RNA-bindende Proteine sind zentrale Regulatoren der Genexpression, aber ihre Funktionen bei der Koordinierung von Zellschicksalsentscheidungen sind unzureichend verstanden. In dieser Studie haben wir RNA interactome capture angewandt, um die globalen Dynamiken des RNA-gebundenen Proteoms während der Auflösung der Pluripotenz und neuronaler Differenzierung zu bestimmen. Wir haben entdeckt, dass 30-40% der RNA-bindenden Proteine sehr dynamisch während der Zellschicksalentscheidungen sind, die Abundanzdynamiken dieser Proteine aber nicht hauptursächlich dafür zu sein scheinen. Basierend auf unseren Daten haben wir ZAP (ZC3HAV1) als einen Faktor identifiziert, der mit Pluripotenz assoziiert ist. Um die Rolle von ZAP in der Stammzellbiologie zu analysieren, haben wir PAR-CLIP, SLAMseq und einen Differenzierungsassay angewandt. Unsere Daten haben gezeigt, dass ZAP mehr als 2,000 mRNA-Transkripte innerhalb des murinen Stammzelltranskriptoms in Abhängigkeit von CG-Dinukleotiden bindet. Zieltranskripte sind angereichert mit Genfunktionen in Zell-Zell-Interaktionen, Gewebemorphogenese und Pluripotenzregulation und werden in Abwesenheit von ZAP stabilisiert. Auβerdem haben wir herausgefunden, dass Depletion von ZAP zu flacherer und breiterer Koloniemorphologie von Stammzellen bei gleichzeitiger Fehlexpression von hunderten von Genen inklusive Lineage-Faktoren führt. Desweiteren führt Abwesenheit von ZAP zu erhöhter Geschwindigkeit bei der Auflösung der Pluripotenz. Zusammengefasst stellen wir die These auf, dass ZAP ein multi-modaler Regulator der Pluripotenz ist. ZAP agiert als positiver Regulator während Aufrechterhaltung der Pluripotenz, während es am Anfang der Pluripotenzauflösung pluripotenz-fördernde Faktoren herunterreguliert. Schlussendlich demonstriert diese Studie, wie die Erforschung von Dynamiken des RNA-gebundenen Proteoms während Zellschicksalsentscheidungen neue Wege öffnet, um die Funktion von RNA-bindenden Proteinen im entwicklungsbiologischen Kontext zu analysieren. / RNA-binding proteins are key regulators of gene expression, but their functions in coordinating cell fate transitions are poorly understood. In this study, we applied RNA interactome capture to determine the global dynamics of the RNA-bound proteome during dissolution of pluripotency and neuronal differentiation. We discovered that 30-40% of RNA-binding proteins are highly dynamic during cell fate transitions and that these dynamics do not appear to be predominantly governed by alterations in their abundance. Based on our data, we identified ZAP (ZC3HAV1) as a factor highly associated with pluripotency. In order to dissect the role of ZAP in mESC biology, we applied a variety of approaches including PAR-CLIP, SLAMseq and pluripotency exit reporter assays. We found that ZAP binds more than 2,000 mRNAs in the mESC transcriptome in a CG dinucleotide-dependent manner. Targets are enriched for transcripts encoding cell-cell adhesion, tissue morphogenesis and pro-pluripotency regulators and stabilized in absence of ZAP. Furthermore, we found that ZAP depletion leads to flattened and spreading stem cell colony morphology, concomitant misexpression of hundreds of transcripts including lineage factors and accelerated early dissolution of pluripotency. In conclusion, we propose that ZAP is a multi-modal stem cell RNA-binding protein acting as a positive regulator in maintenance of pluripotency while aiding downregulation of pro-pluripotent factors at the onset of differentiation. Ultimately, this study demonstrates how exploration of RNA-bound proteome dynamics during cell fate transitions can open paths to dissecting functions of RNA-binding proteins in a developmental context.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:HUMBOLT/oai:edoc.hu-berlin.de:18452/26097 |
| Date | 24 October 2022 |
| Creators | Kastelic, Nicolai |
| Contributors | Landthaler, Markus, Selbach, Matthias, Blüthgen, Nils |
| Publisher | Humboldt-Universität zu Berlin |
| Source Sets | Humboldt University of Berlin |
| Language | English |
| Detected Language | German |
| Type | doctoralThesis, doc-type:doctoralThesis |
| Format | application/pdf |
| Rights | (CC BY-NC-ND 4.0) Attribution-NonCommercial-NoDerivatives 4.0 International, https://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/ |
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