Uno de los problemas a los que se enfrenta la agricultura son los daños
producidos por los virus que causan cada año considerables pérdidas
económicas en diversos cultivos de todo el mundo. El control de las
enfermedades virales es difícil debido a su compleja y dinámica epidemiología,
con casos frecuentes de emergencia y rápida dispersión a escala global, así
como por su gran capacidad evolutiva que les permite superar distintas
estrategias de control, como por ejemplo el cultivo de variedades resistentes
obtenidas por mejora genética.
El primer paso para evaluar el estado sanitario de un cultivo y poder
aplicar un programa de manejo integrado es disponer de métodos de
diagnóstico y detección de los principales virus que sean específicos, fiables,
rápidos y sensibles. Dada la situación dinámica de las virosis, en la que
continuamente están apareciendo nuevos virus o variantes, es recomendable
que los métodos de diagnóstico puedan desarrollarse rápidamente para
responder a la demanda y que sean flexibles de manera que se pueda ajustar
al nivel de especificidad requerido (no solamente para la especie viral sino
también para categorías taxonómicas superiores, como género y familia o
inferiores como cepa o grupo de aislados virales). En este respecto, los
métodos moleculares basados en la reacción en cadena de la polimerasa
(polymerase chain reaction, PCR) y la hibridación molecular de ácidos
nucleicos cumplen estos criterios. Los métodos de PCR tienen la ventaja de ser
muy sensibles mientras que los basados en la hibridación permiten analizar
simultáneamente un elevado número de muestras. Una modalidad, la
hibridación de flujo de improntas vegetales (flow-through hybridization of
tissue prints), recientemente desarrollada, supone una reducción drástica del
tiempo necesario para el análisis al evitar el procesamiento de las muestras y
acelerar el proceso de hibridación. En el desarrollo, tanto de la PCR como de la
hibridación, es necesario conocer la secuencia nucleotídica de al menos una
porción del genoma del virus que se quiere detectar, pero si se quiere sacar el
máximo provecho, por una parte, hay que estimar la variabilidad genética
entre los distintos aislados del virus, para así evitar o minimizar los falsos
negativos (ej. reacción negativa con algunos aislados genéticamente
divergentes), y por otra parte, hay que considerar la relación genética del virus
objeto con repecto a otros virus, para evitar falsos positivos (ej. reacción
positiva con aislados pertenecientes a otros virus).
En esta tesis doctoral se abordaron dos retos relacionados con el
desarrollo de métodos moleculares de detección de ribovirus (con genoma de
RNA) que afectan a cultivos hortícolas. El primero corresponde a la detección
del género Fabavirus, que está compuesto por cinco especies virales: virus 1
del marchitamiento del haba (Broad bean wilt virus 1, BBWV-1), virus 2 del
marchitamiento del haba (Broad bean wilt virus 2, BBWV-2), virus del mosaico
de la genciana (Gentian mosaic virus, GeMV) y virus del mosaico suave de
cucurbitáceas (Curcubit mild mosaic virus, CuMMV) y virus del mosaico suave
de la ortiga blanca (Lamium mild mosaic virus, LMMV). En primer lugar se
secuenció el genoma completo del único aislado disponible de LMMV, ya que
era la única especie viral de este género de la que no se disponía ninguna
secuencia nucleotídica. La comparación de esta secuencia con la del genoma
completo de los otros fabavirus confirmó que LMMV es una especie viral per
se al ajustarse a los criterios actualmente aceptados de demarcación entre
generos, especies y aislados virales. Se encontró varias repeticiones de un
motivo de diez nucleotídos en las zonas no traducibles del extremo 5’ de todos
los miembros del género Fabavirus que se puede considerar como una seña de
identidad y serviría para asignar nuevos virus a este género viral. En segundo
lugar, a partir de todas las secuencias nucleotídicas disponibles de todos los
virus del género Fabavirus se diseñó una pareja de iniciadores conservados
para poder detectar por retrotranscripción (reverse transcription, RT) y PCR
(RT-PCR) todos los fabavirus en una única reacción. También se diseñaron
cinco parejas de iniciadores, cada una específica para una especie viral, para
poder detectar e identificar cualquiera de estos virus en una única reacción
mediante RT-PCR múltiple (multiplex RT-PCR). La combinación de ambos
procedimientos de RT-PCR permite detectar e identificar cada una de las cinco
especies conocidas del género Fabavirus, así como descubrir nuevas especies
dentro de este género. En tercer lugar, se diseñó una sonda molecular
correspondiente a la región del genoma que contenia las repeticiones del
motivo de diez nucleótidos, con la que se pudo detectar las cinco especies del
género Fabavirus mediante hibridación molecular de flujo. Esta es la la
primera vez que se consigue una sonda conservada para un género viral.
También se diseñaron cinco sondas, cada una específica para cada una de
cinco las especies conocidas del género. De manera que mediante hibridación
de flujo con las seis sondas se pueden identificar BBWV-1, BBWV-2, LMMV,
GeMV y CuMMV y descubrir nuevas especies dentro del género Fabavirus.
Para comprobar la especificidad de las técnicas de RT-PCR e hibridación
desarrolladas aquí, ambas se probaron con distintos aislados de una misma
especie viral que eran genéticamente muy divergentes (identidad ~80%) y no se
produjeron falsos negativos. Así mismo se constató in silico o in vitro que estas
técnicas no producían falsos positivos al no detectar otros virus relacionados
fuera del género Fabavirus, como son aquellos que pertenecen a los géneros
Comovirus y Nepovirus, que junto el género Fabavirus forman la subfamilia
Comovirinae.
El otro reto que se planteó fue la detección e identificación de los siete
ribovirus más importantes en los cultivos de tomate del área mediterránea y
otras áreas subtropicales: virus del mosaico del pepino (Cucumber mosaic
virus, CMV), virus del bronceado del tomate (Tomato spotted wilt virus, TSWV),
virus del mosaico del tomate (Tomato mosaic virus, ToMV), virus del la clorosis
del tomate (Tomato chlorosis virus,ToCV), virus de la clorosis infecciosa del
tomate (Tomato infectious clorosis virus, TICV), virus del mosaico del pepino
dulce (Pepino mosaic virus, PepMV), y virus del torrado del tomate (Tomato
torrado virus, ToTV). Primero se caracterizó la variabilidad genética de ToMV
puesto que era el único de estos virus en la que no se había estudiado este
atributo. Se encontró tres grupos de aislados que tenían entre ellos
identidades nucleotídicas menores al 90%. Sin embargo, solamente uno de
estos grupos se había dispersado por el mundo y se caracterizaba por una
gran estabilidad y muy baja variabilidad genética (identidades mayores del
98%). A partir del análisis de todas las secuencias disponibles de estos siete
virus se diseñaron siete parejas de iniciadores específicos para cada virus. Se
tuvo en cuenta la variabilidad genética dentro de cada uno de los siete virus
para evitar o minimizar los falsos negativos. Mediante dos RT-PCR múltiples
(una para CMV, ToMV y TICV y la otra para TSWV, ToCV, ToTV y PepMV) se
pudo detectar e identificar cada especie viral tanto en infecciones únicas como
múltiples en muestras de campo de Sicilia con una prevalencia variable según
el virus y el área geográfica.
Los métodos moleculares de detección desarrollados en esta tesis
permiten llevar a cabo prospecciones rutinarias en grandes áreas de cultivo,
recabando información epidemiológica muy valiosa para el manejo de
enfermedades a diferentes escalas geográficas, y constituyen una primera
línea de defensa frente a la ocurrencia de brotes de las enfermedades virales.
El desarrollo y adopción de esta metodología supone un aporte que
contribuiría a mejorar la gestión de la calidad por parte de empresas
productoras y distribuidoras de semillas o propágulos asexuales, y a las
agencias gubernamentales reguladoras del comercio internacional de estos
productos con la finalidad de disminuir los riesgos y reducir el enorme
impacto económico, valorado en decenas de millones de euros anuales, en
pérdidas directas e indirectas, que implica la emergencia y dispersión de los
virus en las economías de los países afectados. / Rangel Aranguren, EA. (2015). Desarrollo de métodos moleculares de detección de virus de RNA de cultivos hortícolas [Tesis doctoral]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/58269
| Identifer | oai:union.ndltd.org:upv.es/oai:riunet.upv.es:10251/58269 |
| Date | 30 November 2015 |
| Creators | Rangel Aranguren, Ezequiel Alonzo |
| Contributors | Davino, Salvatore, Olmos Castelló, Antonio, Rubio Miguelez, Luis, Universitat Politècnica de València. Departamento de Producción Vegetal - Departament de Producció Vegetal |
| Publisher | Universitat Politècnica de València |
| Source Sets | Universitat Politècnica de València |
| Language | Spanish |
| Detected Language | Spanish |
| Type | info:eu-repo/semantics/doctoralThesis, info:eu-repo/semantics/acceptedVersion |
| Rights | http://rightsstatements.org/vocab/InC/1.0/, info:eu-repo/semantics/openAccess |
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