INTRODUÇÃO: Os macrófagos são células inflamatórias importantes no desenvolvimento e progressão do enfisema pulmonar e dependendo do estímulo do microambiente estas células podem ser diferenciadas em fenótipos M1 ou fenótipo M2. Os macrófagos de fenótipo M1 são reconhecidos como pró-inflamatórios enquanto que os macrófagos de fenótipo M2 são reconhecidos pela ação anti-inflamatória. O objetivo deste estudo foi caracterizar a polarização dos macrófagos em fenótipos M1 e M2 nos diferentes modelos experimentais de indução de enfisema pulmonar. MÉTODOS: foram utilizados camundongos C57BL/6 machos e foram divididos em quatro grupos experimentais, Grupo PPE (Elastase Pancreática de Porco): Animais que receberam instilação intranasal de 50 microL de PPE (0,667UI) com eutanásia no 28° dia; Grupo Salina: Animais que receberam instilação intranasal de 50 microL de soro fisiológico (SF) (0,9%) com eutanásia no 28° dia; Grupo Fumo: Animais que foram expostos à fumaça de cigarro durante 30 minutos, duas vezes por dia, 5 dias por semana consecutivos durante 12 semanas e Grupo Controle: Animais que foram mantidos no biotério e expostos ao ar ambiente por 12 semanas. Após eutanásia, os pulmões foram removidos, fixados em formaldeído e em seguida, foram feitos cortes para análise do intercepto linear médio (Lm) e contagem de células positivas para os macrófagos totais (MAC-2), interferon-gama (IFN)-gama e fator de necrose tumoral (TNF)-alfa, interleucina (IL)-10, transformação do fator do crescimento (TGF)-beta, metaloproteases (MMP)-9 e -12, no parênquima pulmonar. Pela técnica de ELISA foi avaliado no lavado broncoalveolar (LBA): IFN-gama e IL-12 (fenótipo M1) e IL-4, IL-10 e IL-13 (fenótipo M2). Pela técnica de PCR em tempo-real foi avaliada a expressão gênica para cluster of differentiation 68 (CD68), fator de regulação de interferon (Irf)-5, quimiocinas- CXC (CXCL9) e (CXCL10), o receptor de interleucina (IL)-12b e óxido nítrico sintase (iNOS) (fenótipo M1) e Irf-4, resistin-like molecule alpha (Fizz1), chitinase-3-like protein 3 (Ym1) e arginina-1 (Arg1) (fenótipo M2). RESULTADOS: Nossos resultados demonstraram aumento dos espaços aéreos distais e consequente presença de enfisema pulmonar nos dois grupos avaliados. Observamos redução da expressão gênica para CD68 no grupo PPE em comparação ao seu controle e tendência a aumento da expressão deste gene para o grupo Fumo comparado ao seu controle. A avaliação da expressão gênica para marcadores M1 revelou aumento para CXCL9 e CXCL10 nos grupos PPE, aumento de CXCL9 e redução de CXCL10 no grupo Fumo e redução de IL-12b no grupo Fumo comparados aos seus respectivos controles. A avaliação da expressão gênica para fenótipo M2, demonstrou diminuição de Arg1 e Fizz1 nos grupos PPE comparado ao salina. Pela técnica de ELISA encontramos uma redução de IL-4, IL-10 e IL-13 nos grupos PPE e aumento no grupo Fumo de IL-10, ambos comparados aos seus respectivos controles. Para a contagem de células positivas MAC-2, encontramos o aumento de macrófagos totais nos dois modelos avaliados, para marcadores de fenótipo M1, encontramos aumento de TNF-alfa e IFN-gama nos dois modelos avaliados, para marcadores de fenótipo M2, encontramos aumento de TGF-beta nos dois modelos de enfisema pulmonar avaliado. Entretanto para interleucina-10 encontramos uma redução no grupo PPE e aumento no grupo Fumo, ambos comparados aos seus respectivos controles. CONCLUSÃO: Demonstramos que os modelos induzidos pela exposição a fumaça de cigarro e instilação elastase resultaram em diferentes polarizações de macrófagos devido às diferenças do microambiente e que o modelo experimental de exposição à fumaça de cigarro foi o que melhor representou as características fisiológicas observadas em pacientes DPOC / Macrophages are important inflammatory cells on development and progression of pulmonary emphysema. Depending on microenvironment stimuli, these cells can differentiate into M1 or M2 phenotypes. Macrophages M1 phenotype play proinflammatory role whereas macrophages M2 phenotype play anti-inflammatory role. Our objective was to characterize the polarization of macrophages in M1 and M2 phenotypes in different experimental models of pulmonary emphysema induction. Male C57BL/6 mice were used and divided into four experimental groups. Group PPE (Porcine Pancreatic Elastase): Animals received intranasal instillation of 50 microL of PPE (0.677 IU) with euthanasia on the 28th day; Saline Group: Animals which received intranasal instillation of 50 microL SF (0.9%) with euthanasia on the 28th day; Cigarette Smoke Group: Animals exposed to cigarette smoke for 30 minutes, twice a day, 5 days a week for 12 weeks and Control Group: Animals that were exposed to ambient air for 12 weeks. After euthanasia, the lungs were removed, fixed in formaldehyde and then sectioned for analysis of the mean linear intercept (Lm) and counting of cells positive for total macrophages (MAC-2), interferon gamma (IFN-gama), factor Tumor necrosis (TNF-alfa), interleukin (IL)-10, transforming growth factor beta (TGF)-beta, matrix metalloproteinases- (MMP)-9 e -12 in the lung parenchyma through the immunohistochemistry technique. In order to evaluate the expression of proteins we used ELISA technique for IFN-gama and IL-12 (M1 phenotype) and IL-4, IL-10 and IL-13 (M2 phenotype) by bronchoalveolar lavage (BAL). They were also evaluated by gene expression analysis by the Real Time-PCR technique for cluster of differentiation 68 (CD68), interferon regulating factor (Irf-5), chemokines CXC (CXCL9) and (CXCL10), subunit beta of interleukin 12 (IL-12b) and nitric oxide synthase (iNOS) and for M2 phenotypes were analyzed Irf4, found in inflammatory zone- 1(Fizz1), chitinase type-1 (Ym1) and arginine-1 (Arg1) molecules. RESULTS: Our results demonstrated an increase in distal air spaces and consequent presence of pulmonary emphysema in both groups. Also, we observed reduction of CD-68 gene expression in PPE group compared to his control and tendency to increase the expression on Cigarette Smoke group (CS) compared to his Control. The evaluation of gene expression for M1 markers revealed an increase for CXCL9 and CXCL10 in the PPE groups, increase of CXCL-9 and reduction of CXCL10 on CS group and reduction of IL-12b on CS group compared to their respective controls. The evaluation of gene expression for M2 phenotype demonstrated a decrease of Arg1 and Fizz1 in PPE groups compared to saline group. By ELISA technique, we found reduction of IL-4, IL-10 and IL-13 on PPE groups, while we did not observe statistical difference in CS group, both compared to their respective controls. The TNF-alfa and IFN-gama positive cells counts showed an increase for both groups in the two models evaluated, for M2 phenotype we found an increase for TGF-beta in both emphysema models whereas for IL-10 we found a reduction in PPE group and increase on CS group, both compared to their respective controls. CONCLUSIONS: We demonstrated that the models induced by exposure to cigarette smoke and elastase instillation resulted in different macrophages polarizations due to differences in the microenvironment and that the experimental model of exposure to cigarette smoke was the one that best represented the physiological characteristics observed in COPD patients
| Identifer | oai:union.ndltd.org:usp.br/oai:teses.usp.br:tde-11022019-104531 |
| Date | 22 November 2018 |
| Creators | Kohler, Júlia Benini |
| Contributors | Lopes, Fernanda Degobbi Tenorio Quirino dos Santos |
| Publisher | Biblioteca Digitais de Teses e Dissertações da USP |
| Source Sets | Universidade de São Paulo |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | Portuguese |
| Type | Dissertação de Mestrado |
| Format | application/pdf |
| Rights | Liberar o conteúdo para acesso público. |
Page generated in 0.0019 seconds