A bactéria fitopatogênica Xylella fastidiosa é o agente etiológico da Clorose Variegada dos Citros (CVC), que causa perdas anuais estimadas em US$ 100 milhões no Brasil. Durante o processo infeccioso, a geração extracelular de espécies ativas de oxigênio é um dos principais mecanismos de defesa da planta contra o patógeno. Em contrapartida, para se defender do estresse oxidativo imposto pelo hospedeiro, os fitopatógenos possuem mecanismos de defesa que incluem enzimas antioxidantes, como as peroxirredoxinas, alquil hidroperóxido redutase subunidade C (AhpC) e proteína comigratória com bacterioferritina (Bcp). As peroxirredoxinas são proteínas que utilizam suas cisteínas ativas para catalisar a redução de hidroperóxidos. Por análise proteômica, os produtos dos genes ahpc e bcp foram identificados no extrato celular protéico de X. fastidiosa (Smolka e col., 2003). Com o intuito de caracterizar funcional e estruturalmente as proteínas AhpC e Bcp de X. fastidiosa, clonamos e expressamos seus respectivos genes em Escherichia coli e purificamos as proteínas por cromatografia de afinidade a níquel. As proteínas recombinantes apresentaram atividade dependente de tiól de redução de peróxido de hidrogênio e hidroperóxidos orgânicos. A atividade peroxidase da AhpC e Bcp são dependentes, respectivamente, de alquil hidroperóxido redutase subunidade F (AhpF) e do sistema tiorredoxina. Paradoxalmente, a flavoproteína AhpF possui atividade NAD(P)H oxidase, que resulta na produção de peróxido de hidrogênio. As constantes de segunda ordem da reação das proteínas com peróxido de hidrogênio (da ordem de 107 M-1.s-1), determinadas pelo ensaio de cinética competitiva com peroxidase de raiz forte, indicam que ambas possuem atividades peroxidase equivalentes às apresentadas por glutationa peroxidases dependentes de selênio e catalases, ao contrário do descrito na literatura. Por SDS-PAGE não-redutor e pela quantificação de cisteínas livres por DTNB, verificamos que as proteínas possuem mecanismos catalíticos distintos: AhpC é uma 2-Cys Prx típica (com formação de ponte dissulfeto intermolecular), enquanto Bcp é uma 2-Cys Prx atípica (com formação de ponte dissulfeto intramolecular). Para AhpC, a atividade catalítica envolve as cisteínas conservadas (Cys-47 e Cys-165), em contraste, apenas através de estudos de mutação sítio-dirigida e espectrometria de massas conseguimos identificar os resíduos de cisteínas envolvidos na atividade catalítica da Bcp (Cys-47 e Cys-83). A caracterização estrutural de AhpC por cromatografia de exclusão molecular e espalhamento dinâmico de luz mostram que a proteína nativa é um decâmero estável, independentemente do estado de oxidação de suas cisteínas. A caracterização da estrutura cristalográfica de Bcp C47S, inédita para 2-Cys Prx atípicas que possuem as cisteínas ativas separadas por 35 aminoácidos, indica que a proteína possui o enovelamento característico das peroxirredoxinas e que as cisteínas ativas estão localizadas a uma distância média de 12,4 Å. Baseado em dicroísmo circular, apresentamos dados que indicam que a aproximação das cisteínas deve envolver um significativo rearranjo estrutural, que provavelmente se inicia com a formação do intermediário ácido sulfênico na cisteína peroxidásica (Cys-47). Assim, conseguimos elucidar o papel catalítico dessas proteínas, bem como identificar seus sistemas redutores, obtendo informações que podem ser relevantes para o entendimento do mecanismo da patogenicidade da X. fastidiosa. Os resultados apresentados neste trabalho podem contribuir para o desenvolvimento de novas técnicas de controle de praga para a doença CVC em citrus e outras que envolvam a bactéria X. fastidiosa. / The phytopathogenic bacterium Xylella fastidiosa is the etiological agent of Citrus Variegated Chlorosis (CVC) that causes losses of about 100 millions dollars per year in Brazil. During infection, reactive oxygen species play a central role in plant pathogen defense. To survive under oxidative stress imposed by the host, microorganisms express antioxidant proteins, including the peroxiredoxins alkyl hydroperoxide reductase subunit C (AhpC) and bacterioferritin comigratory protein (Bcp). Peroxiredoxins are peroxidases, which rely on an activated cysteine residue to catalyze the reduction of hydroperoxides. By proteome analysis, Smolka et al. (2003) identified the products of ahpc and bcp genes present in whole cell extract of X. fastidiosa. To characterize the function and structure of AhpC and Bcp protein, their genes were cloned in Escherichia coli and the corresponding proteins purified by nickel affinity chromatography. Recombinant proteins presented thiol-dependent peroxidase activity against hydrogen peroxide and organic hydroperoxides. AhpC and Bcp peroxidase activities are dependent on alkyl hydroperoxide reductase subunit F (AhpF), and on thioredoxin system, respectively. Paradoxically, AhpF flavoenzyme possesses hydrogen peroxide-forming oxidase activity. Contrary to classical assumptions, competitive kinetics employing horseradish peroxidase assays showed that the second-order rate constants of AhpC and Bcp reaction with hydrogen peroxide are in the order of 107 M-1.s-1, as fast as the activity of selenium-dependent glutathione peroxidases and catalases. Non-reducing SDS-PAGE and cysteine quantification using DTNB indicated different peroxidasic mechanisms: AhpC is a typical 2-Cys peroxiredoxin (with intermolecular disulfide bond formation), while Bcp is an atypical 2-Cys peroxiredoxin (with intramolecular disulfide bond formation). In contrast to the well-conserved AhpC cysteines responsible for the peroxidase activity (Cys-47 and Cys-165), only through site-specific mutagenesis and mass spectrometry we could identified the cysteine residues involved in the Bcp peroxidase activity (Cys-47 and Cys-83). Structural characterization by size exclusion chromatography and dynamic light scattering revealed that AhpC native protein forms stable and redox state independent decamers. The crystal structure of Bcp C47S, the first 2-Cys Prx with a 35-residue between the active cysteines ever characterized, shows that protein contains the common fold of peroxiredoxins and that active cysteines lies ~12.4 Å away one from the other. Based on circular dichroism, we presented data indicating that disulfide bond formation may require significant conformational changes, which probably is triggered by the peroxidatic cysteine oxidation to sulfenic acid. In conclusion, we elucidated the catalytic mechanisms and reduction systems of AhpC and Bcp proteins that may help to understand the pathogenicity mechanism of X. fastidiosa. These results can contribute to the development of plague control methods against X. fastidiosa.

A Xylella fastidiosa é uma bactéria gram-negativa, colonizadora do xilema e é o agente responsável por doenças em plantas cultivadas. No Brasil, a principal doença causada por esta bactéria é a CVC (Clorose Variegada dos Citros), a qual traz grandes prejuízos à produção de laranja dos estados de São Paulo e Minas Gerais. Apesar do atual controle da doença, ainda não se desenvolveu um método específico para o controle da bactéria. Durante a interação planta-patógeno ocorre uma geração exacerbada de oxidantes por parte do hospedeiro, na tentativa de eliminar o patógeno de seu organismo. Dessa forma, os patógenos são expostos a hidroperóxidos derivados de ácidos graxos, formados a partir da ação de lipoxigenases ou ainda pela reação direta de lipídeos com espécies oxidantes. Durante o processo evolutivo, foram selecionados mecanismos de defesa contra estas espécies oxidantes por parte dos patógenos. Dentre estes mecanismos, encontra-se a enzima Ohr (Organic Hydroperoxide Resistance protein), uma peroxidase baseada em resíduos de cisteínas, dependente de grupos lipoil e que possui alta atividade frente à hidroperóxidos orgânicos. Esta proteína provavelmente atua na proteção da célula bacteriana e possui algumas particularidades que fazem dela um alvo em potencial para o desenvolvimento de drogas. Os objetivos deste projeto foram caracterizar possíveis substratos fisiológicos de Ohr de X. fastidiosa, e ainda, buscar moléculas capazes de inibir a atividade peroxidásica desta enzima. Inicialmente demonstramos que Ohr é capaz de reduzir hidroperóxidos de ácido graxo com alta eficiência (kcat/KM ~ 106 M-1.s-1)e, além disso, estes hidroperóxidos são capazes de inativar Ohr em um processo dose dependente, provavelmente devido à alta afinidade entre estes e a enzima. Porém, a enzima não apresentou atividade frente à hidroperóxido de fosfolipídeo (fosfatidilcolina) e hidroperóxido de colesterol. Ademais, elucidamos a estrutura de Ohr na conformação oxidada (ponte dissulfeto), auxiliando no entendimento da dinâmica do ciclo catalítico da enzima. Por fim, selecionamos um composto capaz de inibir a atividade peroxidásica de Ohr in vitro, e temos indícios de que este é capaz de afetar o crescimento bacteriano em situação de estresse oxidativo. / Xylella fastidiosa is a gram-negative bacterium that colonizes the xylem and is the causative agent for several plant diseases. In Brazil, the main disease caused by this bacterium is the CVC (Citrus Variegated Chlorosis), which provokes large losses to the orange production in São Paulo and Minas Gerais states. Despite the current disease control, it has not been yet developed a specific method to eliminate the bacterium. During the plant-pathogen interactions, hosts produce an exacerbated amount of oxidants, in an attempt to eliminate the pathogen. Among them, fatty acids hydroperoxides are formed by the lipoxygenase action or even by the direct reaction between lipids and oxidant species. During the evolutionary process, pathogen defense mechanisms against oxidative species have evolved. Among them, Ohr (Organic Hydroperoxide Resistance protein) that is a Cys-based, lipoyl dependent peroxidase, displaying high activity towards organic hydroperoxides. This protein probably plays a central role in oxidative stress response and presnts some particularities, which make it a potential target for drug design. The objectives of this project were to characterize possible physiological substrates of Ohr from X. fastidiosa and search for molecules capable of inhibiting its peroxidase activity. Initially, we demonstrated that Ohr reduced fatty acid hydroperoxides with high efficiency (kcat/KM ~ 106 M-1.s-1). Moreover, these hydroperoxides inactivated Ohr in a dose-dependent manner, probably due to the high affinity between them and the enzyme. However, the enzyme did not display any activity towards phospholipids (posphatidilcholine) hydroperoxides and cholesterol hydroperoxide. Besides, we elucidated the structure of Ohr in the oxidized form (disulfide bond), which gave us insights on the dynamics of structural elements in the catalytic site. Ultimately, we identified a compound that was able to inhibit the peroxidase activity of Ohr in vitro, and we gained evidences that this compound can affect the bacterial growth under oxidative stress.

A Xylella fastidiosa é uma bactéria gram-negativa que infecta o xilema das plantas causando muitas vezes a maturação precoce e a diminuição dos frutos. Ela é responsável por importantes perdas na economia, no Brasil é a causadora de doenças de Citrus Variegated Chlorosis (CVC) e a da doença de Pierce nos Estados Unidos. As proteases desempenham funções vitais no ciclo de vida de muitos parasitas, muitas estão envolvidas em processos infecciosos, a Xylellaína é uma cisteíno protease que é diferentemente expressa em cepas patogênicas a não patogênica. A compreensão de seu mecanismo catalítico, através do estudo da sua estrutura e função, pode ajudar no planejamento de inibidores seletivos, potenciais agentes contra as doenças fitopatológicas ocasionadas pela X. fastidiosa. Sua estrutura molecular foi elucidada no Laboratório de Cristalografia de Proteínas e Biologia Estrutural do Instituto de Física de São Carlos (USP), estudos estruturais mostraram que a proteína se apresenta na forma de uma pró-proteína, pois está inativa devido a uma pró-região que bloqueia o sítio catalítico. Também foi verificada a presença de um nucleotídeo na estrutura da Xylellaína próximo a pró-região, como hipótese foi considerada a relação entre o nucleotídeo e o mecanismo de ativação da proteína. A influência do nucleotídeo na atividade funcional da enzima foi constatada através da comparação de ensaios enzimáticos entre a enzima nativa e mutantes. As mutações foram planejadas com a intenção de ocasionar a desestabilização do nucleotídeo, por isso foram mutados os resíduos da pró-região que interagem diretamente com o ele. As mutações foram Fenilalanina 45 (F45), Arginina 43 (R43) e F45/R43, todos os resíduos foram mutados para Alaninas (A). Os resultados mostraram que os valores de Km obtidos para a proteína nativa e suas mutantes apresentaram consideráveis alterações quando comparado entre eles, esse efeito não foi percebido para a eficiência catalítica. Conclui-se que as mutações pouco alteraram a capacidade da enzima converter o subsrato em produto, mas houve significantes alterações no reconhecimento do substrato. Esse resultado corrobora com a hipótese de que a existência do nucleotídeo está relacionada com o mecanismo de ativação da proteína. / Xylella fastidiosa is a Gram-negative bacterium which infects the plant xylem system causing in many cases precocious maturation and diminution of fruits. It is responsible for economically important plant diseases, such as the Citrus Variegated Chlorosis (CVC). Proteases might be involved in the infection process by disrupting plant tissue. Xylellain is a cysteine protease which is differently expressed in strain pathogen and non-pathogen of X. fastidiosa. The 3D structure of xylellain was solved by our group and structural studies show that this protein has a proenzyme form and a ribonucleotideo close to the amine terminal region. Our hypothesis is that protein-nucleotide interactions are related to xylellains activation mechanism. To evaluate the influence of the nucleotide in the functional activity of enzyme, point mutations in aminoacids which interact directly with this ribonucleotide were carried out. The point mutations are phenylalanine 45 (F45) and arginine 43 (R43), individually mutated for alanine (A) residues. One way to quantify the changes caused by the alteration of a nucleotide is the direct comparison between the kinetic enzyme assays of native and mutant proteins. Greater variations between the values of Km than in the values of catalytic efficiency were observed. This suggests that the speed of production varied by enzyme-substrate. However the mutations caused little change on the ability of the protease to catalyze the reaction. This result is in agreement with the hypothesis that the nucleotide provides the structural support for the hinge formation on the N-terminal domain, thus directing the inhibitory peptide inside the active site of the enzyme. Therefore, the nucleotide may be exerting regulatory functions in vivo, possibly in the folding or activation of the protein and performance of catalytic function.

Substratos alternativos têm sido usados para promover um melhor estabelecimento de plantas em viveiros, de forma a assegurar que plantas sadias sejam transferidas ao campo. No caso do Citrus spp. Esta preocupação é real pela possibilidade do campo poder apresentar um histórico de doenças na área, tal como a Clorose Variegada do Citros causada pela Xylella fastidiosa (X.f.). Este estudo avaliou a adição de vermicomposto a um substrato comercial e o desenvolvimento de plântulas de quatro variedades de citros inoculadas ou não com X.f. em condições de casa-de-vegetação, por um período de 450 dias. Medidas biométricas do crescimento da planta e o uso de indicadores do balanço nutricional usando o programa DRIS - Diagnosis and Recommendation Integrated System foram aplicadas em plantas de 9 meses de idade. As variáveis estudadas foram: substrato vermicomposto (100%, 50%, 0%) , variedade (Baia, Pêra, Natal e Escape) e inoculação (com ou sem X.f.) em um total de 24 tratamentos (variedade x substrato x inoculação), com seis repetições. Quanto ao desenvolvimento das plantas, avaliou-se o diâmetro do caule, a altura da planta, a produção de biomassas das raízes e partes aéreas, a taxa de infecção natural por fungos micorrízicos naturais do solo, a concentração de macro e micronutrientes na parte aérea. Quando se usou vermicomposto (100% or 50%), efeitos positivos foram observados nos parâmetros de desenvolvimento das plantas. Por outro lado, a infecção micorrízica e DRIS foram inversamente correlacionadas indicando estar ocorrendo um desbalanço nutricional neste estádio de desenvolvimento das plantas. Não foi observado um efeito significativo da inoculação com X.f. no desenvolvimento das plantas ou mesmo nos parâmetros biométricos, exceto para os teores foliares de nitrogênio e fósforo, onde nas plantas inoculadas o teor foliar de nitrogênio (1,46%) foi maior em relação às plantas não inoculadas (1,30%) e para fósforo ocorreu o oposto (0,32% e 0,40%, respectivamente). / Alternative substrates have being used for a better establishment of plants at nursery stages, thus ensuring that healthier plants will be transferred to the field. In the case of Citrus, this is a concern especially when there is a past history of diseases at field conditions, such as Citrus Variegated Chlorosis caused by Xylella fastidiosa (X.f.). This study evaluated the addition of vermicompost to a commercial substrate and the performance of seedlings of four citrus varieties inoculated or not with X. f. at greenhouse condition, for a period of 450 days. Biometric measurements of plant growth and nutritional balance indicators using DRIS - Diagnosis and Recommendation Integrated System were performed in 9 month-old plants. Mycorrhizal infection by native vesicular-arbuscular fungi was also evaluated in all plants. The studied variables were: vermicompost substrate (100%, 50%, 0%), variety (Baia, Pêra, Natal and Escape) and inoculation (with or without X.f.), in a total of 24 treatments (variety x substrate x inoculation) with 6 replicates each. Growth development evaluated stem diameter, plant height, shoot and root biomass accumulations, arbuscular mycorrhizal infection, and macro and micronutrient concentration in the shoot. When using vermicompost (100% or 50%), positive effects were observed in the plant growth parameters. On the other hand, mycorrhizal infection and DRIS were inversely correlated to the substrate addition, indicating that nutrient imbalances may be occurring at this plant growth stage. No significant effect of X.f. inoculation was observed on the plant growth and the biometric parameters studied, except for increased foliar nitrogen content - 1,46% for inoculated and 1,30% for uninoculated plants, and decreased foliar phosphorus content - 0,32% for inoculated and 0,40% for uninoculated plants.

Hemiptera, es el orden más grande y diverso de insectos no-holometábolos y se caracteriza por su aparto bucal sucto-picador. Auchenorrhyncha, representa un grupo diversificado de hemípteros exclusivamente fitófagos de reconocida importancia fitosanitaria. Dentro de los auquenorrincos, Cicadellidae constituye la familia más numerosa, con aproximadamente 22000 especies descriptas en el mundo. La subfamilia Cicadellinae incluye 3100 especies, es una de las más diversas en la región Neotropical y en Argentina, 90 especies se distribuyen en el norte y centro del país. Cicadellinae se divide en dos tribus, Cicadellini y Proconiini. La tribu Proconiini, de distribución americana, cuenta con aproximadamente 59 géneros y 429 especies. La identificación taxonómica de sus especies se basa principalmente en los caracteres de la genitalia masculina y las hembras son identificadas por comparación con el macho predeterminado. En Argentina, los aportes referidos a la tribu Proconiini son realmente escasos, por lo cual se propuso estudiar los géneros y especies de proconinos presentes en nuestro país, recopilar y brindar nuevos datos sobre distribución geográfica, biología, plantas huéspedes, enemigos naturales e importancia fitosanitaria para cada especie, y describir los caracteres de la genitalia femenina útiles en la identificación de especies de Proconiini. Como resultado, se cita por primera vez para la fauna argentina un género y cuatro especies de proconinos. Esto, sumado al conocimiento previo, indica que la tribu Proconiini está representada en Argentina por 18 géneros y 44 especies. Adicionalmente, se presenta una clave para la identificación de los géneros y la diagnosis de cada uno de ellos. Para cada especie estudiada, se proporciona una diagnosis y se reúne toda la información conocida. Además, se amplía el registro de distribución para 16 especies; se proporcionan nuevos datos biológicos para seis especies, nuevas asociaciones con plantas huéspedes para cuatro especies, nuevos registros de enemigos naturales para dos especies y de importancia fitosanitaria para tres especies de Proconiini. Con respecto a la identificación de los ejemplares hembra, se describen e ilustran los caracteres de la genitalia femenina de 20 especies de proconinos. Xylella fastidiosa es una bacteria fitopatógena, transmitida por auquenorrincos de las familias Cicadellidae, Cercopidae y Membracidae. En cultivos citrícolas, X. fastidiosa causa una enfermedad llamada Clorosis Variegada de los Cítricos (CVC), que afecta a todas las variedades comerciales de naranja dulce y otras especies cítricas. En Argentina, la industria citrícola se desarrolla en dos regiones: el noroeste y el noreste, siendo esta última intensamente afectada por CVC. Para realizar estrategias adecuadas de manejo y control de esta enfermedad, es necesario conocer diversos aspectos de los insectos potenciales vectores. Para ello, se propuso estudiar la diversidad y fluctuación estacional de los auquenorrincos presentes en agroecosistemas citrícolas afectados por CVC en la provincia de Entre Ríos y monitorear la presencia de sus enemigos naturales potenciales controladores biológicos. Asimismo, se propuso estudiar mediante metodología molecular la presencia de la bacteria X. fastidiosa en diferentes especies de auquenorrincos asociadas a cultivos cítricos afectados por CVC en Entre Ríos. Como resultado de los tres años de muestreo en la EEA INTA Concordia, se colectaron 6052 insectos pertenecientes a seis familias de auquenorrincos, de las cuales Cicadellidae y Membracidae fueron las más abundantes. De las 43 especies identificadas, se mencionan dos nuevas citas para Argentina, 25 nuevas citas para la provincia de Entre Ríos y 13 nuevas asociaciones con agroecosistemas citrícolas. La fluctuación estacional de las especies predominantes presentó dos aumentos poblacionales a lo largo del año, uno en los meses de verano y otro en invierno, coincidente éste último con la presencia de brotes en los cítricos. Los enemigos naturales presentes en el área estudiada fueron: el hongo Beauveria bassiana, nematodes (Mermithidae), parasitoides oófilos del género Gonatocerus (Hymenoptera: Mymaridae) y Halictophagus placula (Strepsiptera: Halictophagidae). Mediante las técnicas moleculares de PCR y qPCR, se analizaron 15 especies de auquenorrincos de las cuales 11 fueron positivas para X. fastidiosa: Bucephalogonia xanthophis (Berg), Hortensia similis (Walker), Plesiommata mollicella (Fowler), Dechacona missionum (Berg), Molomea lineiceps Young, Tapajosa rubromarginata (Signoret), Frequenamia spiniventris (Linnavuori), Scaphytopius bolivianus (Oman), Curtara samera DeLong & Freytag, Cyphonia clavigera (Fabricius) y Entylia carinata (Forster). El ensayo preliminar de transmisión, demostró que tres especies de auquenorrincos, D. missionum, C. clavigera y T. rubromarginata, fueron capaces de adquirir y transmitir la bacteria X. fastidiosa a plantas cítricas. Si bien el producto de amplificación visualizado en un gel de agarosa indicó un resultado positivo, la mala calidad de las secuencias obtenidas a partir de las plantas testeadas, obliga a repetir parte del ensayo. El conocimiento generado en este trabajo de tesis, constituye una herramienta útil para el control, prevención y/o manejo de una de las enfermedades más importantes que afectan a la producción citrícola en Argentina.

Phytopathogenic bacterium, Xylella fastidiosa, causes a number of economically important diseases, including Pierces disease (PD) of grape and bacterial leaf scorch (BLS) of a number of landscape trees. In Kentucky (KY), BLS affects a number of shade trees including many oak and maple species. In 2001, PD was diagnosed in grapevines in western KY. Xylella fastidiosa is also detected in many asymptomatic landscape plants and grasses. It was the goal of this research to identify hosts of X. fastidiosa around KY and use phylogenetic analysis to compare sequences of the 16S rDNA and gyrase B (gyrB) genes between samples. This research tests the hypothesis that sequence comparison can identify asymptomatic hosts and vectors that serve as a source of inoculum for pathogenic strains of X. fastidiosa. Plant collections were done in urban areas of KY between 2002 and 2004 and samples were tested for the presence of X. fastidiosa by ELISA and PCR. A number of symptomatic and asymptomatic plants were found to be hosts. Primer sets specifically developed for X. fastidiosa were used to amplify part of the 16S rDNA and the gyrB gene from DNA extracted directly from plant tissue. Sequence data from these specifically amplified products were assembled using Phrap, aligned with ClustalW, then phylogenetic analysis was done with Paup 4.0b10 beta. Comparisons with strains outside of Kentucky were also done using X. fastidiosa sequence obtained from NCBI. Maximum parsimony (MP) trees from the 16S rDNA showed a clade of sequence from oak and grass samples that is an outgroup to sequence from NCBI and other samples in this study. According to BLAST, sequences in this outgroup clade seem to be more closely related to the genera Xanthomonas or Stenotrophomonas than Xylella. However, the gyrB gene MP tree showed sequence from three of the samples that were part of this outgroup clade as being closely related to those X. fastidiosa sequences that are part of the ingroup of both 16S rDNA and gyrB trees. The topology difference between the 16S rDNA and gyrB trees suggest there may have been recombination in the genomic region containing one of these genes.

Made available in DSpace on 2016-06-02T20:37:48Z (GMT). No. of bitstreams: 1 5582.pdf: 5942827 bytes, checksum: 1626c0fbe2b07fcc0a332a32b90f40ee (MD5) Previous issue date: 2013-08-26 / This work describes the study of natural compounds as potential bactericides for control of Xylella fastidiosa which causes the Citrus Variegated Chlorosis (CVC), a disease that causes large losses in brazilian citrus and still does not have a bactericidal specific in the market to combat it. The project was deveped in two stages. The first part of the work was done in vitro, where the compounds naringenina complexed with rutênio and magnésio, separately, hesperidina complexed with magnésio, azadirachtina, hesperidina and naringenina were tested as inhibitors of Xylella fastidiosa growth using the system of microdilution in culture media to detect the minimal inhibitory concetration of these compounds against the bacterium Xylella fastidiosa. These compounds showed, respectively, minimum inhibitory concentrations of 0,19 µM, 0,34 µM, 1,01 µM, 2,1 µM, 3,27 µM e 7,3 µM. In a second phase, the best results obtained in vitro were validated in Vivo experiments, where the bacterium was inoculated into healthy citros plants. After a period of manifestation of disease in plants, these were diagnosed by PCR analysis to identify which plants had been contaminated by the bacterial. After detecting diseased plants through the presence of Xylella fastidiosa s DNA, they were treated with those natural componds and their derivatives that have been tested in vitro. After a period of treatement, the plants to obsorb the metabolites and acted upon these bacteria, a analysis was perfomed by quantitative PCR (qPCR) comparing the amount of bacteria in plants before and after treatment with the bactericide, evaluating the occurrence or not, of the bacterium inibition. The following results were obtained: for naringenina complexed with Mg, 0,8 µM; naringenina complexed with Ru, 1,2 µM; azadirachtina, 1,4 µM; hesperidina, 1,8 µM; naringenina 3,9 µM and cuprum (positive control), 6,3 µM, this for 0,1% of life bacteria. The in vitro results consistent with the results in vivo. / O presente trabalho descreve o estudo de compostos naturais como agentes bactericidas para o controle da bactéria Xylella fastidiosa, causadora da doença Clorose Variegada Do Citros (CVC), amarelinho . A CVC é uma doença causadora de grandes prejuízos na citricultura brasileira e que ainda não possui um produto bactericida específico no mercado para combatê-la. O projeto foi desenvolvido em duas etapas. A primeira faze do projeto foi desenvolvido com ensaios inVitro, onde os compostos naringenina complexada com rutênio e magnésio, separadamente, hesperidina complexada com magnésio, azadirachtina, hesperidina e naringenina, foram testados como inibidores de crescimento da bactéria Xylella fastidiosa, utilizando o sistema de microdiluição em caldo para detectar a concentração inibitória mínima destes compostos perante a bactéria Xylella fastidiosa. Estes compostos apresentaram, respectivamente, concentrações inibitórias mínimas de 0,19 µM, 0,34 µM, 1,01 µM, 2,1 µM, 3,27 µM e 7,3 µM. Numa segunda etapa, os melhores resultados obtidos in vitro foram validados em experimentos in Vivo, onde a bactéria foi inoculada em plantas de citros sadias. Após um período de manifestação da doença nas plantas, estas foram diagnosticadas através de análises de PCR para identificar qual das plantas havia sido efetivamente contaminada pela bactéria. Após detectar as plantas doentes, através da presença do DNA da bactéria Xylella fastidiosa, estas foram tratadas com os compostos naturais e seus derivados que foram testados in Vitro. Após um período de tratamento, para que as plantas absorvessem os metabólitos e estes atuassem sobre a bactéria, realizou-se uma análise por PCR quantitativo (qPCR) comparando a quantidade de bactéria nas plantas antes e após o tratamento com os bactericidas, avaliando a ocorrência ou não, da inibição da bactéria. Obteve-se os seguintes resultados: para naringenina complexada com Mg, 0,8 µM; naringenina complexada com Ru, 1,2 µM; azadirachtina, 1,4 µM; hesperidina, 1,8 µM; naringenina 3,9 µM e cobre (controle positivo), 6,3 µM, isto para 0,1 % de bactéria viva. Os resultados obtidos in vitro foram coerentes com os resultados in vivo.

Submitted by Marco Antônio de Ramos Chagas (mchagas@ufv.br) on 2017-05-03T10:52:19Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 3353185 bytes, checksum: 7d45eba15c5e999db5cb43513a107843 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-05-03T10:52:19Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 3353185 bytes, checksum: 7d45eba15c5e999db5cb43513a107843 (MD5) Previous issue date: 2005-05-10 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Os experimentos foram instalados em lavouras comerciais de Coffea arabica nos municípios de São Gotardo e Ervália, no Estado de Minas Gerais. As avaliações das plantas da lavoura quanto à atrofia dos ramos do cafeeiro (ARC) constaram da determinação de incidência e da severidade da doença, do crescimento dos ramos e da produção de grãos. No estudo da distribuição espacial, foram feitas análises de ordinary runs nas linhas e nas entrelinhas, da dinâmica e estrutura de focos, análise utilizando a lei de Taylor modificada e determinação de áreas isópatas. No estudo da distribuição temporal da doença, avaliou-se a incidência real e cumulativa de ARC e calculou-se a taxa de progresso da doença. Com base nas análises de ordinary runs e dinâmica e estrutura de focos, observou-se agregação das plantas doentes, mostrando que a disseminação da doença ocorreu preferencialmente nas linhas de plantio. Por meio da análise da lei de Taylor modificada, observou-se forte agregação de plantas doentes. Pela a análise de dinâmica e estrutura de focos, verificou-se que as plantas doentes apresentaram-se, inicialmente, como focos isolados e, posteriormente, com o aumento da incidência, ocorreu a coalescência delas. Os ramos sem sintomas apresentaram maior crescimento do que os com sintomas. Obteve-se relação negativa entre os valores de produção e tamanho dos grãos com a severidade da ARC. A máxima incidência de ARC ocorreu no mês de dezembro, quando a taxa de progresso da doença foi de 0,18 planta/mês, enquanto no período de inverno a incidência foi muito baixa, com taxa próxima a zero. / Field experiments were conducted at commercial coffee (Coffea arabica) areas at ‘São Gotardo” and ‘Ervália” counties at ‘Minas Gerais’ state. The assessments were done by determining the incidence, severity of Coffee Leaf Scorch (CLS), shoot growth and grain yield. On the spatial distribution study, analysis of ordinary runs, on the lines and among them, dynamic and structure of foci as well as the analysis using modified Taylor’s law were done. On temporal distribution of CLS study, the real and cumulative incidence of CLS was done and the data was used to calculate the rate of the disease progress. Based on the analysis of ordinary runs and dynamic and structure of foci, aggregation of diseased plants was observed showing that its dissemination occurred mainly on planting lines. By using the modified Taylor’s law, diseased plants were aggregated within the area containing the coffee plants. Based on the analysis of the dynamic and structure of foci, it was seem that diseased plants showed, at the beginning, isolated foci and later on, with an increase on disease incidence, they became more aggregated. Shoot with disease symptoms had greater growth compared to shoot without symptoms. There was a negative relationship between the yield and values grain size with the CLS severity. The maximum values for CLS incidence occurred on december when the rate of disease progress was 0.18 plant/month. However, on the winter time, disease incidence was lower with rate of progress close to zero. / Dissertação importada do Alexandria

Resumo: A clorose variegada dos citros causada pela bactéria Xylella fastidosa é uma das doenças bacterianas de maior importância para a citricultura brasileira. Artificialmente o agente causal da CVC pode ser transmitido por enxertia de borbulhas contaminadas, encostia de mudas infectadas e pela própria solução bacteriana através de perfurações do ramo. Já a transmissão natural ocorre por enxertia de raízes entre plantas contaminadas e por cigarrinhas das famílias Cicadellidae e Cercopidae, hoje a forma mais frequente de disseminação da X. fastidiosa . Seu manejo esta baseado em três medidas: uso de mudas sadias, poda e eliminação de plantas sintomáticas, e controle químico do vetor, que muitas vezes podem não ser eficientes. Não há descrito na literatura informações suficientes sobre cultivares de laranja doce (Citrus sinensis L. Osbeck.) tolerantes ou promissoras que possam ser utilizadas em estudos relacionados à resistência varietal, porém, estudos prévios tem apontado certa tolerância da cultivar Navelina ISA 315 à CVC. Com bases nestas informações buscou-se neste estudo quantificar o nível de tolerância da Navelina ISA 315 a CVC através da observação visual de sintomas típicos em nível de campo e casa de vegetação, presença e quantificação da X. fastidiosa via PCR e PCR quantitativo em tempo real (RT-qPCR). Os resultados obtidos confirmaram as informações preliminares de que a cultivar Navelina ISA 315 apresenta tolerância a CVC, seja pela quase ausência de sintomas e pela baixa população do patógeno observado nesta cultivar. Portanto, até o momento, a cultivar Navelina ISA 315 parece ser uma cultivar de laranja doce com tolerância satisfatória a clorose variegada dos citros / Abstract: Citrus variegated chlorosis (CVC) caused by the bacterium Xylella fastidiosa, is a bacterial disease of great importance to the Brazilian citrus industry. Causal agents for CVC can be artificially transmitted through contaminated bud grafting, approach grafting with infected nursery trees, and by injecting a bacterial solution into perforations on the branch. Natural transmission of the disease occurs with grafts from roots between infected plants and by leafhoppers of the families, Cicadellidae and Cercopidae, today the most common form of X. fastidiosa dissemination. CVC management is based on three measures: the use of healthy nursery trees, pruning and removing symptomatic plants, and chemical control of the vector, which can often be inefficient. There is little information about tolerant, or likewise promising, varieties of sweet orange (Citrus sinensis L. Osbeck) that could be used in studies related to host resistance. However, previous studies have indicated some tolerance to CVC in the Navelina ISA 315 cultivar. Based on such information, this study has sought to quantify the tolerance level that Navelina ISA 315 has to CVC through visual observation of typical symptoms in the field, in conjunction with the presence and quantification of X. fastidiosa by PCR and quantitative real time PCR (RT-qPCR). The results confirmed preliminary information that Navelina ISA 315 is tolerant to CVC, based on its near absence of symptoms and the low population of pathogen observed in this cultivar / Orientador: Eduardo Sanches Stuchi / Coorientador: Helvecio Della Coletta Filho / Banca: Antonio Baldo Geraldo Martins / Banca: Simone Rodrigues da Silva / Mestre

A Xylella fastidiosa é uma bactéria gram-negativa que infecta o xilema das plantas causando muitas vezes a maturação precoce e a diminuição dos frutos. Ela é responsável por importantes perdas na economia, no Brasil é a causadora de doenças de Citrus Variegated Chlorosis (CVC) e a da doença de Pierce nos Estados Unidos. As proteases desempenham funções vitais no ciclo de vida de muitos parasitas, muitas estão envolvidas em processos infecciosos, a Xylellaína é uma cisteíno protease que é diferentemente expressa em cepas patogênicas a não patogênica. A compreensão de seu mecanismo catalítico, através do estudo da sua estrutura e função, pode ajudar no planejamento de inibidores seletivos, potenciais agentes contra as doenças fitopatológicas ocasionadas pela X. fastidiosa. Sua estrutura molecular foi elucidada no Laboratório de Cristalografia de Proteínas e Biologia Estrutural do Instituto de Física de São Carlos (USP), estudos estruturais mostraram que a proteína se apresenta na forma de uma pró-proteína, pois está inativa devido a uma pró-região que bloqueia o sítio catalítico. Também foi verificada a presença de um nucleotídeo na estrutura da Xylellaína próximo a pró-região, como hipótese foi considerada a relação entre o nucleotídeo e o mecanismo de ativação da proteína. A influência do nucleotídeo na atividade funcional da enzima foi constatada através da comparação de ensaios enzimáticos entre a enzima nativa e mutantes. As mutações foram planejadas com a intenção de ocasionar a desestabilização do nucleotídeo, por isso foram mutados os resíduos da pró-região que interagem diretamente com o ele. As mutações foram Fenilalanina 45 (F45), Arginina 43 (R43) e F45/R43, todos os resíduos foram mutados para Alaninas (A). Os resultados mostraram que os valores de Km obtidos para a proteína nativa e suas mutantes apresentaram consideráveis alterações quando comparado entre eles, esse efeito não foi percebido para a eficiência catalítica. Conclui-se que as mutações pouco alteraram a capacidade da enzima converter o subsrato em produto, mas houve significantes alterações no reconhecimento do substrato. Esse resultado corrobora com a hipótese de que a existência do nucleotídeo está relacionada com o mecanismo de ativação da proteína. / Xylella fastidiosa is a Gram-negative bacterium which infects the plant xylem system causing in many cases precocious maturation and diminution of fruits. It is responsible for economically important plant diseases, such as the Citrus Variegated Chlorosis (CVC). Proteases might be involved in the infection process by disrupting plant tissue. Xylellain is a cysteine protease which is differently expressed in strain pathogen and non-pathogen of X. fastidiosa. The 3D structure of xylellain was solved by our group and structural studies show that this protein has a proenzyme form and a ribonucleotideo close to the amine terminal region. Our hypothesis is that protein-nucleotide interactions are related to xylellains activation mechanism. To evaluate the influence of the nucleotide in the functional activity of enzyme, point mutations in aminoacids which interact directly with this ribonucleotide were carried out. The point mutations are phenylalanine 45 (F45) and arginine 43 (R43), individually mutated for alanine (A) residues. One way to quantify the changes caused by the alteration of a nucleotide is the direct comparison between the kinetic enzyme assays of native and mutant proteins. Greater variations between the values of Km than in the values of catalytic efficiency were observed. This suggests that the speed of production varied by enzyme-substrate. However the mutations caused little change on the ability of the protease to catalyze the reaction. This result is in agreement with the hypothesis that the nucleotide provides the structural support for the hinge formation on the N-terminal domain, thus directing the inhibitory peptide inside the active site of the enzyme. Therefore, the nucleotide may be exerting regulatory functions in vivo, possibly in the folding or activation of the protein and performance of catalytic function.