Orientador: Mônica Alonso Cotta / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Física Gleb Wataghin / Made available in DSpace on 2018-08-18T17:58:13Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Lorite_GabrielaSimone_D.pdf: 14464970 bytes, checksum: f2238701a88fbbba91e337eda7db2965 (MD5) Previous issue date: 2011 / Resumo: Apresentamos nesta tese uma investigação dos processos físico-químicos da adesão e desenvolvimento de biofilmes da bactéria fitopatogênica Xylella fastidiosa (Xf) em diferentes superfícies. Este estudo visa corroborar ou complementar diferentes aspectos dos modelos atualmente em discussão para biofilmes bacterianos, além de, num caráter tecnológico, fornecer subsídios para um eventual controle da formação dos biofilmes de Xf. Para isso utilizamos uma abordagem diferenciada à comumente empregada em biologia - e mais próxima à ciência dos materiais - visando isolar e quantificar a relevância dos parâmetros que contribuem na formação de um biofilme em diferentes superfícies, tentando aproximá-las do xilema da planta. Nossos resultados mostram uma semelhança de desenvolvimento (forma, tamanho e quantidade) nos biofilmes de Xf cultivados em superfícies de vidro e Si, e um melhor desenvolvimento dos biofilmes em Si do que nas superfícies de etil celulose, EC, e acetato de celulose, AC. De um ponto de vista fenomenológico, os biofilmes apresentam diferentes estruturas, taxa de desenvolvimento e tendências na expressão gênica entre superfícies com e sem presença de celulose derivatizada. Na caracterização das superfícies utilizadas consideramos o efeito do meio de cultura em suas propriedades. Nas superfícies de vidro e Si, constatamos a formação de um filme condicionante devido à adsorção dos constituintes deste meio. O grau de hidrofobicidade das superfícies de vidro e Si diminui significativamente após contato com o meio de cultura enquanto as superfícies de celulose derivatizada apresentam pouca (EC) ou nenhuma alteração (AC); observamos também um aumento do potencial de superfície (PS) para Si e EC e, ainda, uma diminuição de PS em AC. Estas evidências sugerem uma correlação entre PS mais altos e grau de hidrofobicidade baixos com a presença de biofilmes de Xf em maior número e tamanho. Além disso, medidas de espectroscopia de força utilizando ponta funcionalizada com a proteína de adesão XadA1 evidenciam também um comportamento distinto na superfície de AC. Estes resultados apontam para a importância da interação eletrostática no processo inicial de adesão da bactérias às superfícies estudadas. Por fim, a presença de material extracelular ao redor dos biofilmes e células de Xf em superfícies de vidro e Si foi observada indicando a presença de uma matriz exopolimérica protetora. Espectroscopia de infravermelho mostra a presença de polissacarídeos ¿ constituinte da matriz polimérica ¿ desde o estágio inicial de formação do biofilme, indicando uma possível contribuição dessa matriz para o processo de adesão que precede o desenvolvimento do biofilme / Abstract: In this work, we report an investigation on relevant physicochemical processes of bacterial surface adhesion and biofilm development for the phytopathogen Xylella fastidiosa (Xf) on different surfaces. This study aims to corroborate or supplement different aspects of the bacterial biofilms models currently under discussion and, in a technological point of view, provides experimental input for an eventual control of Xf biofilm formation. For this purpose, we have used an approach not commonly found in biology ¿ and more similar to materials science ¿ in order to isolate and quantify the relevance of the parameters that contribute to the formation of a biofilm on different surfaces, as well as trying to make these surfaces closer to the plant xylem. Our results show a similar development (shape, size and quantity) for Xf biofilms grown on Si and glass surfaces, and an improved development of biofilms grown on Si than on ethyl cellulose, EC, and cellulose acetate, AC. Under a phenomenological point of view, biofilms present different structures, rate of development and trends in gene expression between surfaces with and without the presence of derivatized cellulose. In order to characterize the surfaces, we considered the effect of culture medium on their properties. In Si and glass surfaces, we observe the formation of a conditioning film due to adsorption of the constituents of the culture medium. The degree of hydrophobicity of glass and Si surfaces decreases significantly after contact with this medium. On the other hand, cellulose derivatized surfaces present lower (EC) or no (AC) modifications of this property. In addition, we observed an increase in the surface potential (SP) for Si and EC and also a SP decrease for AC. These evidences suggest a correlation between higher SP values and lower degree of hydrophobicity with the presence of biofilms of Xf in larger numbers and size. Furthermore, force spectroscopy measurements using a functionalized tip with the adhesion protein XadA1 also show a different behavior on the AC surface. These results reveal the importance of electrostatic interaction in the initial bacterial adhesion for the surfaces studied here. Finally, the presence of extracellular material around the Xf cells and biofilms on glass and Si surfaces was observed indicating the presence of a protective exopolymeric matrix. Infrared spectroscopy shows the presence of polysaccharides - a constituent of the polymeric matrix - from the very initial stages of biofilm formation, indicating a possible contribution of this matrix for the adhesion process which precedes biofilm development / Doutorado / Biofísica / Doutora em Ciências

A Escaldadura das Folhas da Ameixeira é o principal problema fitossanitário para a produção de ameixas no Brasil. A doença é causada pela bactéria Xylella fastidiosa, transmitida por cigarrinhas (Hemiptera: Cicadellidae, Cicadellinae). Neste trabalho foi realizado o levantamento, análise faunística e a flutuação populacional de Cicadellinae em pomares de ameixeira localizados nos Estados do Rio Grande do Sul (RS) e São Paulo (SP). A captura das cigarrinhas foi realizada com cartões adesivos amarelos (8,5 x 11,5 cm) em dois pomares de ameixeira de cada estado, localizados nos municípios de Paranapanema (SP) e Bento Gonçalves e Farroupilha (RS). Em cada pomar, foram instalados 20 cartões, distribuídos em 10 pontos espaçados 35 x 35 m, com duas alturas de amostragem (0,5 e 1,7m acima do nível do solo). Os cartões adesivos foram trocados quinzenalmente no período de setembro de 2006 a setembro de 2008. Com base na análise faunística, as espécies de cigarrinhas mais abundantes, constantes, freqüentes e dominantes foram analisadas para se conhecer a sua flutuação populacional. Nos dois pomares do RS foram coletados 1103 indivíduos de Cicadellinae distribuídos em 27 espécies. Destas, Erythrogonia dorsalis (Signoret, 1853), Sibovia sagata (Signoret,1854), Spinagonalia rubrovittata Cavichioli, 2008, Macugonalia cavifrons Stål, 1862, Dilobopterus dispar (Germar, 1821), Bucephalogonia xanthophis (Berg, 1879) e Molomea lineiceps Young, 1968 foram predominantes. Em SP, foram coletados 293 cicadelíneos, distribuídos em 10 espécies, sendo Oncometopia facialis (Signoret, 1854) e Molomea consolida Schröder, 1959 predominantes. Verificou-se uma menor diversidade e abundância de espécies de Cicadellinae nos pomares localizados em SP quando comparados com os pomares do RS. A distribuição populacional das espécies predominantes nos pomares do RS concentrou-se nos meses de janeiro a março, e em SP, de outubro a janeiro, correspondendo aos períodos de colheita e póscolheita em ambas as regiões. Os menores índices de captura de cicadelíneos foram obtidos nos meses de entressafra em todos os pomares amostrados. / The plum leaf scald (PLF) is a major threat for plum production in Brazil. PLF is caused by the bacteria Xylella fastidiosa which is transmitted by sharpshooter leafhoppers (Hemiptera: Cicadellidae, Cicadellinae). In this investigation, we surveyed the Cicadellinae species associated with plum orchards located in Rio Grande do Sul (RS) and São Paulo (SP) states, Brazil, in order to identify potential vectors of X. fastidiosa in these regions. We also studied the seasonal fluctuation of predominant species determined by faunistic analysis. In each area, adult sharpshooters were sampled using yellow sticky cards (8,5 x 11,5 cm) in two orchards in Paranapanema (SP) and one in Bento Gonçalves and Farroupilha (RS), respectivelly. In all orchards, traps were spaced 35 m apart in 10 sample units. Vertical distribution was also evaluated by placing cards at 0.5 and 1.7 m above soil level in each sample unit. The survey was conducted during two years from September 2006 to September 2008, by removing sticky cards fortnightly. In plum orchards located in RS state, we collected a total of 1103 specimens of 27 sharpshooter species. Erythrogonia dorsalis (Signoret, 1853), Sibovia sagata (Signoret,1854), Spinagonalia rubrovittata Cavichioli, 2008, Macugonalia cavifrons Stål, 1862, Dilobopterus dispar (Germar, 1821), Bucephalogonia xanthophis (Berg, 1879) and Molomea lineiceps Young, 1968 were predominant in these orchards. We collected 293 individuals of 10 sharpshooter species in SP state, where Oncometopia facialis (Signoret, 1854) and Molomea consolida Schröder, 1959 were predominant. We found a lower diversity and abundance of Cicadellinae species in plum orchards located in SP when compared to RS state. The predominant species were more abundant from January to March in RS and, from October to January in SP, corresponding to plum harvest and pos-harvest periods in both regions. The lowest population of sharpshooters in plum orchards was observed during the plant dormancy period.

Made available in DSpace on 2017-07-24T19:38:08Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Agnes Thiane.pdf: 3586857 bytes, checksum: 523f528a78c1439ce6c21cb3ef1c1c69 (MD5) Previous issue date: 2013-03-12 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / This dissertation presents the processing of seven image datasets and the determination and refinement of two protein structures of Sure (stationary phase survival protein E)from Xylella fastidiosa(XfSurE). The crystals were obtained by the research groupof Prof.Dr.RicardoApariciowith theprotein produced by the group of Profa. Dra.Anete Pereira de Souza, both from the State University of Campinas.Xylella fastidiosa strain 9a5c is aplague bacterium that causes a disease called Citrus Variegated Chlorosis (CVC) in orange grove; itwas the first bacterium to have its genome completely sequenced in Brazil. Studies show that this protein has several functions, amongst them, of a nucleotidase able to dephosphorylate various ribo anddeoxyribonucleic 5-monophosphates and ribonucleoside 3-monophosphatesto inorganic phosphate and nucleosides. Seven different sets of diffraction images were processed,four of them presented rings from ice diffraction. All structures have space group C2, but there are four different unit cells.Molecular replacement was performed with Phaser program and only two sets of images had their three-dimensional structures refined in an iterative process with the programs Coot and Phenix, which were subsequently largely validated. One of them shows a tetramer and the other a dimer in the asymmetric unit. During refinement, Mn+2, I- and PO43-ions were modeled. Comparisons between XfSurE and CbSurE (the correspondent protein fromCoxiella burnetti) indicate that XfSurE isin open conformation, unlike CbSurE. The protein shows the characteristic Rossmann fold-like, with the tetramerizationloop and C-terminal projection into the counter-monomer. / No presente trabalho realizaram-se o processamento de sete conjuntos de imagens e a determinação e refinamento de duas estruturas da proteína SurE (stationaryphasesurvivalprotein E) de Xylella fastidiosa (XfSurE). Os cristais foram obtidos pelo grupo de pesquisa do Prof. Dr. Ricardo Aparicio a partir da proteína produzida pelo grupo da Profa. Dra. Anete Pereira de Souza, ambos da Universidade Estadual de Campinas. XfSurElinhagem 9a5c é uma bactéria praga que causa uma enfermidade chamada Clorose Variegada dos Citros (CVC), grave em laranjeiras; foi à primeira bactéria que teve seu genoma completamente sequenciado no Brasil. Estudos revelam que essa proteína apresenta várias funções, dentre elas, de nucleotidase, capaz de desfosforilar vários ribo e desoxirribonucleicos 5-monofosfatados e ribonucleosídios 3-monofosfatos em fosfato inorgânico e nucloesídios.Dos sete conjuntos, quatro apresentaram anéis de difração por gelo no padrão de difração. Todas as estruturas apresentam grupo de espaço C2, mas há quatro celas unitárias diferentes A substituição molecular foi realizada com o programa Phaser e apenas dois conjuntos de imagens tiveram suas estruturas tridimensionais refinadas em um processo iterativo com os programas Coot e Phenix, queforam posteriormente amplamente validadas. Uma apresenta um tetrâmero e a outra um dímero na unidade assimétrica. Durante o refinamento, modelaram-seíons Mn2+, I- e PO43-. Comparações entre a XfSurE e CbSurE (a correspondente de Coxiella burnetti) indicamque XfSurE está em conformação aberta, ao contrário de CbSurE. A proteína apresenta o enovelamento característico deRossmann-fold-like, com as alças de tetramerização e com projeção de C-terminal no contra-monômero.

Resumo: Foi construído um microarranjo com as 2600 ORFs identificadas no projeto de sequenciamento da bactéria Xylella fastidiosa estirpe 9a5c, e utilizado para analisar diferenças na expressão gênica global da bactéria dentro de uma laranja doce suscetível (Pera) e uma tolerante (cultivar Navelina ISA 315). Foram achados mais genes diferencialmente expressos envolvidos na degradação, reguladores, componentes de membrana, adesinas tipo fímbrias, transportadores, elementos genéticos móveis e genes de patogenicidade na variedade sintomática. Assim, na cultivar Navelina ISA 315, foram diferencialmente expressos mais genes relacionados com a resposta ao estresse, seja detoxificação de espécies reativas do oxigênio ou proteínas chaperonas, assim como uma adesina do tipo hemaglutinina. Isso sugere diferenças na agregação celular e composição do biofilme assim como um maior estresse da bactéria na cultivar tolerante, provocado pelas próprias defesas da planta ou por microrganismos endofíticos que estão competindo com a X. fastidiosa. A técnica de microarranjos foi validada pela RT-qPCR, e apresentou-se como uma ferramenta poderosa na análise das mudanças na expressão gênica da bactéria X. fastidiosa em plantas de laranja doce in vivo, apresentando uma visão mais real da natureza do que os sistemas in vitro, que não a conseguem imitar completamente. Foram levantadas neste trabalho algumas hipóteses sobre os mecanismos de patogenicidade mas no entanto, mais pesquisas ainda são necessárias para lograr melhor compreensão dos mecanismos de patogenicidade e das interações patógeno-hospedeiro / Abstract: A DNA microarray was constructed containing 2600 ORFs identified by the Genome sequencing project of Xylella fastidiosa 9a5c strain, and used to check global gene expression differences in the bacteria within a susceptible and a tolerant sweet orange plant, the variety Pera and the cultivar Navelina ISA 315, respectively. More genes related to degradation, regulation, membrane components, fimbrial adhesins, transport, genetic mobile elements and patogenicity genes were differentially expressed in Pera variety. On the other hand, in the cultivar Navelina ISA 315, more genes related to stress response, detoxification of oxygen reactive species or other substances, "heat shock" proteins, as well as an adhesin of the hemagglutinin type, suggesting differences in cellular aggregation and biofilm composition, as well as a higher estress of the bacteria in tolerant cultivar, produced either by plant defenses or by endophitic microorganisms which are competing with X. fastidiosa. This "handmade" DNA microchip was validated by RT-qPCR, and has revealed as a powerful technique for the analysis of global changes in gene expression of X. fastidiosa in sweet orange plants in vivo, generating a more real image of what is happening in nature than in vitro systems which would never reproduce nature conditions exactly. Some hypotheses were raised in this study about patogenicity mechanisms, therefore, more research is still necessary to achieve a better understanding of pathogenicity mechanisms and host-pathogen interactions / Orientador: Eliana Gertrudes de Macedo Lemos / Coorientador: Jackson Antonio Marcondes de Souza / Banca: Marcos Antonio Machado / Banca: Marcelo Luiz de Laia / Banca: Jesus Aparecido Ferro / Banca: Lucia Maria Carareto Alves / Doutor

Pierce s Disease (PD) of grapevines is caused by the bacterium Xylella fastidiosa (Xf), a xylem-limited gamma-proteobacterium that is responsible for several economically important diseases in many plants. A characteristic symptom of PD is leaf scorching, with regions of chlorosis progressing into necrotic zones at the peripheral margins of infected leaves. The occlusion of xylem elements and interference with water transport by Xf and its associated biofilm have been hypothesized as the main cause of PD symptom development; however, Xf virulence mechanism has not been elucidated. The analysis of Xf Temecula 1 secretome revealed a putative lipase/esterase (PD1703) that was abundantly secreted in the bacterial culture supernatant, and was characterized as a protein ortholog of the cell wall degrading enzyme LipA of Xanthomonas strains. The LipA was secreted and associated with a biofilm filamentous network and additional proteomic analysis revealed its abundant presence in outer membrane vesicles (OMVs). Accumulation of LipA in leaf regions was positively associated with PD symptoms and inversely correlated with bacterial titer. The lipase/esterase was found to elicit a hypersensitive response in grapevine and was regulated by quorum-sensing signaling, which is known to modulate bacterial pathogenesis. We propose that Xff pathogenesis is caused by LipA secretion mediated by OMV cargos, and its release and accumulation in leaf margins leads to the observed PD symptoms development. / A Doença de Pierce (PD) em videiras (Vitis vinifera L.) é causada pela bactéria Xylella fastidiosa (Xf), uma gama-proteobactéria responsável por diversas doenças em plantas economicamente importantes. Um sintoma característico da PD é a queimadura, caracterizado por zonas de clorose progredindo em necrose nas margens da lâmina foliar. O processo resultante da oclusão dos elementos do xilema por células bacterianas e pelo biofilme associados às mesmas, bem como o consequente bloqueio do fluxo da seiva, têm sido hipotetizado como a principal causa dos sintomas comumente observados na PD. Embora tal hipótese seja suportada por algumas evidências, o mecanismo de virulência de Xf não foi totalmente compreendido. A análise do secretoma de Xf Temecula 1 revelou que uma lipase/esterase (PD1703) é abundantemente secretada in vitro. Esta proteína foi caracterizada como ortóloga à proteína LipA presente em bactérias do grupo das Xanthomonas e funcionalmente caracterizada como degradante da parede celular neste grupo. A proteína LipA foi associada à matriz extracelular filamentosa e análises proteômicas adicionais revelaram sua presença nas vesículas de membrana externa. O acúmulo da proteína LipA em folhas de plantas infectadas foi positivamente associado aos sintomas da PD e inversamente correlacionado com o título bacteriano. LipA induziu resposta de hipersensibilidade em videiras e foi regulada por sinalização célula-célula, mecanismo conhecido por modular a patogênese bacteriana. Com base em tais evidências, propomos que a secreção da proteína LipA mediada pelas vesículas de membrana externa e sua liberação e acúmulo em margens foliares, onde leva ao desenvolvimento dos sintomas comumente observados na doença, seja um mecanismo essencial à patogênese de X. fastidiosa na PD. / Doutor em Genética e Bioquímica

A Escaldadura das Folhas da Ameixeira é o principal problema fitossanitário para a produção de ameixas no Brasil. A doença é causada pela bactéria Xylella fastidiosa, transmitida por cigarrinhas (Hemiptera: Cicadellidae, Cicadellinae). Neste trabalho foi realizado o levantamento, análise faunística e a flutuação populacional de Cicadellinae em pomares de ameixeira localizados nos Estados do Rio Grande do Sul (RS) e São Paulo (SP). A captura das cigarrinhas foi realizada com cartões adesivos amarelos (8,5 x 11,5 cm) em dois pomares de ameixeira de cada estado, localizados nos municípios de Paranapanema (SP) e Bento Gonçalves e Farroupilha (RS). Em cada pomar, foram instalados 20 cartões, distribuídos em 10 pontos espaçados 35 x 35 m, com duas alturas de amostragem (0,5 e 1,7m acima do nível do solo). Os cartões adesivos foram trocados quinzenalmente no período de setembro de 2006 a setembro de 2008. Com base na análise faunística, as espécies de cigarrinhas mais abundantes, constantes, freqüentes e dominantes foram analisadas para se conhecer a sua flutuação populacional. Nos dois pomares do RS foram coletados 1103 indivíduos de Cicadellinae distribuídos em 27 espécies. Destas, Erythrogonia dorsalis (Signoret, 1853), Sibovia sagata (Signoret,1854), Spinagonalia rubrovittata Cavichioli, 2008, Macugonalia cavifrons Stål, 1862, Dilobopterus dispar (Germar, 1821), Bucephalogonia xanthophis (Berg, 1879) e Molomea lineiceps Young, 1968 foram predominantes. Em SP, foram coletados 293 cicadelíneos, distribuídos em 10 espécies, sendo Oncometopia facialis (Signoret, 1854) e Molomea consolida Schröder, 1959 predominantes. Verificou-se uma menor diversidade e abundância de espécies de Cicadellinae nos pomares localizados em SP quando comparados com os pomares do RS. A distribuição populacional das espécies predominantes nos pomares do RS concentrou-se nos meses de janeiro a março, e em SP, de outubro a janeiro, correspondendo aos períodos de colheita e póscolheita em ambas as regiões. Os menores índices de captura de cicadelíneos foram obtidos nos meses de entressafra em todos os pomares amostrados. / The plum leaf scald (PLF) is a major threat for plum production in Brazil. PLF is caused by the bacteria Xylella fastidiosa which is transmitted by sharpshooter leafhoppers (Hemiptera: Cicadellidae, Cicadellinae). In this investigation, we surveyed the Cicadellinae species associated with plum orchards located in Rio Grande do Sul (RS) and São Paulo (SP) states, Brazil, in order to identify potential vectors of X. fastidiosa in these regions. We also studied the seasonal fluctuation of predominant species determined by faunistic analysis. In each area, adult sharpshooters were sampled using yellow sticky cards (8,5 x 11,5 cm) in two orchards in Paranapanema (SP) and one in Bento Gonçalves and Farroupilha (RS), respectivelly. In all orchards, traps were spaced 35 m apart in 10 sample units. Vertical distribution was also evaluated by placing cards at 0.5 and 1.7 m above soil level in each sample unit. The survey was conducted during two years from September 2006 to September 2008, by removing sticky cards fortnightly. In plum orchards located in RS state, we collected a total of 1103 specimens of 27 sharpshooter species. Erythrogonia dorsalis (Signoret, 1853), Sibovia sagata (Signoret,1854), Spinagonalia rubrovittata Cavichioli, 2008, Macugonalia cavifrons Stål, 1862, Dilobopterus dispar (Germar, 1821), Bucephalogonia xanthophis (Berg, 1879) and Molomea lineiceps Young, 1968 were predominant in these orchards. We collected 293 individuals of 10 sharpshooter species in SP state, where Oncometopia facialis (Signoret, 1854) and Molomea consolida Schröder, 1959 were predominant. We found a lower diversity and abundance of Cicadellinae species in plum orchards located in SP when compared to RS state. The predominant species were more abundant from January to March in RS and, from October to January in SP, corresponding to plum harvest and pos-harvest periods in both regions. The lowest population of sharpshooters in plum orchards was observed during the plant dormancy period.

Orientador: Anete Pereira de Souza / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-10T10:23:34Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Soares_JoseSergiodeMacedo_M.pdf: 3092877 bytes, checksum: 85276ce21b221869d2fb74dc6cef8444 (MD5) Previous issue date: 2007 / Resumo: O fitopatogeno Xylella fastidiosa é uma bactéria limitada ao xilema que causa uma variedade de doenças economicamente importantes em plantas, incluindo uma doença chamada Clorose Variegada de Citrus (CVC). Recentemente, os dados de sequenciamento do DNA fornecidos pelo projeto genoma da Xylella fastidiosa permitiram uma aproximação da área genoma funcional para investigar a função de diversas proteínas baseadas na informação sobre suas estruturas. Avanços recentes na área genoma estrutural não somente nos ajudou a compreender funções da proteína, mas também causou um grande impacto na indústria farmacêutica. Nos últimos anos, o uso da informação estrutural de proteínas na pesquisa de descoberta de novas drogas tem amadurecido, e é usado agora em todos os níveis, variando da identificação e da seleção de alvos do genoma a candidatos apropriados. Esta emergente área é poderoso meio para compreender mais profundamente os mecanismos a patogenicidade da bactéria. Este trabalho visa adicionar novas informações sobre proteínas que podem ser relacionadas a patogenicidade de Xylella fastidiosa, necessárias para o desenvolvimento de novos métodos de combate à CVC. A fim de recolher informações sobre as proteínas envolvidas nos mecanismos do patogenicidade da bactéria, nós escolhemos as orf xf2148 e orf xf1524 de Xylella fastidiosa para estudos de caracterização. A orf xf2148, apresenta 47% de similaridade com o gene ksgA de Escherichia coli. O gene ksgA codifica uma Dimetiladenosina transferase da classe de proteínas metiltransferases. Já a orf xf1524, apresenta 55% de similaridade com o gene xpsL de Xanthomonas campestris, que codifica uma proteína transmembrana da via de secreção do tipo II. Ambas as proteínas foram clonadas no vetor pET32Xa/LIC e expressas na bactéria Escherichia coli linhagem BL21(DE3). A proteína XPSL foi purificada através de uma cromatografia de afinidade (IMAC) e teve sua identidade determinada por SDS-PAGE e Espectrometria de Massas (MALDITOF). Para investigar a integridade estrutural da proteína XPSL purificada, a técnica espectroscópica de Dicroísmo Circular (CD) foi realizada. O espectro de CD da proteína XPSL mostrou sinais predominantemente de 'alfa'hélices indicando um perfil de estrutura secundária devidamente enovelada viável para estudos estruturais e funcionais. A proteína XF2148, expressa em sua forma insolúvel, foi resolubilizada usando 8M de uréia como agente desnaturante. A proteína foi purificada através de uma cromatografia de troca iônica e sua pureza e identidade verificadas por SDS-PAGE e Espectrometria de Massas (MALDI-TOF). Seu correto enovelamento por espectroscopia de Dicroísmo Circular (CD) indicou uma composição predominantemente de 'alfa'hélices. O alinhamento da seqüência primária e modelagem por homologia da proteína XF2148 com uma proteína de estrutura tridimensional resolvida, KsgA de E. coli, revelaram um local da molécula que envolve resíduos altamente conservados no domínio C-terminal e cinco dos oito motivos estruturais encontrados geralmente em Metiltransferases / Abstract: The phytopathogen Xylella fastidiosa is a xylem-limited bacterium that causes a range of economically important plant diseases, including a serious disease of orange trees called citrus variegated chlorosis (CVC). Recently, DNA sequence data provided by the Xylella fastidiosa Brazilian genome project have allowed a functional genomic approach to investigate the function of several proteins based on the information about their structures. Recent advances in structural genomics not only help us to understand protein functions but also have a big impact on the pharmaceutical industry. In the last few years, the use of protein structural information in drug discovery research has matured, and it is now used at all levels, ranging from genomics target identification and selection to the final design of suitable drug candidates. This emergent area is a powerful means to more deeply understand the mechanisms of the bacterium pathogenicity. This work aims at adding new information on proteins that may be related to the X. fastidiosa pathogenesis, necessary for new approaches towards the combat of CVC. In order to gather information about the proteins involved in the mechanisms of the bacterium pathogenicity, we chose orf xf2148 and orf xf1524 from Xylella fastidiosa for characterization studies. Orf xf2148, presents 47% of similarity with the gene ksgA of Escherichia coli. The ksgA gene encodes a dimethyladenosine transferase from the methyl transferase proteins class. On the other hand orf xf1524, presents 55% of similarity with the xpsL gene of Xanthomonas campestris, which encodes a transmembrane protein of the type II secretion machinary. Both proteins were cloned into the pET32Xa/LIC vector to overexpress the protein in Escherichia coli BL21(DE3). The expressed XpsL protein was purified by immobilized metal affinity chromatography (IMAC) and had its identity determined by SDS-PAGE and Mass Spectrometry (MALDI-TOF). To investigate the structural integrity of the purified XPSL, the protein was analyzed by Circular Dichroism (CD) spectroscopy. The XpsL CD spectrum showed that it contains predominantly signal of 'alfa'helices suggesting that the XpsL recombinant protein maintains secondary structures, is viable to functional and structural studies and remained folded. The XF2148 protein was expressed in the insoluble form and refolded using 8M Urea as denaturating agent. The protein was purified in one step by cation-exchange chromatography and its purity and identity were verified by SDS-PAGE and Mass Spectrometry (MALDI-TOF). Its correct folding was verified by Circular Dichroism Spectroscopy analysis that indicated a secondary structure composed mainly of 'alfa'helices. The alignment of the XF2148 primary sequence and homology modeling with one ksgA structure solved protein from E. coli, revealed a site involving highly conserved residues in the C-terminal domain and five of the eight structural motifs usually found in AdoMetdependent methyltransferases / Mestrado / Genetica de Microorganismos / Mestre em Genética e Biologia Molecular

Orientador: Celso Eduardo Benedetti / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-11T01:25:29Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Barbosa_RosiclerLazaro_D.pdf: 3769373 bytes, checksum: ba15f76eb9d63f64834d030ffed2482a (MD5) Previous issue date: 2008 / Resumo: O gene XF0767 de Xylella fastidiosa está localizado num operon composto por mais quatro genes classificados como proteínas hipotéticas (XF0768-XF0767-XF0766-XF0765-XF0764). Este operon está conservado em uma série de bactérias associadas a plantas, incluindo Agrobacterium tumefaciens, Mezorhizobium loti e Sinorhizobium meliloti. A região upstream ao códon de iniciação deste operon possui seqüências canônicas correspondentes a sítios -35 e ¿10 de regiões promotoras reguladas por fatores sigma70. O objetivo deste trabalho foi caracterizar o sistema de regulação do operon pela proteína XF0767, nomeada BigR (biofilm growth-associated repressor), visando à compreensão deste sistema e sua importância para a bactéria. A proteína BigR se liga na seqüência repetida invertida (9-4-9) localizada na região ¿10 do promotor do operon XF0768-0764, denominada BigRbox. BigR inibe a atividade do operon reprimindo a expressão do gene repórter GFP em Escherichia coli, Agrobacterium tumefaciens e Xylella fastidiosa. Mutações no BigRbox dos promotores de Xylella e Agrobacterium afetam a ligação do repressor e abole a transcrição do gene repórter. Esses dados indicam, portanto, que BigR compete com a RNA polimerase pelo mesmo sítio de ligação ao DNA, revelando assim o mecanismo de regulação do operon. BigR apresenta similaridade com fatores transcricionais de bactérias contendo domínio HTH (helix-turn-helix) de ligação ao DNA. Apesar de BigR ter sido inicialmente classificada como uma proteína da família SmtB/ArsR, as quais regulam operons relacionados à resistência a metais, nossos dados indicam que BigR não atua como sensor de metal. A adição de cádmio, ferro e cobre na mistura de ligação causam uma aparente dissociação do complexo DNA/BigR, entretanto, estudos in vivo na presença de metais não evidenciaram nenhuma alteração na expressão do gene repórter. Mutantes deficientes em BigR também não apresentam diferença de crescimento na presença de metais. O gene XF0768 codifica uma proteína nomeada BLH (beta-lactamase-like hydrolase) por pertencer à superfamília das metalo-beta-lactamases. Dada a presença de BigR e BLH no operon de Xylella e Agrobacterium, a atividade do operon foi analisada em diferentes condições como crescimento das células repórter in planta, co-cultivo com bactérias endofíticas e deficiência nutricional. Entretanto, uma maior atividade do operon em Xylella e Agrobacterium foi detectada apenas na condição de biofilme. Células de Agrobacterium aderidas em raiz de tabaco também apresentaram maior expressão do gene repórter quando comparadas às células em suspensão. Mutantes de Agrobacterium deficientes em BigR (bigR-) apresentam maior expressão do gene repórter, confirmando que BigR age como o repressor transcricional do operon. A quantificação da formação de biofilme das células mutante e selvagem revelou uma maior densidade de biofilme no mutante bigR- em superfície de vidro e também maior quantidade de células aderidas em raiz de tabaco, indicando que o operon pode estar envolvido com o processo de adesão ou desenvolvimento do biofilme bacteriano. Do ponto de vista estrutural, foi mostrado que a proteína BigR truncada no N-terminal (?BigR) encontra-se estruturada na forma de trímero, diferindo do observado para as proteínas com domínio HTH que em geral formam dímeros e monômeros. BigR é estável termicamente, começando a perder estrutura à 74oC, mas retendo um sinal residual de a-hélice até 90oC. Tratamentos com altas concentrações de (NH4) SO 2 4 interferiram na ligação da proteína ao DNA alvo e no conteúdo de estrutura secundária sem alterar, contudo, sua estabilidade térmica. A purificação e cristalização da proteína ?BigR resultou na coleta de alguns conjuntos de dados da proteína nativa e derivada, através de soaking ou marcada com SeMet. Apesar dos dados obtidos serem de boa qualidade, até o momento, não foi possível a resolução da estrutura cristalográfica desta proteína / Abstract: The XF0767 gene from Xylella fastidiosa is located in an operon composed by a set of genes (XF0768-XF0767-XF0766-XF0765-XF0764) of unknown function. This operon is conserved in a number of plant-associated bacteria including Agrobacterium tumefaciens, Mezorhizobium loti e Sinorhizobium meliloti. The DNA region upstream of the operon has canonical sequences corresponding to ¿35 and ¿10 elements found in sigma70-regulated promoters. The aim of this work was to elucidate the biological function of the protein encoded by XF0767, named BigR (biofilm growth-associated repressor), as a transcriptional regulator and its importance to the bacteria. BigR binds to an inverted repeat sequence (9-4-9) located in the ¿10 region of the XF0768-0764 operon promoter. This sequence was named BigRbox. BigR repressed transcription of its own operon upon binding to the BigRbox in Xylella fastidiosa and Agrobacterium tumefaciens. Mutations in the BigRbox significantly affected the repressor binding and abolished transcription of the reporter gene in both bacteria, indicating that BigR compete with the RNA polymerase for the same promoter site. BigR is similar to HTH transcriptional factors of the SmtB/ArsR family, which control tolerance and detoxification of heavy metals in prokaryotes. Despite the similarities, BigR does not appear to function as a metal sensor, as initially predicted. Although binding of BigR to its target DNA was diminished in the presence of cadmium, copper and iron, operon regulation in response to metals was not demonstrated in vivo. In addition, Agrobacterium mutants deficient in BigR did not show changes in growth rates in the presence of metals. BLH is an unusual beta-lactamase-like hydrolase coded by the XF0768 gene. To gain insights into the possible function of the operon, the activity of reporter cells was observed in the presence of different compounds and conditions including in planta growth, effect of endophytic competition and nutrient deficiency. Significantly, an increased operon activity was observed in Xylella and Agrobacterium biofilms. Agrobacterium cells attached to tobacco roots also showed high levels of reporter gene expression in comparison to cells in suspension. A. tumefaciens mutants deficient in the BigR showed constitutive expression of the operon, confirming that BigR acts as a transcriptional repressor. Biofilm quantification showed increased biofilm formation in glass surfaces as well as in tobacco roots, indicating that the operon may play a role in cell adherence or biofilm development. Structurally, the truncated BigR protein (?BigR) is a trimmer in solution, as opposed to most HTH regulators known, which are usually found as dimmers or monomers. BigR is stable at high temperatures (74oC); however, treatments with high concentrations of ammonium sulfate interfere with the protein secondary structure and its DNA binding capacity, without affecting its thermal stability. Good quality X-ray diffraction data were collected for the native and derivative ?bigR protein; however, structure resolution was not possible probably due to problems with the crystals / Doutorado / Genetica de Microorganismos / Doutor em Genetica e Biologia Molecular

No description available.

A Clorose Variegada dos Citros (CVC), doença que causa graves prejuízos à citricultura no estado de São Paulo, é causada pela bactéria Xylella fastidiosa que é transmitida pelas cigarrinhas Bucephalogonia xanthophis (Berg), Dilobopterus costalimai (Young), Acrogonia citrina (Marucci & Cavichioli) e Oncometopia facialis (Signoret). Durante a alimentação em plantas afetadas, esses insetos adquirem a bactéria, que coloniza o pré-cibário e o cibário, e depois são capazes de transmitir a doença para plantas sadias. Colonizando o xilema das plantas de citros encontram-se também bactérias endofíticas, que são microrganismos capazes de colonizar internamente tecidos de plantas sem causar dano aparente, e que podem interagir com patógenos no interior do hospedeiro. Este trabalho teve como objetivo avaliar a comunidade bacteriana associada as cigarrinhas vetoras de CVC, e observar as possíveis interações que ocorrem entre insetos vetores de X. fastidiosa e bactérias endofíticas de citros. Primeiramente foi feito um isolamento das bactérias da cabeça de cigarrinhas coletadas em pomares de citros afetados com CVC. Foram isoladas um total de 17230 bactérias de três espécies de cigarrinhas (O. facialis, D. costalimai e A. citrina) em três datas diferentes (22/março, 05/maio e 14/junho de 2002), que foram primeiramente classificadas em 9 grupos morfológicos. Do total, 120 bactérias representantes foram avaliadas por ARDRA e classificadas em 16 haplótipos, dos quais alguns foram identificados, por seqüenciamento da região 16S do rDNA, como Methylobacterium sp. e Curtobacterium sp., que são bactérias endofíticas de citros já descritas e que interagem com X. fastidiosa em citros. Primers específicos para estas bactérias foram utilizados para PCRs com o DNA total da cabeça de cigarrinhas e variou de 39,1% a 89,6% nas diferentes espécies. A comunidade bacteriana associada às cigarrinhas foi também avaliada por DGGE e apresentou variações quanto ao inseto hospedeiro e quanto à época das avaliações. Um isolado de M. mesophilicum expressando o gene da proteína verde fluorescente (GFP ? Green Fluorescent Protein) foi utilizado para experimento de transmissão deste endófito por B. xanthophis. Os insetos se alimentaram em membrana contendo a solução da bactéria e depois foram colocados em plantas de Catharanthus roseus. Das plantas, 13% apresentaram a bactéria fluorescente colonizando tecidos endofiticamente, o que indica que a cigarrinha é capaz de transmitir o endófito. Testes para a avaliação da produção de moléculas de quorum sensing (AHLs - Acil Homocerina Lactonas) foram feitos para M. mesophilicum e M. extorquens. Foram ainda desenvolvidos mutantes de M. extorquens, defectivos para a produção de biofilme e AHLs. / The Citrus Variegated Chlorosis (CVC), a very important disease which attacks citrus trees in the state of São Paulo, is caused by the xylem-limited bacteria, Xylella fastidiosa, which is transmitted by four species of sharpshooters (Cicadellidae) Bucephalogonia xanthophis (Berg), Dilobopterus costalimai (Young), Acrogonia citrina (Marucci & Cavichioli) and Oncometopia facialis (Signoret) which are capable of acquiring X. fastidiosa from the xylem while feeding. In plants, endophytic bacteria, which inhabit the interior of aerial plant parts developing an asymptomatic infection and show potential benefits as biocontrol agents of pests and diseases, may colonize the same niche of pathogens, such as X. fastidiosa, what could allow endophytes to interact with the pathogen. Bacteria were isolated from head of insect vectors, collected on affected citrus plants. From 17230 bacteria isolated from the heads of three insect species (O. facialis, D. costalimai and A. citrina) in three different days (22/march, 05/may and 14/june of 2002), 120 bacteria were tested with ARDRA and classified into 16 different haplotypes. The most frequent strains had their 16S rDNA fragment sequenced and they were identified as Methylobacterium sp. and Curtobacterium sp., bacteria which have been described as citrus endophytes which interact with X. fastidiosa. Total DNA of insect heads was used in Nested PCRs for detection of these citrus endophytes in insects. The frequencies of detection ranged from 39,1% to 89,6%. The bacterial community associated to sharpshooters was also evaluated by DGGE and presented variations due to insect host and time of the evaluations. One M. mesophilicum isolate, expressing the GFP (Green Fluorescent Protein), was used to test the transmission of endophytes by B. xanthophis. Insects fed on membranes containing a bacterial solution and after were trapped on Catharanthus roseus. From the evaluated plants, 13% presented the fluorescent protein colonizing endophytically, indicating that the insect is able to transmit the endophytic bacteria. Biofilm and quorum sensing molecules (AHLs - Acyl Homocerine Lactones) production by Methylobacterium sp. were tested, and M. extorquens mutants for both features were produced.