Yarrowia lipolytica a la particularité de pousser sur de nombreux substrats hydrophobes et de les métaboliser via la β-oxydation ou de les stocker dans des corps lipidiques. Le premier contact entre la cellule et les substrats hydrophobes se déroule sur la surface cellulaire. A cette étape, la composition de la paroi cellulaire en protéines, en β-glucane et en chitine pourrait jouer un rôle important sur l'adhésion et la prise en charge des substrats hydrophobes. Dans le cadre de cette thèse, nous avons étudié l'effet d'une source de carbone hydrophobe (par rapport au glucose) et de la composition du milieu de culture sur la structure pariétale et la production de mélanine chez Y. lipolytica. Les résultats de nos analyses biochimiques et moléculaires ont montré que l'oléate de méthyle (un composé utilisé comme modèle de source de carbone hydrophobe) a induit des modifications au niveau de la paroi cellulaire et que ces modifications ont conduit ou non à l'adhésion de gouttelettes lipidiques à la surface cellulaire ; à une modification du contenu des composés pariétaux ; à la résistance des cellules à des composés toxiques ayant pour cible la paroi cellulaire ; et à la modification des profils d'expression de 27 gènes analysés codant des protéines de paroi cellulaire. L'identité des gènes surexprimés suggère la participation de leurs protéines dans l'intégrité de la paroi cellulaire, dans l'adhésion des gouttelettes lipidiques et dans la réponse au stress par l'oléate de méthyle et/ou le manque d'azote. Nos résultats ont aussi montré que la présence d'oléate de méthyle, huile de ricin et ricinoléate de méthyle a induit la production de DHN-mélanine chez une souche génétiquement modifiée de Y. lipolytica (MTLY40-2p) dont la β-oxydation est affectée

Dissertação(mestrado) - Universidade Federal do Rio Grande, Programa de Pós-Graduação em Engenharia e Ciência de Alimentos, Escola de Química e Alimentos, 2010. / Submitted by Caroline Silva (krol_bilhar@hotmail.com) on 2012-08-13T19:45:26Z No. of bitstreams: 1 dissertao - francisco-1.pdf: 1598375 bytes, checksum: 011e4e3014589fe2de68fb5af51b8aaf (MD5) / Approved for entry into archive by Bruna Vieira(bruninha_vieira@ibest.com.br) on 2012-12-02T12:20:25Z (GMT) No. of bitstreams: 1 dissertao - francisco-1.pdf: 1598375 bytes, checksum: 011e4e3014589fe2de68fb5af51b8aaf (MD5) / Made available in DSpace on 2012-12-02T12:20:25Z (GMT). No. of bitstreams: 1 dissertao - francisco-1.pdf: 1598375 bytes, checksum: 011e4e3014589fe2de68fb5af51b8aaf (MD5) Previous issue date: 2010 / A crescente demanda de energia em tempos de diminuição no fornecimento de combustível fóssil tem atraído a atenção para a busca por fontes alternativas, que venham a substituir o uso do petróleo, do carvão e do gás natural. Neste contexto, o biodiesel produzido a partir de óleos vegetais aparece como uma alternativa para substituição ao óleo diesel. Esta possibilidade de utilização de combustíveis de origem agrícola vem apresentando um potencial promissor no mundo inteiro, sendo um mercado que cresce aceleradamente devido à sua enorme contribuição ao meio ambiente, com a redução qualitativa e quantitativa dos níveis de poluição ambiental, principalmente nos grandes centros urbanos, e também servindo como fonte estratégica de energia renovável em substituição ao óleo diesel e outros derivados do petróleo. A produção de biodiesel a partir dos óleos vegetais fornece um sistema bifásico, sendo uma fase não polar de ésteres de ácidos graxos e outra mais densa constituída por glicerina e outros componentes residuais do processo. Considerando que na produção de biodiesel há geração de aproximadamente 10% de glicerina, com a mistura constituída de 5% de biodiesel ao diesel (B5) estimativas apontam, em 2013, uma geração de cerca de 150 mil toneladas por ano de glicerina. Uma vez que os mercados tradicionais de glicerina não conseguirão absorver esta oferta de produto neste cenário, este trabalho vem contribuir em inovações tecnológicas relacionadas ao aproveitamento da glicerina, mais especificamente na conversão por via biotecnológica da glicerina gerada na síntese de biodiesel em biomassa de interesse comercial, como fonte de nutrientes. Os efeitos da composição do meio de preparo de inóculo e da temperatura de incubação sobre o crescimento da levedura Yarrowia lipolytica NRRL YB – 423, cultivada em meio à base de glicerina residual, foram estudados em incubadora rotatória, verificando-se que a temperatura de 25°C e utilizando um meio de inóculo com mesma composição do meio de produção foram mais adequados ao crescimento microbiano, atingindo uma concentração de biomassa de 17,7 g.L-1. Em biorreator de bancada, um planejamento fatorial para avaliar a aeração e agitação (22 ensaios mais 3 pontos centrais) foi realizado. Os ensaios indicaram agitação de 200 rpm e aeração de 1 vvm como a melhor condição de cultivo, atingindo 19,14 g.L-1 de concentração de biomassa máxima média, conteúdo protéico médio de 13,55% e teor lipídico de 7,87%. Nestas condições, o cultivo em biorreator de bancada, em relação ao cultivo em frascos agitados, levou a incrementos significativos na biomassa máxima, velocidade específica máxima de crescimento celular e produtividade, respectivamente de 1,22, 1,53 e 2,36 vezes. Com base na determinação do perfil de ácidos graxos e aminoácidos, a biomassa mostrou-se fonte promissora de ácidos graxos essenciais, em particular o ácido linoléico (49,16%) e aminoácidos essenciais como isoleucina, valina, treonina e lisina, que apresentaram escores químicos superiores ao padrão FAO/WHO, respectivamente 1,42, 1,42, 1,30 e 1,17. Portanto a biomassa mostrou-se promissora para utilização como fonte de nutrientes, em particular para alimentação animal. / The crescent demand of energy in times of decreasing in the supply of fossil fuel has been attracting the attention for the search for alternative sources, which will come to substitute the use of the petroleum, coal and natural gas. In this context, the vegetable oils appear as an alternative for substitution to the diesel oil. This possibility of using fuels from agricultural sources has shown a promising potential in the whole world, with a market that is growing rapidly because of its enormous contribution to the environment, with the qualitative and quantitative reduction of the levels of environmental pollution, mainly in the great urban centers, and also serving as strategic source of renewable energy in substitution to the diesel oil and others derived of the petroleum. The production of biodiesel from vegetable oils provides a biphasic system, being a non-polar phase of esters of fatty acids and other more dense consisting of glycerin and other waste components of the process. Considering that in the biodiesel production there is a generation of approximately 10% of glycerin, with the mixture consisting of 5% of biodiesel to diesel (B5) estimates indicate, in 2013, the generation of 150,000 tons per year. Since the traditional markets of glycerin can not absorb this additional supply of product on this scene, this work will contribute in technological innovations related to the use of glycerin, more specifically in the biotechnology conversion of glycerin generated in the synthesis of biodiesel in biomass of commercial interest, as source of nutrients. The effects of temperature and inoculum medium composition on the performance of yeast Yarrowia lipolytica NRRL YB – 423, growing on a glycerin-based medium, were studied in shaken flasks, verifying that the temperature of 25°C and the inoculum medium with the same composition of production medium were the most appropriate conditions for microorganism growth, reaching a biomass concentration of 17.7 g.L-1. In the bioreactor bench scale, a factorial design involving two variables (22 assays plus three central points) was performed, where the studied variables were agitation and aeration. The assays showed agitation of 200 rpm and aeration of 1 vvm as the best culture conditions, reaching a concentration of 19.14 g.L-1 of biomass with protein content of 13.55% and lipid content of 7.88 %. In these conditions, the cultivation in the bioreactor, in relation to the shaken flasks cultivation, leaded to significant increases in the maximum biomass concentration, maximum specific growth rate and productivity, respectively 1.22, 1.53 and 2.36 times. Based on the fatty acid and aminoacid profiles, the biomass showed to be a promising source of essential fatty acids, in particular linoleic acid (49.16%), and essential aminoacids such as isoleucine, valine, threonine and lysine, which presented chemical scores superior than FAO/WHO standard, respectively 1.42, 1.42, 1.30 and 1.17.Therefore biomass showed to be promise for use as a source of nutrients, particularly for animal feed.

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Yarrowia lipolytica a la particularité de pousser sur de nombreux substrats hydrophobes et de les métaboliser via la β-oxydation ou de les stocker dans des corps lipidiques. Le premier contact entre la cellule et les substrats hydrophobes se déroule sur la surface cellulaire. A cette étape, la composition de la paroi cellulaire en protéines, en β-glucane et en chitine pourrait jouer un rôle important sur l’adhésion et la prise en charge des substrats hydrophobes. Dans le cadre de cette thèse, nous avons étudié l’effet d’une source de carbone hydrophobe (par rapport au glucose) et de la composition du milieu de culture sur la structure pariétale et la production de mélanine chez Y. lipolytica. Les résultats de nos analyses biochimiques et moléculaires ont montré que l’oléate de méthyle (un composé utilisé comme modèle de source de carbone hydrophobe) a induit des modifications au niveau de la paroi cellulaire et que ces modifications ont conduit ou non à l’adhésion de gouttelettes lipidiques à la surface cellulaire ; à une modification du contenu des composés pariétaux ; à la résistance des cellules à des composés toxiques ayant pour cible la paroi cellulaire ; et à la modification des profils d’expression de 27 gènes analysés codant des protéines de paroi cellulaire. L’identité des gènes surexprimés suggère la participation de leurs protéines dans l’intégrité de la paroi cellulaire, dans l’adhésion des gouttelettes lipidiques et dans la réponse au stress par l’oléate de méthyle et/ou le manque d’azote. Nos résultats ont aussi montré que la présence d’oléate de méthyle, huile de ricin et ricinoléate de méthyle a induit la production de DHN-mélanine chez une souche génétiquement modifiée de Y. lipolytica (MTLY40-2p) dont la β-oxydation est affectée / Yarrowia lipolytica can grow on many hydrophobic substrates and metabolize them via the β-oxidation pathway or store them into lipid bodies. The first contact between the cell and the hydrophobic substrates is by the cell wall. In this step, cell-wall proteins (CWP), β-glucane and chitin of the cell wall could play an important role for the adhesion and uptake of hydrophobic substrates. The aim of this work was to study the effect of a hydrophobic carbon source (compared with glucose) and the culture medium composition on the cell wall composition and the melanin production by Y. lipolytica. The results of our biochemical and molecular analysis showed that the presence of methyl oleate and the nutrients composition of the culture media have induced some modifications at the cell wall level. These modifications were linked with the adhesion or not of the lipid droplets to the cell surface; with a modified content of the cell wall components; with a resistance to compounds that are toxic for the cell wall, and with the modification of the expression patterns of 27 CWP genes analyzed in this work. The identity of the over-expressed CWP genes suggests the participation of their proteins in the cell wall integrity, in the adhesion of lipid droplets and in the stress response to methyl oleate and/or the nitrogen starvation. Our results have also shown that the presence of the lipids methyl oleate, castor oil and methyl ricinoleate induced the production of DHN-melanin by a mutant strain in which the β-oxidation is affected / Yarrowia lipolytica tiene la capacidad de crecer sobre numerosos substratos hidrofóbicos y demetabolizarlos a través de la β-oxidación o de almacenarlos en cuerpos lipídicos. El primercontacto entre la célula y los substratos hidrofóbicos se lleva a cabo mediante la pared celular.En esta etapa, la composición en proteínas, β-glucano y quitina de la pared celular podríajugar un papel importante en la adhesión y la toma de substratos hidrofóbicos. En el presentetrabajo se estudió el efecto de una fuente de carbono hidrofóbica (en comparación conglucosa) y la composición del medio de cultivo sobre la composición de la pared celular y laproducción de melanina en Y. lipolytica.Los resultados de nuestros análisis bioquímicos y moleculares mostraron que el oleato demetilo (un compuesto utilizado como fuente de carbono hidrofóbica) indujo modificacionesen la pared celular y estas modificaciones condujeron al aumento o la disminución de laadhesión de gotas lipídicas a la superficie celular; a la modificación del contenido de loscompuestos de la pared celular; a la resistencia de las células a compuestos tóxicos que tienencomo blanco la pared celular; y a la modificación del perfil de expresión de 27 genes quecodifican para proteínas putativas de la pared celular. La expresión de algunos de estos genesse indujo desde las primeras horas de cultivo en presencia de oleato de metilo. La identidad delos genes sobre-expresados sugiere la participación de sus proteínas en mecanismos como laintegridad de la pared celular, la adhesión de las gotas lipídicas a la superficie celular y larespuesta a estrés inducido por oleato de metilo y/o por la falta de nitrógeno en el medio.Nuestros resultados también mostraron que la presencia de oleato de metilo, de aceite dericino y de ricinoleato de metilo en el medio de cultivo, indujo la producción de un pigmentocafé en una cepa mutante de Y. lipolytica (MTLY40-2p) afectada en la β-oxidación. Ademásobservamos que el perfil espectroscópico la pared celular de la mutante MTYL40-2p, semodifica en función del substrato hidrofóbico presente en el medio de cultivo. Nuestrosresultados sugieren que el pigmento café es DHN-melanina y que la ausencia de peptona en elmedio de cultivo afecta la biosíntesis de esta melanina. A partir de un análisis in silicoproponemos los genes putativos para la biosíntesis de DHN-melanina en Y. lipolytica

Les acides dicarboxyliques (DCA) sont des composés de base pour la production de polymères, plastiques, lubrifiants, antibiotiques et parfums. Bien que de grand intérêt, les DCA qui comportent une chaîne aliphatique supérieure à douze atomes de carbone sont difficilement synthétisables par la voie chimique. L'objet de cette étude est de développer un procédé biotechnologique pour produire ces composés par bioconversion de matières premières renouvelables (huile de tournesol oléique) via la levure Yarrowia lipolytica. <br />Chez les souches sauvages, les acides gras sont principalement dégradés par la voie de la Β-oxydation. Nous avons bloqué la première étape de la Β-oxydation par disruption séquentielle des six gènes codant les acyl-CoA oxydases permettant ainsi de réorienter le flux d'acides gras vers l'ω-oxydation qui conduit à la production de DCA. L'amélioration de la production des DCA a été obtenue par l'augmentation de l'activité d'hydroxylation, impliquée dans l'ω-oxydation, en surexprimant les gènes codant la NADPH cytochrome P450 réductase et les 12 cytochromes P450. Néanmoins, la moitié du substrat s'accumule dans les corps lipidiques. Ce stockage a été réduit, par disruption de gènes, entraînant ainsi une augmentation du rendement de bioconversion.<br />Enfin, l'étude de mutants d'insertion a révélé l'implication de 5 ABC transporteurs PDR qui confèrent la résistance aux drogues. L'étude fonctionnelle de cette famille a démontré que le transporteur Abc1p serait un exporteur membranaire spécifique des alcanes à longue chaîne carbonée, constituant le premier ABC transporteur PDR responsable de l'export de molécules physiologiques. <br /> Ces travaux ont permis de développer une souche améliorée de Y. lipolytica pour la production de DCA à partir d'huiles végétales.

Yarrowia lipolytica est une levure oléagineuse qui possède un remarquable potentiel de croissance et d'accumulation de lipides dans des milieux hydrophobes. Au cours de cette étude nous avons approfondi nos connaissances du métabolisme lipidique chez cette levure en mettant l'accent sur la capacité d'accumulation et de dégradation des lipides, la régulation et les interactions des différentes voies métaboliques. L'étude des enzymes du métabolisme des microorganismes oléagineux et de leurs particularités fonctionnelles, en comparaison avec celles des microorganismes non oléagineux, a permis de se focaliser sur des enzymes candidates pour être impliquées dans le caractère oléagineux. L'objectif de cette étude est de combiner les connaissances physiologiques sur cette levure avec les outils génétiques existants afin d'utiliser Y. lipolytica comme une usine cellulaire pour la production de grandes quantités de lipides ayant un intérêt industriel. Afin de rediriger les flux de carbone vers la synthèse de lipides, le gène GUT2, qui code l'un de deux isomères de la glycérol-3-phosphate déshydrogénase, ainsi que la voie de la β-oxydation ont été invalidés chez Y. lipolytica, conduisant à une forte augmentation de l'accumulation des lipides. Afin d'identifier l'étape limitante de la synthèse des TAG et de construire des souches aux profils lipidiques modifiés nous avons joué sur le niveau d'expression des acyltransférases et des désaturases. La contribution relative des acyltransférases dépend de la phase de croissance et leurs affinités vis-à-vis des substrats donneurs d'acyle sont complémentaires. La modification des désaturases a permis d'accumuler des acides gras spécifiques, démontrant ainsi qu'il est possible de moduler le profil des lipides accumulés chez Y. lipolytica. Cette étude nous a permis de construire des souches hyperaccumulatrices aux profils lipidiques tels qu'ils permettront de leur trouver des applications biotechnologiques dans la filière des biocarburants ou dans l'industrie oléochimique en tant qu'unités alternatives pour la production de substrats spécifiques.

Le métabolisme du soufre, qui occupe une place centrale au sein de la cellule, est aussi important lors de la fabrication des fromages à pâte molle à croûte lavée. L'écosystème fromager assimile les acides aminés soufrés et peut ainsi produire des composés soufrés volatils (CSVs) indispensables à la flaveur de ces produits. Nous avons étudié le métabolisme du soufre chez deux micro-organismes d'affinage, les levures hémiascomycètes Kluyveromyces lactis et Yarrowia lipolytica. L'analyse in silico du phylum des hémiascomycètes nous a donné pour la première fois une vision évolutive de ce métabolisme. Nous avons relevé des différences fondamentales au niveau de la synthèse de la cystéine mais aussi au niveau des enzymes impliquées dans la production de CSVs. Cette analyse constitue une base solide pour l'étude du métabolisme du soufre. Nous avons combiné plusieurs approches exploratoires (transcriptome, métabolome, dosage des CSVs) afin d'avoir une vision globale de ce métabolisme chez K. lactis et Y.lipolytica. Les différences observées se situent notamment au niveau des voies de synthèse de la cystéine et de la taurine. La production de CSVs semble liée à la surexpression de transaminases spécifiques à chaque espèce combinée à l'accumulation de méthionine intracellulaire. L'affinage du fromage dépendant de tout un écosystème, nous avons également étudié l'interaction entre deux micro-organismes d'affinage, K. lactis et Brevibacterium aurantiacum via une approche transcriptomique, en comparant l'expression d'une co-culture à celle des cultures pures. Nous avons observé de profondes modifications métaboliques touchant notamment le métabolisme du carbone et celui de la biotine.

This thesis purposes and develops inductively coupled LC (inductive-capacitive) pH sensors based on pH-sensitive electrode pair. The LC resonator circuit is based on a varactor and measures the low frequency potential difference. For wireless pH monitoring, the resonator circuit is integrated with a pH-sensitive electrode pair. This sensor demonstrates a linear response over 2 to 12 pH dynamic range, 0.1 pH accuracy and long-term stability. Accurate measurement of pH using electrode-based sensors is affected by temperature variation. A technique of simultaneously measuring two parameters, pH and temperature, with a single RLC resonator based sensor is presented. An algorithm is developed, which applies both pH and temperature measurement to incorporate temperature compensation in pH measurement. For in-fluid applications, an encapsulation method is applied to the LC resonator based sensor to reduce the influence of medium permittivity and conductivity on the sensor measurement. Non-invasive way to obtain reliable pH information from bacterial culture bioprocesses is demonstrated with the fluid embeddable sensor. The pH sensor is remodeled to an acidic and basic volatile sensor by embedding the electrodes in a hydrogel host electrolyte. Tests demonstrate that the volatile sensor has a detection limit of 1.5 ppm and 2 ppm for ammonia and acetic acid vapor, respectively. Application of the volatile sensor to fish spoilage monitoring shows that the sensor is capable of detecting the product rejection level with good sensitivity in real-time. It is important to develop low cost wireless passive pH sensor technologies for embedded applications such as bioprocess and food spoilage monitoring. The electrode-based passive LC sensor approach employed in this thesis overcomes drawbacks of some of the early developed passive pH sensors and can lead to an inexpensive implementation using printed electronics technology.

Yeasts are traditionally used as part of the surface microflora in surface-ripened cheeses, where they contribute positively to the flavour of the cheese. The primary objective of this study was to investigate the potential of three dairy yeasts to provide attributes as adjuncts in anaerobically ripened cheeses. Geotrichum candidum (B9001), Yarrowia lipolytica (B9014) and Candida kefyr (B9006), obtained from the Fonterra Co-operative Group Ltd, Palmerston North, New Zealand, were studied. They showed diverse metabolic activities in laboratory media, which were influenced by the growth conditions. The metabolic activities of special interest were the lipase and proteinase activities and the production of volatile compounds, as these are important for cheese ripening and flavour development. Lipase activity (p-nitrophenyl butyrate assay) and proteinase activity (fluorescein isothiocyanate β-casein assay) were determined in three fractions prepared from yeast cultures and designated as extracellular fraction, washed-cell fraction and intracellular fraction. Lipase activity of G. candidum was detected only in the extracellular fraction and increased five fold when induced by safflower oil in a shake culture (0.16 µM/min/mL supernatant at 24 h). Lipase expression was delayed in static cultures. Y. lipolytica showed lipase activity in extracellular, washed-cell and intracellular fractions under all conditions. Static cultures in both glucose and safflower oil media showed higher lipase activity than shake cultures. The lipase activity of Y. lipolytica was higher in the late stationary phase than in the log phase under all conditions tested. The highest lipase activity was detected in a 192 h static culture grown in safflower oil medium (0.13 µM/min/mg dry cell weight, 0.3 µM/min/mg dry cell weight and 4.29 µM/min/mL supernatant in the intracellular, washed-cell and extracellular fractions respectively). C. kefyr did not show any lipase activity (< 0.03 µM/min/mL culture) under any of the growth conditions tested. Proteinase activity was detected in the intracellular fraction of 72 h shake cultures of G. candidum grown in both glucose medium and safflower oil medium (154 and 122 RFU/min/mg dry cell weight respectively) but was not detected in static cultures. Proteinase activity was absent in the Y. lipolytica cultures under all conditions tested (< 10 RFU/min/mL culture). C kefyr showed low proteinase activity (12-74 RFU/min/mL supernatant) in the extracellular fraction only in shake cultures grown in glucose medium. Volatile compounds of the headspace were sampled and analysed using solid phase microextraction (SPME) and gas chromatography-mass spectrometry (GC-MS). The concentrations of volatile compounds were highest in shake cultures grown in glucose medium for all three yeasts. All yeasts produced several alcohols. Several esters were also detected in the G. candidum and C. kefyr cultures whereas aldehydes were detected only in the G. candidum cultures. G. candidum and Y. lipolytica were selected for cheese production trials because of their active cheese ripening enzymes. These yeasts, grown under different conditions, were added to Cheddar cheese (10 L vat). The yeast adjuncts influenced the cheese ripening by lipolysis [in terms of the production of free fatty acids (FFAs) analysed by gas chromatography-flame ionisation detector (GC-FID)] and the production of volatile compounds (SPME-GC-MS), whereas proteolysis (analysed by size-exclusion high performance liquid chromatography) by yeast enzymes was not obvious. The influence of Y. lipolytica as an anaerobic adjunct to cheese ripening was dependent on the growth conditions used during its propagation in laboratory media. The concentration of total FFAs was very high (37.1 mg/g cheese at 6 months) when a 192 h Y. lipolytica culture grown in safflower oil medium was added to a cheese make, whereas the cultures grown in glucose medium did not have any detectable effect. Addition of G. candidum culture to the cheese curd was more effective than its addition to the cheese milk. Both G. candidum and Y. lipolytica lipase(s) selectively hydrolysed the long-chain unsaturated fatty acids from the milk triglyceride in the cheese environment. Also, Y. lipolytica lipase exhibited some selectivity towards hydrolysis of butyric acid from the milk fat in the cheese. 2-Heptanone, 3-methyl-2-butanone and 2-nonanone were detected (1-10 x 106 relative peak area) only in the cheeses with yeast adjuncts but not in the control cheese. Enhancement of the production of both conjugated linoleic acid (CLA) and ethyl esters in a washed-curd, dry-salted cheese (375 L vat), made with G. candidum, Y. lipolytica, Propionibacterium freudenreichii ssp. shermanii, Lactobacillus fermentum and Lb. rhamnosus, was only partially successful. Higher concentrations of ethyl esters (> five fold; analysed by SPME-GC-MS) were produced in the cheeses made with yeast adjuncts. However, the concentration of total CLA (free plus esterified; analysed by GC-FID) did not increase although a higher concentration of free linoleic acid (> 10 fold), the substrate for CLA synthesis, was produced in the cheeses made with yeast adjuncts. A study of the formation of aromatic volatile compounds by C. kefyr in a medium containing L-phenylalanine (L-phe) showed that the yeast's ability to produce phenyl ethanol, phenyl ethyl acetate and benzaldehydc (analysed by SPME-GC-MS) was enhanced with an increase in the initial L-phe concentration (in the experimental range; analysed by enzymatic assay using phenylalanine ammonia lyase), but the yield was very low (20-27%). The initial concentration of glucose (in the experimental range; analysed by enzymatic assay using Peridochrom glucose reagent) did not affect the production of these aromatic volatile compounds. This study successfully showed that the yeasts G. candidum and Y. lipolytica, when used as anaerobic adjuncts, can influence the ripening and flavour development in Cheddar and washed-curd, dry-salted cheeses. The study also showed the capability of C. kefyr to produce aromatic volatile compounds from amino acid fermentation but the yields need to be increased by further manipulation of the medium components and the culture conditions before this capability can be used commercially.

Diplomová práce se zabývá vlivem uhlíkatého plniva na životaschopnost a produkci extracelulárních látek vybrané bakterie Bacillus subtilis (CCM 1999) a kvasinky Yarrowia lipolytica (CCY 29-26-52). Antimikrobiální aktivita těchto částic, přítomných v kultivačním mediu, byla sledována pomocí následujících parametrů: růst daného mikroorganismu, produkce extracelulárních proteinů a v poslední řadě byla monitorována produkce extracelulárních polymerních substancí, které mají úzkou souvislost s tvorbou biofilmu. Suspenze materiálů (0,135 mg/mL) byly připraveny ve dvou rozdílných kultivačních mediích; tzn. živné medium s obsahem glukózy pro Bacillus subtilis a bazální medium s přídavkem Tweenu 80 pro Yarrowia lipolytica, a media byla inokulována příslušným typem mikroorganismu. Experimenty probíhaly po dobu 6 dnů při rychlosti třepání 160 rpm a teplotě 30 °C pro Bacillus subtilis a 28 °C pro Yarrowia lipolytica. Testovány byly celkem tři typy uhlíkatého nanomateriálu, získané z Katedry anorganické chemie, Vysoké školy chemicko-technologické v Praze. Tyto materiály specifikované jako materiál “A”, “B” a “C” se navzájem lišily velikostí částic a stupněm oxidace. Na základě skríningových studií byla vybrána koncentrace testovaného materiálu 0,135 mg/mL a rychlost třepání 160 rpm. Metodou měření optické hustoty vzorku při 600 nm byly sestaveny a porovnány růstové křivky obou mikroorganismů v přítomnosti testovaných nanočástic po dobu 5 dní. Tímto způsobem bylo zjištěno, že přítomnost nanočástic v mediu nemá velký vliv na růst zkoumaného mikroorganismu. Tato metoda, je však pouze orientační, protože se nevyhneme chybě díky přítomnosti mrtvých buněk. Dále byla testována produkce celkových a extracelulárních proteinů daným mikroorganismem v přítomnosti testovaných nanočástic. Nebyla však pozorována výrazná odchylka hodnot od hodnot kontrolního vzorku, který neobsahoval testovaný materiál. Na základě metod počítání kolonií (Bacillus subtilis) a buněk (Yarrowia lipolytica) byly určeny ztráty životaschopnosti mikroorganismu ve 3 časech (6, 48 a 144 hodin); v kratším časovém intervalu byl růst spíše podporován. Dále byla monitorována produkce extracelulárních polymerních substancí (EPS), tedy proteinů, redukujících substancí a polysacharidů. Tyto látky byly vylučovány daným mikroorganismem do prostředí v průběhu 24 hodin. Bacillus subtilis produkoval EPS ve větší míře než Yarrowia lipolytica. Předpokládáme, že produkce EPS by mohla souviset s tvorbou biofilmu, který chrání buňky před toxicitou nanočástic.