa seems to produce a compound with iron quelating ability, such as a siderophore, and we point to a group of genes that might be involved in the synthesis of this compound. We confirmed that iron is necessary for growth of X. fastidiosa. At high concentrations of iron we observed higher biofilm production. Interestingly, we also observed that when grown in low iron concentration, X. fastidiosa secretes more exopolysaccharides (EPS) associated with the biofilm, suggesting a link between iron concentration and expression of an essential virulence factor to the infection process of X. fastidiosa.

A Escaldadura das Folhas da Ameixeira (EFA) é uma das principais doenças que prejudicam a produção de ameixas no Brasil. Ela é causada pela bactéria Xylella fastidiosa (Wells) cujos potenciais vetores são cigarrinhas (Hemiptera: Cercopidae e Cicadellidae, Cicadellinae). Sabe-se que existem diversas espécies de cicadelídeos e cercopídeos em pomares de ameixeira, mas faltam informações sobre as plantas hospedeiras desses insetos e sua importância epidemiológica. Esta pesquisa teve por objetivo associar as cigarrinhas potenciais vetoras com as plantas de ameixeira e com plantas infestantes da vegetação de cobertura dos pomares. Para tal, realizaram-se amostragens de cigarrinhas em três pomares de ameixeira no município de Paranapanema-SP, no período de setembro/2012 a abril/2013, usando-se três métodos distintos: a) rede de varredura em plantas infestantes; b) armadilhas adesivas amarelas colocadas na copa das ameixeiras a 0,5 e 2 m acima do solo; e c) amostragens visuais em ameixeiras e certas plantas infestantes. As cigarrinhas coletadas foram triadas e identificadas em laboratório e os resultados obtidos foram submetidos à análise faunística. Para verificar se as plantas infestantes eram hospedeiras da X. fastidiosa, experimentos de inoculação mecânica foram feitos para tentar estabelecer infecção pela bactéria nas plantas de Bidens pilosa L., Parthenium hysterophorus L., Raphanus sativus L., Euphorbia heterophylla L., Sida rhombifolia L., Solanum americanum Mill. e Lantana camara L. Após meses da inoculação, as plantas foram testadas por PCR e isolamento primários para detectar a infecção por X. fastidiosa. Avaliou-se, também, a ocorrência de transmissão de X. fastidiosa de ameixeiras paras plantas infestantes, por cigarrinhas sabidamente vetoras, Sibovia sagata (Signoret) e Macugonalia cavifrons (Stål). Nas amostragens com rede de varredura, encontraram-se 72 espécies de cigarrinhas associadas às plantas infestantes dos pomares de ameixeiras, pertencentes às famílias Achilidae, Cercopidae, Cicadellidae, Delphacidae, Derbidae, Dictyopharidae, Flatidae e Membracidae. As cigarrinhas foram observadas em um total de oito espécies herbáceas de dicotiledôneas e sete monocotiledôneas. As plantas infestantes que abrigam maiores números de cigarrinha são Paspalum notatum Flügge, Parthenium hysterophorus L. e Raphanus sativus L. Dentre as espécies com potencial de transmitir X. fastidiosa, o cercopídeo Deois schach (Fabricius) e o cicadelíneo Plesiommata corniculata Young predominaram nas plantas infestantes dos pomares de ameixeira, podendo ter um papel chave em uma eventual disseminação primária de X. fastidiosa dessas plantas para ameixeira. Os cicadelíneos Acrogonia citrina Marucci & Cavichioli e Oncometopia facialis (Signoret) predominaram em capturas com armadilhas adesivas amarelas na copa das ameixeiras, o que sugere sua participação na disseminação secundária de X. fastidiosa entre árvores de ameixeira. O. facialis foi visualizada nos ramos de ameixeiras e de Lantana camara L. As plantas infestantes Solanum americanum Mill e L. camara permitem colonização por X. fastidiosa após inoculação mecânica. A cigarrinha Sibovia sagata (Signoret) é capaz de transmitir X. fastidiosa de ameixeira para S. americanum. / Plum Leaf Scald (PLS) is one of the major diseases that impair the production of plums in Brazil, caused by the xylem-limited bacterium Xylella fastidiosa (Wells), whose potential vectors in plums are sharpshooter leafhoppers (Hemiptera: Cicadellidae, Cicadellinae) and spittlebugs (Hemiptera: Cercopidae). A number of leafhoppers and and spittlebugs have been reported in Brazilian plum orchards, but their host plants and role in PLS epidemiology are largely unknown. The goal of this research was to investigate the association of potential hopper vectors with plum trees and weedy plants in the ground vegetation of orchards, in order to determine key vector species and weeds involved in PLS epidemiology. Therefore, a hopper survey was carried out in three plum orchards in the municipality of Paranapanema, SP, from September/2012 to April/2013, using three sampling methods: a) sweep net on weed species of the ground vegetation; b) yellow sticky cards placed on the plum canopy at 0.5 and 2 m above ground; and c) visual inspections of plum trees and some weeds. The collected hoppers were sorted and identified in the laboratory, and the data were submitted to faunistic analysis. To check if the weeds were hosts of plum strains of X. fastidiosa, bacterial suspensions were mechanically inoculated in Bidens pilosaL., Parthenium hysterophorus L., Raphanus sativus L., Euphorbia heterophylla L., Sida rhombifolia L., Solanum americanum Mill. Lantana camara L. The plants were assayed for infection of X. fastidiosa by PCR and culture at 2 months after inoculation. Transmission assays of X. fastidiosa from plum to weeds were carried out using two sharpshooter vectors, Sibovia sagata (Signoret) e Macugonalia cavifrons (Stål). The sweep net samplings revealed 72 species of seven hopper families (Achilidae, Cercopidae, Cicadellidae, Delphacidae, Derbidae, Dictyopharidae, Flatidae and Membracidae) associated with eight dicotyledoneous and seven monocotyledoneous weeds in the ground vegetation, with prevalence of Cicadellidae and Cercopidae. Among the potential hopper vectors, the spittlebug Deois schach (Fabricius) and the sharpshooter Plesiommata corniculata Young were predomimant species on the weed species, suggesting that they may play a key role in a possible primary spread of X. fastidiosa from weeds to plum. Paspalum notatum Flügge, Parthenium hysterophorus L. and Raphanus sativus L. were the weed species with the largest hopper populations. The sharpshooters Acrogonia citrina Marucci & Cavichioli e Oncometopia facialis (Signoret) were prevalent species trapped by the yellow sticky cards on the plum canopy, indicating that they may be involved in secondary spread of X. fastidiosa between plum trees in that region. O. facialis was visually detected on branches of plum trees and on the weed Lantana camara L. The weeds Solanum americanum Mill e L. camara allow colonization by X. fastidiosa after mechanical inoculation.The sharpshooter Sibovia sagata (Signoret) transmitted X. fastidiosa from plum to S. americanum.

Xylella fastidiosa é uma bactéria fitopatogênica, responsável por doenças em diversas plantas de importância econômica. Diversas cepas têm sido estudadas, porém, pouco se sabe a respeito da resposta a estresses ambientais em X. fastidiosa. Utilizando a tecnologia de microarranjos de DNA, verificou-se a resposta global aos estresses térmico, salino e osmótico em nível de transcrição. Os experimentos foram realizados em séries temporais, os perfis de expressão gênica dos genes diferencialmente expressos foram agrupados e validados por RT-PCR quantitativo. No choque térmico, 261 genes foram induzidos (9,7%) e 222 genes foram reprimidos (8,3%). Dentre os genes altamente induzidos, destacam-se os que codificam proteínas de choque térmico (Hsps), que previnem a desnaturação e a formação de agregados protéicos ou degradam polipeptídeos irreversivelmente desnaturados. A partir da determinação do início de transcrição de seis genes altamente induzidos no choque térmico, propôs-se um consenso para promotores dependentes do fator sigma alternativo que controla a resposta ao choque térmico, sigma32. Observou-se também a indução de genes relacionados ao estresse extracitoplasmático, que são regulados pelo fator sigma alternativo sigmaE. No choque osmótico e salino, os genes codificando a maioria das Hsps foram reprimidos na exposição prolongada a esses estresses, indicando que a resposta não é mediada por sigma32 ou sigmaE. Dos 142 genes induzidos tanto no estresse salino como osmótico, 57% codificam proteínas hipotéticas ou hipotéticas conservadas, indicando uma possível função na resposta a estes estresses. Observou-se a repressão de genes relacionados à síntese protéica e ao metabolismo intermediário nos três estresses analisados, além da indução de genes relacionados à virulência como toxinas e adesinas, revelando a complexa rede de genes envolvida na resposta a estresses ambientais. Para auxiliar a análise de dados de microarranjos de DNA, foram desenvolvidas três ferramentas de bioinformática: HTself, utilizada na determinação de genes diferencialmente expressos; BayGO, utilizada na análise categorias funcionais altamente representadas dentre os genes de interesse e SpotWhatR, uma plataforma que integra programas utilizados nas diversas etapas da análise e pré-processamento de dados de microarranjos, com uma interface de fácil utilização. Estas ferramentas foram utilizadas com sucesso e estão disponíveis livremente para outros pesquisadores. / Xylella fastidiosa is a phytopathogenic bacterium responsible for diseases in many economically important crops. Although different strains have been studied, little is known about X. fastidiosa stress responses. To investigate X. fastidiosa genes involved in heat, salt and osmotic shock responses, we performed a whole genome microarray analysis in time-course experiments. The expression profiles of the differentially expressed genes were grouped and their expression patterns were validated by quantitative RT-PCR experiments. During heat shock, 261 genes were induced (9.7%) and 222 genes were repressed (8.3%). Among the differentially expressed genes, the ones presenting the highest induction ratios encode heat shock proteins (Hsps), which prevents protein misfolding and aggregation or promote the degradation of the irreversibly denatured polypeptides. We determined the transcription start sites of six heat shock inducible genes and analyzed their promoter regions, which allowed us to propose a putative consensus for sigma32 promoters in X. fastidiosa. We also observed the induction of genes related to the extracytoplasmic stress response, that are regulated by the alternative sigma factor sigmaE. During prolongued exposure to salt and osmotic stress, genes encoding most of the Hsps were repressed, indicating that the response is not mediated by sigma32 or sigmaE. Among the 142 genes induced by both salt and osmotic stress, 57% encode hypothetical or conserved hypothetical proteins, indicating a possible role of these genes in the stress response. In addition, we observed the repression of genes related to protein biosynthesis and intermediary metabolism during the three stresses tested, besides the induction of genes related to virulence such as toxins and adhesins, revealing the complex network of genes that work together in response to environmental stresses. To facilitate the microarray data analysis process, we developed three bioinformatics tools: HTself, which is used to determine the differentially expressed genes; BayGO, which aims at finding over-represented gene categories and SpotWhatR, a system that integrates programs used in different steps of microarray data analysis in a user-friendly interface. These tools were successfully used and are freely available to the research community.

Orientador: Alessandra Alves de Souza / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-25T17:43:02Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Caserta_Raquel_D.pdf: 28122729 bytes, checksum: f611b63be786134a0c9fbad9785006b0 (MD5) Previous issue date: 2014 / Resumo: A produção do suco de laranja concentrado é uma das commodities mais importantes para o agronegócio brasileiro, entretanto, os constantes problemas fitossanitários que afetam a citricultura vem aumentando os custos de produção e consequentemente a rentabilidade econômica deste setor. É urgente a busca por alternativas para solucionar os problemas fitossanitários da citricultura, nesse sentido, a utilização de transgenia mostra-se uma ferramenta promissora, pois possibilita a obtenção de plantas com genes exógenos que conferem resistência a doenças. Uma das doenças que afetam a citricultura brasileira é a clorose variegada dos citros (CVC), causada pela bactéria Xylella fastidiosa, onde todas as variedades de Citrus sinensis mostram-se suscetíveis a doença. Uma estratégia que vem sendo utilizada para resistência a X. fastidiosa que afeta a cultura de uva na Califórnia-EUA envolve a chamada "confusão do patógeno" onde utiliza-se genes do próprio patógeno visando a alteração da sinalização molecular entre as células bacterianas, interferindo em sua patogenicidade. Neste trabalho foram abordadas as transformações de Nicotiana tabacum e Citrus sinensis com o gene rpfF de X. fastidiosa causadora da CVC, envolvido na síntese de uma molécula sinalizadora que regula a expressão de genes associados a patogenicidade dessa bactéria. Eventos dos cultivares de laranja doce Hamlin e Pineapple transformados com rpfF foram desafiados com X. fastidiosa e, após avaliações nas fases inicial e avançada de sintomas, foi observada uma redução na incidência e na severidade de sintomas de CVC. A movimentação bacteriana ao longo de tais plantas também foi comprometida, sendo que a população bacteriana em pontos distantes do ponto de inoculação foi maior em plantas do tipo selvagem quando comparadas as transgênicas. Esses resultados sugerem que as moléculas produzidas pelas plantas transgênicas foram capazes de alterar o comportamento da bactéria, reduzindo sua patogenicidade. Outro fitopatógeno que ataca pomares brasileiros é Xanthomonas citri subsp. citri, que também apresenta o gene rpfF, e assim como em X. fastidiosa, é responsável pela sinalização molecular. Eventos transgênicos de Carrizo e Pineapple também foram desafiados com X. citri. Nesse patógeno, a interrupção da sinalização mediada por DSF, Diffusible Signal Factor - uma molécula de ácido graxo, reduz sua virulência, e interessantemente, sintomas de cancro cítrico foram reduzidos nas plantas transgênicas. Em folhas transgênicas não foi observado o aparecimento de pústulas, e biofilmes formados na área da inoculação foram alterados. Genes modulados por DSF em bactérias isoladas de plantas transgênicas foram reprimidos, sugerindo que a sinalização foi comprometida. Por fim, seiva das plantas transgênicas não ativou a expressão do promotor engA::GFP em Xanthomonas campestris biosensoras, indicando que a molécula produzida por essas plantas foi capaz de alterar a sinalização. Por outro lado, a seiva das plantas transgênicas ativou a expressão do hxfA::PhoA em X. fastidiosa biosensoras, indicando a funcionalidade dessa molécula para esse fitopatógeno. Portanto, em ensaios com X. citri, o DSF das plantas transgênicas atuou como antagonista, diminuindo a virulência da bactéria através da alteração da sinalização molecular. Esses resultados mostram que as moléculas sinalizadoras produzidas por plantas transformadas com rpfF de X. fastidiosa são promissoras na tentativa de controle de CVC e cancro cítrico / Abstract: The production of concentrate orange juice is one of the most important commodities for Brazilian agribusiness, however, the constant phytosanitary problems affecting the citrus industry is increasing production costs and consequently the economic profitability of this sector. It is urgent to search for alternatives to solve citrus phytosanitary problems, in this sense, the use of transgenesis shows a promising tool because it enables the production of plants with exogenous genes that confer resistance to diseases. One of the diseases that affect Brazilian citrus industry is the citrus variegated chlorosis (CVC), caused by the bacterium Xylella fastidiosa, where all varieties of Citrus sinensis are susceptible to this disease. One strategy that has been used for X. fastidiosa resistance that affects grape cultures in California-USA involves the so-called "pathogen confusion" that is related to the usage of genes of the pathogen itself aiming to change the molecular signaling between bacterial cells by interfering in its pathogenicity. In this work we will discuss the transformation of Nicotiana tabacum and Citrus sinensis with the rpfF gene isolated from X. fastidiosa causing the CVC, involved in the synthesis of a signaling molecule that regulates the expression of genes associated with pathogenicity of these bacteria. Transgenic events of Hamlin and Pineapple transformed with rpfF were inoculated with X. fastidiosa and after evaluations in early and advanced stages of symptoms, a reduction was observed in the incidence and severity of symptoms of CVC. Bacterial movement along these plants was also impaired, and the bacterial population analyzed far from the point of inoculation was higher in wild type plants compared to transgenic ones. These results suggest that the molecules produced by the transgenic plants were able to change the behavior of the bacteria, reducing its pathogenicity. Another pathogen that attacks Brazilian orchards is Xanthomonas citri subsp. citri, which also features rpfF gene, and as in X. fastidiosa is responsible for molecular signaling. Transformed plants of Carrizo and Pineapple were also challenged with X. citri. In this pathogen, the interruption of DSF-mediated signaling reduces its virulence, and interestingly, citrus canker symptoms were reduced in transgenic plants. In transgenic leaves there was no pustules development and alterations in biofilms formed in the area of inoculation were observed. Genes modulated by DSF in bacteria isolated from transgenic plants were repressed, suggesting that signaling was compromised. Finally, sap of transgenic plants did not activate the expression of the promoter engA::GFP in Xanthomonas campestris biosensors, indicating that the molecule produced by these plants was able to change the signaling. On the other hand, the sap of transgenic plants activated the expression of hxfA::PhoA in X. fastidiosa biosensors, indicating the functionality of this molecule for this pathogen. Therefore, in assays with X. citri, the DSF of transgenic plants acted as antagonist, decreasing the virulence of the bacteria by changing the molecular signaling. These results show that the signaling molecules produced by plants transformed with rpfF of X. fastidiosa are promising in the attempt to control CVC and citrus canker / Doutorado / Genetica Vegetal e Melhoramento / Doutora em Genética e Biologia Molecular