Orientador: Lucia Regina Durrant / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia de Alimentos / Made available in DSpace on 2018-08-09T13:47:22Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Menezes_CristianoRagagninde_D.pdf: 2527640 bytes, checksum: a6240169a119550bee1ff7d8fc808b73 (MD5) Previous issue date: 2007 / Resumo: Neste trabalho foram avaliadas 6 linhagens de fungos basidiomicetos, sendo que estas foram testadas em 5 tipos de fontes lignocelulósicas provindas de resíduos agroindustriais. Estes foram testados sob fermentação submersa em cultivo estacionário no período de 30 dias de incubação. Na busca dos melhores hidrolisados para os testes prebióticos, foram selecionados os hidrolisados utilizados para fonte de enzimas dos fungos Pleurotus sp BCCB068 e Pleurotus tailândia, no 10° dia de incubação, utilizando farelo de arroz como fonte de carbono com as maiores atividades de xilanase de 0,29 U/ml e 0,24 U/mL respectivamente. Estes valores foram ampliados posteriormente com a otimização do processo de fermentação, elevando as atividades para 0,4 U/mL e 0,69 U/mL, respectivamente. Os hidrolisados escolhidos foram aplicados como fonte de enzimas lignocelulolíticas sobre a matriz de xilana e carboximetilcelulose, avaliando a degradação destas matrizes no período de 0 a 60 minutos de hidrólise. Neste período, os hidrolisados mostraram-se capaz de hidrolisar até 66,4% da xilana e 59,9% de carboximetilcelulose, formando compostos xilooligossacarídeos e celooligossacarídeos, respectivamente, além de vários monômeros de açúcares. As linhagens Pleurotus sp BCCB068 e Pleurotus tailândia também foram utilizadas diretamente para degradar a matriz de xilana em fermentação de 40 dias de cultivo, onde degradaram esta matriz em 73,6% no 20° dia para a primeira e 70,1% já no 5° dia de cultivo para a segunda linhagem, com produção de xilooligossacarídeos e seus monômeros. Os hidrolisados com efeito positivo na degradação das matrizes de xilana e carboximetilcelulose foram testados na sua atividade prebiótica, com significativa estimulação de culturas probióticas do gênero Lactobacillus e Bifidobacterium, e sem estimulação significativa de bactérias enteropatogênicas como a S. enteritidis e E. coli, em experimentos in vitro. Estes resultados indicam o grande potencial destas linhagens fúngicas para a degradação de matrizes hemicelulósicas, para a obtenção de compostos hidrolisados com características prebióticas / Abstract: In this present work, six basidiomycete strains were evaluated using five different lignocelulosic agricultural residues as substrates. These fungi were cultivated under non-agitated conditions for 30 days. Searching for the best strains able to produce lignocellulolytic enzymes, hidrolise these growth substrates and generate compounds having prebiotic activity, Pleurotus sp BCCB068 and Pleurotus tailândia were selected at 10 days of growth using rice bran as the sole carbon source, because they exibited the best xylanase activities (0.29 and 0.24 U/mL, respectively). Growth of these fungi was optimized using an experimental design, resulting in the increase of xylanase activities to 0.4 and 0.69 U/mL, respectively. The crude extract obtained following growth of these fungi used as enzyme source for the hidrolises of xylan and carboxymethylcellulose matrices, which were degradaded (66.4 and 59.9%), respectively, during 0-60 minutes of hydrolysis, forming xylo- and celo-oligosaccharides, as well as several sugar monomers. Pleurotus sp BCCB068 and Pleurotus tailândia were also used directly to degrade xylan under fermentation during 40 days, produzing xylooligosaccharides and sugars, and showing degradation of 73.6% at the 20th day, and 70,1% at the 5th day, respectively. The hydrolyzed products with positive effect in the degradation of xylan and carboxymethylcellulose were evaluated regarding their prebiotic activity, showing significant stimulation of Lactobacillus and Bifidobacterium. However, no significant stimulation of enteropatogenic bacteria such as S. enteritidis and E. coli, in an in vitro experimentation. These results indicate a great potential of these fungal strains to degrade hemicellulosic materials and produce hydrolyzed compounds with prebiotic characteristics / Doutorado / Doutor em Ciência de Alimentos

A fibra de soja (FS) é um resíduo agroindustrial lignocelulósico proveniente do processamento da soja, que, apesar de apresentar potencial para aproveitamento em bioprocessos, é empregado em produtos com baixo valor agregado, como ração animal. A fibra apresenta composição rica em hemicelulose e baixa concentração de lignina, o que destaca ainda mais seu potencial como substrato em bioprocessos. Tendo em vista o presente contexto, este trabalho teve como objetivo o aproveitamento da fibra de soja na produção das enzimas hemicelulolíticas xilanase e arabinofuranosidase por meio do cultivo em estado sólido de duas linhagens de Aspergillus nidulans recombinantes, e a subsequente aplicação dessas enzimas na produção de xilo-oligossacarídeos (XOS). A produção das enzimas foi realizada em três etapas avaliando-se os seguintes fatores: umidade, onde quatro diferentes níveis de umidade foram testados (53 %, 68 %, 76 % e 81 %), adição ou não de tampão HEPES e presença de maltose em duas concentrações (2% e 6 %). As maiores atividades enzimáticas ocorreram em cultivo com umidade de 68 %, presença do tampão HEPES (100 mM), ausência de maltose e em tempos de cultivo de 72 h para xilanase e 96 h para arabinofuranosidase. A produção de XOS foi obtida a partir da aplicação dos extratos enzimáticos brutos obtidos na etapa anterior tendo como substrato a fibra de soja. As produções de xilobiose (X2), xilotriose (X3) e xilotetraose (X4) foram otimizadas por planejamento composto central (DCCR), gerando uma superfície de resposta a partir das variáveis temperatura e concentração de xilanase. A melhor condição obtida (50 °C e 117 U·g-1 de FS) foi utilizada para avaliar a produção de XOS pela adição em conjunto do extrato bruto contendo xilanase com o extrato bruto contendo diferentes concentrações de arabinofuranosidase. O rendimento na produção de XOS neste trabalho foi de 28,8 % (p/p), sendo 138,36 mg·g-1 de xilana a concentração de xilobiose, 96,96 mg·g- 1 de xilana a concentração de xilotriose e 53,04 mg·g-1 de xilana a concentração de xilotetraose, todas em 9 h de reação. A fibra de soja demonstrou ser um substrato adequado para a produção de xilanase e arabinofuranosidase, sendo produzidas altas concentrações de ambas as enzimas. Através da aplicação dessas enzimas obteve-se alta conversão de xilana em diferentes XOS, principalmente aqueles com baixo grau de polimerização, utilizados industrialmente como ingrediente alimentar. / Soybean fiber (SF) is a lignocellulosic agroindustrial residue from the processing of soybean, which, despite having potential in bioprocesses, is used in products with low added value. The fiber is rich in hemicellulose and low concentrations of lignin, which further highlights its potential as a bioprocesses substrate. Considering present context, this work had as objective the use of soybean fiber in production of hemicellulolytic enzymes xylanase and arabinofuranosidase under solid state cultivation of two strains of recombinant Aspergillus nidulans, and the subsequent application of these enzymes in the production of xylooligosaccharides (XOS). Enzyme production was performed in three stages, with the following factors: moisture, where four different moisture levels were tested (53 %, 68 %, 76 % and 81 %), addition or absence of HEPES buffer and presence of maltose in two concentrations (2 % and 6 %). The major enzymatic activities occurred in cultures with moisture of 68 %, presence of HEPES buffer (100 mM), absence of maltose and at 72 h culture times for xylanase and 96 h for arabinofuranosidase. The production of XOS was obtained from the application of the crude enzymatic extracts obtained in the previous step with soybean fiber as the substrate. The production of xylobiose (X2), xylotriose (X3), and xylotetraose (X4) was optimized by central composite design (CCD), generating a response surface from the temperature and xylanase concentration variables. The best condition obtained (50 °C and 117 U·g-1 of SF) Was used to evaluate XOS production by the addition of the crude xylanase-containing crude extract containing the crude extract containing different concentrations of arabinofuranosidase. The yield of XOS in this work was 28.8 % (w/w), being the concentration of xylobiose 138.36 mg·g-1 of xylan, xylotriose concentration 96.96 mg·g-1 of xylan, and xylotetraose concentration 53.04 mg·g-1 of xylan in 9 h of reaction. Soybean fiber has been shown to be a suitable substrate for the production of xylanase and arabinofuranosidase, with high concentrations of both enzymes produced. Through the application of these enzymes, high conversion of xylan to different XOS was achieved, especially those with low degree of polymerization, used industrially as a food ingredient.

A fibra de soja (FS) é um resíduo agroindustrial lignocelulósico proveniente do processamento da soja, que, apesar de apresentar potencial para aproveitamento em bioprocessos, é empregado em produtos com baixo valor agregado, como ração animal. A fibra apresenta composição rica em hemicelulose e baixa concentração de lignina, o que destaca ainda mais seu potencial como substrato em bioprocessos. Tendo em vista o presente contexto, este trabalho teve como objetivo o aproveitamento da fibra de soja na produção das enzimas hemicelulolíticas xilanase e arabinofuranosidase por meio do cultivo em estado sólido de duas linhagens de Aspergillus nidulans recombinantes, e a subsequente aplicação dessas enzimas na produção de xilo-oligossacarídeos (XOS). A produção das enzimas foi realizada em três etapas avaliando-se os seguintes fatores: umidade, onde quatro diferentes níveis de umidade foram testados (53 %, 68 %, 76 % e 81 %), adição ou não de tampão HEPES e presença de maltose em duas concentrações (2% e 6 %). As maiores atividades enzimáticas ocorreram em cultivo com umidade de 68 %, presença do tampão HEPES (100 mM), ausência de maltose e em tempos de cultivo de 72 h para xilanase e 96 h para arabinofuranosidase. A produção de XOS foi obtida a partir da aplicação dos extratos enzimáticos brutos obtidos na etapa anterior tendo como substrato a fibra de soja. As produções de xilobiose (X2), xilotriose (X3) e xilotetraose (X4) foram otimizadas por planejamento composto central (DCCR), gerando uma superfície de resposta a partir das variáveis temperatura e concentração de xilanase. A melhor condição obtida (50 °C e 117 U·g-1 de FS) foi utilizada para avaliar a produção de XOS pela adição em conjunto do extrato bruto contendo xilanase com o extrato bruto contendo diferentes concentrações de arabinofuranosidase. O rendimento na produção de XOS neste trabalho foi de 28,8 % (p/p), sendo 138,36 mg·g-1 de xilana a concentração de xilobiose, 96,96 mg·g- 1 de xilana a concentração de xilotriose e 53,04 mg·g-1 de xilana a concentração de xilotetraose, todas em 9 h de reação. A fibra de soja demonstrou ser um substrato adequado para a produção de xilanase e arabinofuranosidase, sendo produzidas altas concentrações de ambas as enzimas. Através da aplicação dessas enzimas obteve-se alta conversão de xilana em diferentes XOS, principalmente aqueles com baixo grau de polimerização, utilizados industrialmente como ingrediente alimentar. / Soybean fiber (SF) is a lignocellulosic agroindustrial residue from the processing of soybean, which, despite having potential in bioprocesses, is used in products with low added value. The fiber is rich in hemicellulose and low concentrations of lignin, which further highlights its potential as a bioprocesses substrate. Considering present context, this work had as objective the use of soybean fiber in production of hemicellulolytic enzymes xylanase and arabinofuranosidase under solid state cultivation of two strains of recombinant Aspergillus nidulans, and the subsequent application of these enzymes in the production of xylooligosaccharides (XOS). Enzyme production was performed in three stages, with the following factors: moisture, where four different moisture levels were tested (53 %, 68 %, 76 % and 81 %), addition or absence of HEPES buffer and presence of maltose in two concentrations (2 % and 6 %). The major enzymatic activities occurred in cultures with moisture of 68 %, presence of HEPES buffer (100 mM), absence of maltose and at 72 h culture times for xylanase and 96 h for arabinofuranosidase. The production of XOS was obtained from the application of the crude enzymatic extracts obtained in the previous step with soybean fiber as the substrate. The production of xylobiose (X2), xylotriose (X3), and xylotetraose (X4) was optimized by central composite design (CCD), generating a response surface from the temperature and xylanase concentration variables. The best condition obtained (50 °C and 117 U·g-1 of SF) Was used to evaluate XOS production by the addition of the crude xylanase-containing crude extract containing the crude extract containing different concentrations of arabinofuranosidase. The yield of XOS in this work was 28.8 % (w/w), being the concentration of xylobiose 138.36 mg·g-1 of xylan, xylotriose concentration 96.96 mg·g-1 of xylan, and xylotetraose concentration 53.04 mg·g-1 of xylan in 9 h of reaction. Soybean fiber has been shown to be a suitable substrate for the production of xylanase and arabinofuranosidase, with high concentrations of both enzymes produced. Through the application of these enzymes, high conversion of xylan to different XOS was achieved, especially those with low degree of polymerization, used industrially as a food ingredient.

Xilooligossacarídeos (XOS) são produzidos a partir materiais lignocelulósicos contendo xilanos através de métodos químicos, hidrólise enzimática direta de um substrato susceptível à ação de xilanases e outras enzimas líticas, ou uma combinação de tratamentos químicos e enzimáticos. Os XOS são reconhecidos por trazerem benefício a saúde e são considerados ingredientes prebióticos. A utilização de resíduos agro-industriais produzidos no Rio Grande do Sul, tais como a casca de arroz, a casca de soja e o extrato de malte proveniente de cervejarias tornam-se substratos com grande potencial para a produção da enzima xilanase, principalmente em cultivo em estado sólido. Neste trabalho, foram analisados o potencial de diversos fungos selvagens e de um fungo recombinante na produção da enzima xilanase e outras enzimas importantes para a hidrólise de biomassa lignocelulósica, e a aplicação destes microrganismos para a produção de XOS em cultivos em estado sólido. Através de uma seleção de fungos foi possível definir o Aspergillus brasiliensis BLf1 como maior produtor de xilanase em cultivo sobre casca de arroz, obtendo atividade de 120,5 U.g-1 substrato. Nesta seleção foram analisadas também as enzimas celulase, β-glicosidase e β-xilosidase Um planejamento experimental fracionário 2(5-1) deste fungo selecionado e do fungo recombinante Aspergillus nidulans XynC A773 determinaram variáveis que influenciam a produção da enzima xilanase, chegando a uma atividade máxima de 230,7 U.g-1 para A. brasiliensis BLf1 e 187,9 U.g-1 para A. nidulans XynC A773. Posteriormente, estas preparações enzimáticas foram aplicadas à casca de arroz para hidrolisar sua estrutura hemicelulósica polimérica e obter xilolossacarídeos (37,25 mg de XOS.g-1 de substrato e 75,92 mg de XOS.g-1 de substrato, respectivamente). Por fim, foi avaliado o potencial prebiótico de XOS obtidos. Os resultados deste estudo revelaram o crescimento de L. plantarum BL011 e B. lactis BB-12 em XOS, com um aumento de massa celular seca de até 1,7 g.L-1 em 120h. Os resultados obtidos neste trabalho sugerem que é possível a obtenção de XOS a partir de resíduos abundantes no Estado e que os mesmos possuem potencial para serem utilizados como prebióticos, podendo, portanto, ser usados em aplicações relacionadas aos alimentos funcionais. / Xylooligosaccharides (XOS) are produced from lignocellulosic materials containing xylan by chemical methods, direct enzymatic hydrolysis of susceptible substrates using xylanases and other lytic enzymes, or a combination of chemical and enzymatic treatments. XOS are recognized for bringing benefit to health of the host and are considered prebiotic ingredients. The use of lignocellulosic residues produced in Rio Grande do Sul, such as rice husk, soybean hulls, and spent malt from brewery hold potential for the production of xylanase enzyme, especially under solid-state cultivation. In this work, several wild strains of fungi and one recombinant strain were tested for their potential of producing xylanase and their application in solid-state cultivation to obtain XOS. It was possible to define the Aspergillus brasiliensis BLf1 as the best producer of xylanase on rice husk, obtaining an activity of 120.5 U.g-1. Other important lytic enzymes were also analyzed: cellulase, β-glucosidase, and β-xylosidase The statistical experiment fractional factorial design 2(5-1) of cultures of this fungus and of the recombinant strain Aspergillus nidulans XynC A773 defined the variables that influenced the production of xylanase, showing maximal activities of 230.7 U.g-1 for A. brasiliensis BLf1 and 187.9 U.g-1 for A. nidulans XynC A773. Subsequently, these enzymatic preparations were applied to rice husk to hydrolyse its polymeric hemicellulosic structure and obtain xylooligosaccharides (37.25 mg XOS.g-1 substrate and 75.92 mg XOS.g-1 substrate, respectively). Finally, the prebiotic potential of XOS was evaluated by using them to grow L. plantarum BL011 and B. lactis BB-12, showing an increase in the dry cell mass of 1.7 g.L-1 at 120 hours. The results obtained in this research suggest that it is possible to obtain XOS from agro industrial residues of local production and they have the potential to be used as prebiotics, and could be used in food related applications.

A fibra de soja (FS) é um resíduo agroindustrial lignocelulósico proveniente do processamento da soja, que, apesar de apresentar potencial para aproveitamento em bioprocessos, é empregado em produtos com baixo valor agregado, como ração animal. A fibra apresenta composição rica em hemicelulose e baixa concentração de lignina, o que destaca ainda mais seu potencial como substrato em bioprocessos. Tendo em vista o presente contexto, este trabalho teve como objetivo o aproveitamento da fibra de soja na produção das enzimas hemicelulolíticas xilanase e arabinofuranosidase por meio do cultivo em estado sólido de duas linhagens de Aspergillus nidulans recombinantes, e a subsequente aplicação dessas enzimas na produção de xilo-oligossacarídeos (XOS). A produção das enzimas foi realizada em três etapas avaliando-se os seguintes fatores: umidade, onde quatro diferentes níveis de umidade foram testados (53 %, 68 %, 76 % e 81 %), adição ou não de tampão HEPES e presença de maltose em duas concentrações (2% e 6 %). As maiores atividades enzimáticas ocorreram em cultivo com umidade de 68 %, presença do tampão HEPES (100 mM), ausência de maltose e em tempos de cultivo de 72 h para xilanase e 96 h para arabinofuranosidase. A produção de XOS foi obtida a partir da aplicação dos extratos enzimáticos brutos obtidos na etapa anterior tendo como substrato a fibra de soja. As produções de xilobiose (X2), xilotriose (X3) e xilotetraose (X4) foram otimizadas por planejamento composto central (DCCR), gerando uma superfície de resposta a partir das variáveis temperatura e concentração de xilanase. A melhor condição obtida (50 °C e 117 U·g-1 de FS) foi utilizada para avaliar a produção de XOS pela adição em conjunto do extrato bruto contendo xilanase com o extrato bruto contendo diferentes concentrações de arabinofuranosidase. O rendimento na produção de XOS neste trabalho foi de 28,8 % (p/p), sendo 138,36 mg·g-1 de xilana a concentração de xilobiose, 96,96 mg·g- 1 de xilana a concentração de xilotriose e 53,04 mg·g-1 de xilana a concentração de xilotetraose, todas em 9 h de reação. A fibra de soja demonstrou ser um substrato adequado para a produção de xilanase e arabinofuranosidase, sendo produzidas altas concentrações de ambas as enzimas. Através da aplicação dessas enzimas obteve-se alta conversão de xilana em diferentes XOS, principalmente aqueles com baixo grau de polimerização, utilizados industrialmente como ingrediente alimentar. / Soybean fiber (SF) is a lignocellulosic agroindustrial residue from the processing of soybean, which, despite having potential in bioprocesses, is used in products with low added value. The fiber is rich in hemicellulose and low concentrations of lignin, which further highlights its potential as a bioprocesses substrate. Considering present context, this work had as objective the use of soybean fiber in production of hemicellulolytic enzymes xylanase and arabinofuranosidase under solid state cultivation of two strains of recombinant Aspergillus nidulans, and the subsequent application of these enzymes in the production of xylooligosaccharides (XOS). Enzyme production was performed in three stages, with the following factors: moisture, where four different moisture levels were tested (53 %, 68 %, 76 % and 81 %), addition or absence of HEPES buffer and presence of maltose in two concentrations (2 % and 6 %). The major enzymatic activities occurred in cultures with moisture of 68 %, presence of HEPES buffer (100 mM), absence of maltose and at 72 h culture times for xylanase and 96 h for arabinofuranosidase. The production of XOS was obtained from the application of the crude enzymatic extracts obtained in the previous step with soybean fiber as the substrate. The production of xylobiose (X2), xylotriose (X3), and xylotetraose (X4) was optimized by central composite design (CCD), generating a response surface from the temperature and xylanase concentration variables. The best condition obtained (50 °C and 117 U·g-1 of SF) Was used to evaluate XOS production by the addition of the crude xylanase-containing crude extract containing the crude extract containing different concentrations of arabinofuranosidase. The yield of XOS in this work was 28.8 % (w/w), being the concentration of xylobiose 138.36 mg·g-1 of xylan, xylotriose concentration 96.96 mg·g-1 of xylan, and xylotetraose concentration 53.04 mg·g-1 of xylan in 9 h of reaction. Soybean fiber has been shown to be a suitable substrate for the production of xylanase and arabinofuranosidase, with high concentrations of both enzymes produced. Through the application of these enzymes, high conversion of xylan to different XOS was achieved, especially those with low degree of polymerization, used industrially as a food ingredient.

Xilooligossacarídeos (XOS) são produzidos a partir materiais lignocelulósicos contendo xilanos através de métodos químicos, hidrólise enzimática direta de um substrato susceptível à ação de xilanases e outras enzimas líticas, ou uma combinação de tratamentos químicos e enzimáticos. Os XOS são reconhecidos por trazerem benefício a saúde e são considerados ingredientes prebióticos. A utilização de resíduos agro-industriais produzidos no Rio Grande do Sul, tais como a casca de arroz, a casca de soja e o extrato de malte proveniente de cervejarias tornam-se substratos com grande potencial para a produção da enzima xilanase, principalmente em cultivo em estado sólido. Neste trabalho, foram analisados o potencial de diversos fungos selvagens e de um fungo recombinante na produção da enzima xilanase e outras enzimas importantes para a hidrólise de biomassa lignocelulósica, e a aplicação destes microrganismos para a produção de XOS em cultivos em estado sólido. Através de uma seleção de fungos foi possível definir o Aspergillus brasiliensis BLf1 como maior produtor de xilanase em cultivo sobre casca de arroz, obtendo atividade de 120,5 U.g-1 substrato. Nesta seleção foram analisadas também as enzimas celulase, β-glicosidase e β-xilosidase Um planejamento experimental fracionário 2(5-1) deste fungo selecionado e do fungo recombinante Aspergillus nidulans XynC A773 determinaram variáveis que influenciam a produção da enzima xilanase, chegando a uma atividade máxima de 230,7 U.g-1 para A. brasiliensis BLf1 e 187,9 U.g-1 para A. nidulans XynC A773. Posteriormente, estas preparações enzimáticas foram aplicadas à casca de arroz para hidrolisar sua estrutura hemicelulósica polimérica e obter xilolossacarídeos (37,25 mg de XOS.g-1 de substrato e 75,92 mg de XOS.g-1 de substrato, respectivamente). Por fim, foi avaliado o potencial prebiótico de XOS obtidos. Os resultados deste estudo revelaram o crescimento de L. plantarum BL011 e B. lactis BB-12 em XOS, com um aumento de massa celular seca de até 1,7 g.L-1 em 120h. Os resultados obtidos neste trabalho sugerem que é possível a obtenção de XOS a partir de resíduos abundantes no Estado e que os mesmos possuem potencial para serem utilizados como prebióticos, podendo, portanto, ser usados em aplicações relacionadas aos alimentos funcionais. / Xylooligosaccharides (XOS) are produced from lignocellulosic materials containing xylan by chemical methods, direct enzymatic hydrolysis of susceptible substrates using xylanases and other lytic enzymes, or a combination of chemical and enzymatic treatments. XOS are recognized for bringing benefit to health of the host and are considered prebiotic ingredients. The use of lignocellulosic residues produced in Rio Grande do Sul, such as rice husk, soybean hulls, and spent malt from brewery hold potential for the production of xylanase enzyme, especially under solid-state cultivation. In this work, several wild strains of fungi and one recombinant strain were tested for their potential of producing xylanase and their application in solid-state cultivation to obtain XOS. It was possible to define the Aspergillus brasiliensis BLf1 as the best producer of xylanase on rice husk, obtaining an activity of 120.5 U.g-1. Other important lytic enzymes were also analyzed: cellulase, β-glucosidase, and β-xylosidase The statistical experiment fractional factorial design 2(5-1) of cultures of this fungus and of the recombinant strain Aspergillus nidulans XynC A773 defined the variables that influenced the production of xylanase, showing maximal activities of 230.7 U.g-1 for A. brasiliensis BLf1 and 187.9 U.g-1 for A. nidulans XynC A773. Subsequently, these enzymatic preparations were applied to rice husk to hydrolyse its polymeric hemicellulosic structure and obtain xylooligosaccharides (37.25 mg XOS.g-1 substrate and 75.92 mg XOS.g-1 substrate, respectively). Finally, the prebiotic potential of XOS was evaluated by using them to grow L. plantarum BL011 and B. lactis BB-12, showing an increase in the dry cell mass of 1.7 g.L-1 at 120 hours. The results obtained in this research suggest that it is possible to obtain XOS from agro industrial residues of local production and they have the potential to be used as prebiotics, and could be used in food related applications.

Orientador: Fabio Marcio Squina / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-22T07:16:54Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Brenelli_LiviaBeatriz_M.pdf: 3254921 bytes, checksum: 742abc7bd539c101669cd20c8861717d (MD5) Previous issue date: 2013 / Resumo: O bagaço de cana-de-açúcar é um resíduo agroindustrial abundante no Brasil que pode ser utilizado como matéria-prima em uma biorrefinaria para produção de compostos com interesse industrial. A dificuldade para conversão do bagaço de cana e outros materiais lignocelulósicos em biocombustíveis ou insumos químicos é atribuída às suas características químicas e morfológicas. Neste sentido, um dos principais desafios que envolvem esta bioconversão é a desconstrução da parede celular de forma eficiente e economicamente viável. O aproveitamento do bagaço de cana para produção de ácido ferúlico e de xilooligossacarídeos pode representar uma estratégia interessante de bioconversão de um resíduo agroindustrial em moléculas de alto valor agregado. O estudo descrito nesta dissertação aborda o desenvolvimento de uma rota biotecnológica utilizando o bagaço de cana para produção de ácido ferúlico, empregando a enzima feruloil esterase do fungo Aspergillus clavatus, e xilooligossacarídeos, fazendo uso de endo-xilanase e arabinofuranosidase, dos fungos Penicillium funiculosum e Aspergillus niger, respectivamente. Neste trabalho, estas enzimas recombinantes foram super expressas em sistema heterólogo, sendo a feruloil esterase expressa em Escherichia coli, enquanto a xilanase e a arabinofuranosidase expressas em Aspergillus nidulans como hospedeiro. O emprego da feruloil esterase resultou na liberação de ácido ferúlico e outros compostos fenólicos com capacidade antioxidante, utilizando o bagaço de cana e o arabinoxilano de trigo como substrato. O pré-tratamento químico do bagaço de cana mostrou ser adequado para aumentar a eficiência deste processo de conversão enzimática. A atividade sinérgica da endo-xilanase e arabinofuranosidase propiciou uma melhor eficiência na produção de xilooligossacarídeos a partir do bagaço de cana. Os estudos aqui descritos, quanto à utilização de bagaço de cana-de-açúcar como substrato para produção destes compostos com apelo biotecnológico, são inéditos na literatura. Além disso, os resultados deste trabalho, também contribuíram para a melhor compreensão do mecanismo de ação destas enzimas sobre este tipo de biomassa, bem como na elucidação de quais enzimas são necessárias para conversão do bagaço de cana em bioprodutos / Abstract: Sugarcane bagasse is an abundant agroindustrial residue in Brazil that can be used as feedstock biorefineries for the production of bioactive compounds of industrial interest. The difficulty on the convertion of sugarcane bagasse and other lignocellulosic materials into biofuels or chemicals is attributed to their chemical and morphological characteristics. Thus, one of the main challenges involved in this bioconversion route is the efficient and economically viable deconstruction of plant cell wall. The use of bagasse for the production of ferulic acid and xylooligosaccharides may represent an interesting alternative route for bioconversion of an agroindustrial residue into value-added molecules. This dissertation describes the development of a biotechnological approaches using sugarcane bagasse for the production of ferulic acid by employing the feruloyl esterase enzyme from the fungus Aspergillus clavatus. Likewise, the production of xylooligosaccharides was also described using arabinofuranosidase and endo-xylanase from the fungi Penicillium funiculosum and Aspergillus niger, respectively. These recombinant enzymes were over expressed in heterologous systems, meanwhile the feruloyl esterase was expressed in Escherichia coli, the arabinofuranosidase and xylanase were expressed in Aspergillus nidulans as host. Ferulic acid and other phenolic compounds with antioxidant capacity were released by the action feruloyl esterase using sugarcane bagasse and wheat arabinoxylan as substrate. Chemical pretreatment of the sugarcane bagasse proved to be suitable to increase the efficiency of the enzymatic conversion process. The synergistic activity of the endo-xylanase and arabinofuranosidase enzymes led to greater efficiency on the production of xylooligosaccharides from sugarcane bagasse. The studies described here, regarding the use of sugarcane bagasse as substrate for production of these compounds with biotechnological appealing are unprecedented in literature. Furthermore, the results of this work also contributed to better understanding the mechanism of enzyme action on this type of biomass, as well as to determine which enzymes are important for conversion of sugarcane bagasse into bioproducts / Mestrado / Fármacos, Medicamentos e Insumos para Saúde / Mestra em Biociências e Tecnologia de Produtos Bioativos

Xilooligossacarídeos (XOS) são produzidos a partir materiais lignocelulósicos contendo xilanos através de métodos químicos, hidrólise enzimática direta de um substrato susceptível à ação de xilanases e outras enzimas líticas, ou uma combinação de tratamentos químicos e enzimáticos. Os XOS são reconhecidos por trazerem benefício a saúde e são considerados ingredientes prebióticos. A utilização de resíduos agro-industriais produzidos no Rio Grande do Sul, tais como a casca de arroz, a casca de soja e o extrato de malte proveniente de cervejarias tornam-se substratos com grande potencial para a produção da enzima xilanase, principalmente em cultivo em estado sólido. Neste trabalho, foram analisados o potencial de diversos fungos selvagens e de um fungo recombinante na produção da enzima xilanase e outras enzimas importantes para a hidrólise de biomassa lignocelulósica, e a aplicação destes microrganismos para a produção de XOS em cultivos em estado sólido. Através de uma seleção de fungos foi possível definir o Aspergillus brasiliensis BLf1 como maior produtor de xilanase em cultivo sobre casca de arroz, obtendo atividade de 120,5 U.g-1 substrato. Nesta seleção foram analisadas também as enzimas celulase, β-glicosidase e β-xilosidase Um planejamento experimental fracionário 2(5-1) deste fungo selecionado e do fungo recombinante Aspergillus nidulans XynC A773 determinaram variáveis que influenciam a produção da enzima xilanase, chegando a uma atividade máxima de 230,7 U.g-1 para A. brasiliensis BLf1 e 187,9 U.g-1 para A. nidulans XynC A773. Posteriormente, estas preparações enzimáticas foram aplicadas à casca de arroz para hidrolisar sua estrutura hemicelulósica polimérica e obter xilolossacarídeos (37,25 mg de XOS.g-1 de substrato e 75,92 mg de XOS.g-1 de substrato, respectivamente). Por fim, foi avaliado o potencial prebiótico de XOS obtidos. Os resultados deste estudo revelaram o crescimento de L. plantarum BL011 e B. lactis BB-12 em XOS, com um aumento de massa celular seca de até 1,7 g.L-1 em 120h. Os resultados obtidos neste trabalho sugerem que é possível a obtenção de XOS a partir de resíduos abundantes no Estado e que os mesmos possuem potencial para serem utilizados como prebióticos, podendo, portanto, ser usados em aplicações relacionadas aos alimentos funcionais. / Xylooligosaccharides (XOS) are produced from lignocellulosic materials containing xylan by chemical methods, direct enzymatic hydrolysis of susceptible substrates using xylanases and other lytic enzymes, or a combination of chemical and enzymatic treatments. XOS are recognized for bringing benefit to health of the host and are considered prebiotic ingredients. The use of lignocellulosic residues produced in Rio Grande do Sul, such as rice husk, soybean hulls, and spent malt from brewery hold potential for the production of xylanase enzyme, especially under solid-state cultivation. In this work, several wild strains of fungi and one recombinant strain were tested for their potential of producing xylanase and their application in solid-state cultivation to obtain XOS. It was possible to define the Aspergillus brasiliensis BLf1 as the best producer of xylanase on rice husk, obtaining an activity of 120.5 U.g-1. Other important lytic enzymes were also analyzed: cellulase, β-glucosidase, and β-xylosidase The statistical experiment fractional factorial design 2(5-1) of cultures of this fungus and of the recombinant strain Aspergillus nidulans XynC A773 defined the variables that influenced the production of xylanase, showing maximal activities of 230.7 U.g-1 for A. brasiliensis BLf1 and 187.9 U.g-1 for A. nidulans XynC A773. Subsequently, these enzymatic preparations were applied to rice husk to hydrolyse its polymeric hemicellulosic structure and obtain xylooligosaccharides (37.25 mg XOS.g-1 substrate and 75.92 mg XOS.g-1 substrate, respectively). Finally, the prebiotic potential of XOS was evaluated by using them to grow L. plantarum BL011 and B. lactis BB-12, showing an increase in the dry cell mass of 1.7 g.L-1 at 120 hours. The results obtained in this research suggest that it is possible to obtain XOS from agro industrial residues of local production and they have the potential to be used as prebiotics, and could be used in food related applications.

Hemicelulose extraída do bagaço de cana-de-açúcar foi hidrolisada por enzimas de Thermoascus aurantiacus, Trichoderma reesei e Aspergilus niger para obtenção de xilo-oligossacarídeos (XOs). A hemicelulose foi extraída com hidróxido de sódio na presença de antraquinona, sulfito de sódio ou peróxido de hidrogênio. O uso de antraquinona ou sulfito aumentou o rendimento de extração, porém a hemicelulose apresentou baixa solubilidade em água, propriedade inadequada para a hidrólise enzimática. A extração da hemicellulose com peróxido de hidrogênio em meio alcalino foi otimizada através de um planejamento fatorial completo 24 variando-se a concentração de H2O2 de 2 a 6% (m/v), tempo de reação de 4 a 16 h, temperatura de 20 a 60°C e presença ou não de 0,5% de sulfato de magnésio. No ponto central o rendimento de extração de hemicelulose foi de 94,5% com remoção de mais que 88% da lignina. Um rendimento de 86% de hemicelulose com baixo teor de lignina (5,9%) foi obtido em 6% de peróxido de hidrogênio por 4h a 20°C. Nessa condição a hemicelulose apresentou massa molar de 21.000 g/mol, composição aproximada de 81% xilose, 4% de arabinose, 4% de glicose e 3% de ácidos urônicos, alta solubilidade em água (90 % em massa) e coloração amarelo claro. As enzimas usadas na hidrólise dessa hemicelulose foram produzidas pelo cultivo dos fungos em meio sólido contento farelo de trigo. Em todos os extratos foi observada baixa atividade de endoglucanase e β-xilosidase e elevadas atividades de endo-β-1,4-xilanase. A máxima atividade de xilanase foi produzida por T. aurantiacus (1500 U/g), enquanto A. niger produziu 500 U/g e T. reesei 240 U/g, em 5 dias de cultivo. O perfil de produção de XOs com enzimas de T. aurantiacus e T. reesei foi semelhante, o principal produto foi xilobiose, seguido por xilose, xilotriose, xilotetraose e xilopentaose, sendo esses XOs de cadeia linear. A hidrólise da hemicelulose com enzimas de A. niger produziu exclusivamente xilose, consequência da presença de elevada atividade de β-xilosidase. A velocidade de conversão da hemicelulose em XOs com as enzimas de T. reesei foi maior no início da reação (6 h), diminuindo a partir de 24 h, período em que inicia a produção de xilose. A influência da concentração de substrato e carga de xilanase na conversão da hemicelulose em XOs foi avaliada através de um planejamento experimental 22 com face centrada. A condição otimizada da hidrólise (2,6% substrato e 60 U/g de endo-β-1,4-xilanase) com o extrato de T. aurantiacus resultou em 42% de conversão em XOs. A otimização da hidrólise da hemicelulose com o extrato de T. reesei resultou em uma conversão máxima de 20%, com ótimo de 3,8 % de substrato e 87,5 U/g de endo-β-1,4-xilanase. A eficiência da hidrólise com enzimas de T. aurantiacus foi maior que a obtida com alguns extratos comerciais testados neste trabalho. Além disso, apresentaram capacidade de degradar hemiceluloses de diferentes fontes: bétula e semente de aveia, com composições variadas. Diferenças na composição de açúcares e teor de lignina não interferiram na ação dessas enzimas. A hidrólise enzimática mostrou-se mais apropriada para a produção de XOs do que a auto-hidrólise, que gerou predominantemente xilose e houve formação de furfural. Apesar do curto tempo de reação, a produção de XOs foi menor e há necessidade de purificação para obtenção de um produto final com características desejáveis. / Hemicellulose extracted from sugarcane bagasse was hydrolyzed by enzymes from Thermoascus aurantiacus, Trichoderma reesei and Aspergilus niger to cause the degradation of xylan to xylooligosaccharides (XOs). Hemicellulose was extracted with hydrogen peroxide in the presence of antraquinone, sodium sulphite or hydrogen peroxide. Hemicelluloses extracted with antraquinone or sulphite presented low solubility in water, which is not appropriated to enzymatic hydrolysis. To maximize the hemicellulose yields several extraction conditions were examined applying the 24 factorial design: H2O2 concentration from 2 to 6% (w/v), reaction time from 4 to 16 h, temperature from 20 to 60°C, and magnesium sulfate absence or presence (0.5%, w/v). This approach allowed selection of conditions for the extraction of low and high lignin content hemicellulose. At midpoint the yield of hemicellulose was 94.5% with more than 88% of lignin removed. Hemicellulose in 86% yield with low lignin content (5.9%) was obtained with 6% H2O2 treatment for 4 h and 20°C. This hemicellulose is much lighter in color than samples obtained at the midpoint condition and was found suitable for subsequent enzymatic hydrolysis. The molecular weight of hemicellulose was 21,000 g/mol with composition of aproximately 81% xylose, 4% arabinose, 4% glucose and 3% uronic acids, high water solubility (90 %). Enzymes for hemicellulose hydrolysis were produced by the fungi on wheat bran. Cellulases and hemicellulases were present in all extracts especially the endo-β-1,4-xylanase. The profile of production of XOs obtained on hydrolysis with enzymes from T. aurantiacus and T. reesei was similar, with the main product xylobiose, followed by xylose, xylotriose, xylotetraose and xylopentaose, and these XOs showed linear chain. The hydrolysis of hemicellulose with enzymes of A. niger produced exclusively xylose, a consequence of β-xylosidase content. The rate of conversion of hemicellulose in XOs with enzymes of T. reesei was higher at the beginning of the reaction (6 h), decreasing from 24 h, when starts the production of xylose. The influence of substrate concentration and loading of xylanase in conversion of hemicellulose to XOs was evaluated by an 22 full factorial design with centered face. Optimization of hydrolysis (2.6% substrate and 60 U/g endo-β-1,4-xylanase) with the extract of T. aurantiacus resulted in 42 % conversion XOs. The optimization with the extract of T. reesei resulted in a conversion of hemicellulose up to 20%, with optimal substrate 3.8% and 87.5 U/g endo-β-1,4-xylanase. The efficiency of hydrolysis by enzymes from T. aurantiacus was superior to commercial extracts, and showed ability to degrade hemicelluloses of different compositions (birchwood and oat spelt). The structural differences, such as branches and lignin content did not affect the action of these enzymes. The differences in the efficiency and extent of enzymatic hydrolysis by enzymes of these fungi might have occurred in function of differences in physicochemical properties and specific activity. The enzymatic hydrolysis was more appropriate for production of XOs than autohydrolysis, which generated predominantly xylose and formation of furfural. Despite of short reaction time, the production of XOs was low and purification is needed in order to obtain a final product with desirable characteristics.

Hemicelulose extraída do bagaço de cana-de-açúcar foi hidrolisada por enzimas de Thermoascus aurantiacus, Trichoderma reesei e Aspergilus niger para obtenção de xilo-oligossacarídeos (XOs). A hemicelulose foi extraída com hidróxido de sódio na presença de antraquinona, sulfito de sódio ou peróxido de hidrogênio. O uso de antraquinona ou sulfito aumentou o rendimento de extração, porém a hemicelulose apresentou baixa solubilidade em água, propriedade inadequada para a hidrólise enzimática. A extração da hemicellulose com peróxido de hidrogênio em meio alcalino foi otimizada através de um planejamento fatorial completo 24 variando-se a concentração de H2O2 de 2 a 6% (m/v), tempo de reação de 4 a 16 h, temperatura de 20 a 60°C e presença ou não de 0,5% de sulfato de magnésio. No ponto central o rendimento de extração de hemicelulose foi de 94,5% com remoção de mais que 88% da lignina. Um rendimento de 86% de hemicelulose com baixo teor de lignina (5,9%) foi obtido em 6% de peróxido de hidrogênio por 4h a 20°C. Nessa condição a hemicelulose apresentou massa molar de 21.000 g/mol, composição aproximada de 81% xilose, 4% de arabinose, 4% de glicose e 3% de ácidos urônicos, alta solubilidade em água (90 % em massa) e coloração amarelo claro. As enzimas usadas na hidrólise dessa hemicelulose foram produzidas pelo cultivo dos fungos em meio sólido contento farelo de trigo. Em todos os extratos foi observada baixa atividade de endoglucanase e β-xilosidase e elevadas atividades de endo-β-1,4-xilanase. A máxima atividade de xilanase foi produzida por T. aurantiacus (1500 U/g), enquanto A. niger produziu 500 U/g e T. reesei 240 U/g, em 5 dias de cultivo. O perfil de produção de XOs com enzimas de T. aurantiacus e T. reesei foi semelhante, o principal produto foi xilobiose, seguido por xilose, xilotriose, xilotetraose e xilopentaose, sendo esses XOs de cadeia linear. A hidrólise da hemicelulose com enzimas de A. niger produziu exclusivamente xilose, consequência da presença de elevada atividade de β-xilosidase. A velocidade de conversão da hemicelulose em XOs com as enzimas de T. reesei foi maior no início da reação (6 h), diminuindo a partir de 24 h, período em que inicia a produção de xilose. A influência da concentração de substrato e carga de xilanase na conversão da hemicelulose em XOs foi avaliada através de um planejamento experimental 22 com face centrada. A condição otimizada da hidrólise (2,6% substrato e 60 U/g de endo-β-1,4-xilanase) com o extrato de T. aurantiacus resultou em 42% de conversão em XOs. A otimização da hidrólise da hemicelulose com o extrato de T. reesei resultou em uma conversão máxima de 20%, com ótimo de 3,8 % de substrato e 87,5 U/g de endo-β-1,4-xilanase. A eficiência da hidrólise com enzimas de T. aurantiacus foi maior que a obtida com alguns extratos comerciais testados neste trabalho. Além disso, apresentaram capacidade de degradar hemiceluloses de diferentes fontes: bétula e semente de aveia, com composições variadas. Diferenças na composição de açúcares e teor de lignina não interferiram na ação dessas enzimas. A hidrólise enzimática mostrou-se mais apropriada para a produção de XOs do que a auto-hidrólise, que gerou predominantemente xilose e houve formação de furfural. Apesar do curto tempo de reação, a produção de XOs foi menor e há necessidade de purificação para obtenção de um produto final com características desejáveis. / Hemicellulose extracted from sugarcane bagasse was hydrolyzed by enzymes from Thermoascus aurantiacus, Trichoderma reesei and Aspergilus niger to cause the degradation of xylan to xylooligosaccharides (XOs). Hemicellulose was extracted with hydrogen peroxide in the presence of antraquinone, sodium sulphite or hydrogen peroxide. Hemicelluloses extracted with antraquinone or sulphite presented low solubility in water, which is not appropriated to enzymatic hydrolysis. To maximize the hemicellulose yields several extraction conditions were examined applying the 24 factorial design: H2O2 concentration from 2 to 6% (w/v), reaction time from 4 to 16 h, temperature from 20 to 60°C, and magnesium sulfate absence or presence (0.5%, w/v). This approach allowed selection of conditions for the extraction of low and high lignin content hemicellulose. At midpoint the yield of hemicellulose was 94.5% with more than 88% of lignin removed. Hemicellulose in 86% yield with low lignin content (5.9%) was obtained with 6% H2O2 treatment for 4 h and 20°C. This hemicellulose is much lighter in color than samples obtained at the midpoint condition and was found suitable for subsequent enzymatic hydrolysis. The molecular weight of hemicellulose was 21,000 g/mol with composition of aproximately 81% xylose, 4% arabinose, 4% glucose and 3% uronic acids, high water solubility (90 %). Enzymes for hemicellulose hydrolysis were produced by the fungi on wheat bran. Cellulases and hemicellulases were present in all extracts especially the endo-β-1,4-xylanase. The profile of production of XOs obtained on hydrolysis with enzymes from T. aurantiacus and T. reesei was similar, with the main product xylobiose, followed by xylose, xylotriose, xylotetraose and xylopentaose, and these XOs showed linear chain. The hydrolysis of hemicellulose with enzymes of A. niger produced exclusively xylose, a consequence of β-xylosidase content. The rate of conversion of hemicellulose in XOs with enzymes of T. reesei was higher at the beginning of the reaction (6 h), decreasing from 24 h, when starts the production of xylose. The influence of substrate concentration and loading of xylanase in conversion of hemicellulose to XOs was evaluated by an 22 full factorial design with centered face. Optimization of hydrolysis (2.6% substrate and 60 U/g endo-β-1,4-xylanase) with the extract of T. aurantiacus resulted in 42 % conversion XOs. The optimization with the extract of T. reesei resulted in a conversion of hemicellulose up to 20%, with optimal substrate 3.8% and 87.5 U/g endo-β-1,4-xylanase. The efficiency of hydrolysis by enzymes from T. aurantiacus was superior to commercial extracts, and showed ability to degrade hemicelluloses of different compositions (birchwood and oat spelt). The structural differences, such as branches and lignin content did not affect the action of these enzymes. The differences in the efficiency and extent of enzymatic hydrolysis by enzymes of these fungi might have occurred in function of differences in physicochemical properties and specific activity. The enzymatic hydrolysis was more appropriate for production of XOs than autohydrolysis, which generated predominantly xylose and formation of furfural. Despite of short reaction time, the production of XOs was low and purification is needed in order to obtain a final product with desirable characteristics.