Puesta a punto PCR Multiplex para el diagnóstico de 14 virus respiratorios

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:30:29Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2005-12-13Bitstream added on 2014-06-13T20:21:07Z : No. of bitstreams: 1 braoios_a_dr_arafcf.pdf: 1217984 bytes, checksum: 5239ef0501af6f189fd2b422aad8dc7d (MD5) / Universidade Estadual Paulista (UNESP) / Staphylococcus aureus é um dos principais agentes de infecção humana, especialmente em indivíduos hospitalizados. Cepas MRSA (Methicillin Resistant Staphylococcus aureus) constituem um grave problema em hospitais de todo o mundo, aumentando a morbidade e mortalidade de indivíduos infectados. A vancomicina é uma das únicas opções terapêuticas. No entanto, o uso excessivo desse antibiótico pode selecionar cepas resistentes, agravando ainda mais o problema. Trabalhadores hospitalares podem carrear S. aureus nas narinas anteriores e pele e, assim, constituem um importante elo na epidemiologia das infecções nosocomiais. Nesse trabalho foram coletadas amostras das mãos e narinas de 100 trabalhadores do Hospital Universitário Dr. Domingos Leonardo Cerávolo da Universidade do Oeste Paulista - UNOESTE, em Presidente Prudente (SP). Desse total, 68% não eram portadores de S. aureus, 27% carreavam S. aureus sensível a meticilina, 4% carreavam MRSA e 1% carreava BORSA (Borderline Oxacillin Resistant Staphylococcus aureus). No mesmo período (julho a dezembro de 2002), 54,3% das infecções estafilocócicas em pacientes internados nessa Instituição tinham como agente MRSA. A técnica da PCR (Polymerase Chain Reaction) Multiplex para a detecção do gene femA (gene espécie-específico), mecA (resistência à meticilina) e ileS-2 (resistência à mupirocina) foi comparada com o método da difusão com discos e provas convencionais de identificação. Os resultados da PCR Multiplex apresentaram completa concordância com os resultados obtidos com os testes fenotípicos convencionais. Para verificar a relação genética entre as 30 cepas MRSA, 5 isoladas de trabalhadores e 25 de pacientes, foram realizadas a antibiotipagem e tipagem molecular através da técnica RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA). Pela antibiotipagem as cepas MRSA foram... . / Staphylococcus aureus is considered as a major infeccious disease agent in human, especially in hospitalized people. Methicillin-resistant strains (MRSA) constitute a serious problem in hospitals around the world, increasing the morbity and mortality rate of infected people. Usually, vancomycin is the only therapeutic choice for the treatment of MRSA infections. However, excessive use of this antibiotic can select resistant strains, aggravating the problem. Health workers can carry S. aureus in the anterior nares and skin, constituting an important link for the epidemiology of nosocomial infections. In this study, samples of the hands and nares of one hundred workers from the University Hospital Dr. Domingos Leonardo Cerávolo , at Presidente Prudente, SP, Brazil, were assessed. Among the one hundred workers, 68% did not carry S. aureus, methicillin-susceptible S. aureus was found in 27/100 (27%) of those people; MRSA in 4/100 (4%) and BORSA (Borderline Resistant Staphylococcus aureus) was found in 1 (1%) health worker. In the same period (July to December of 2002), 54,3% of the staphylococcal infections in hospitalized patients were caused by MRSA. Multiplex PCR assay for the detection of femA (species-specific gene), mecA (methicillin resistance gene) and ileS-2 (mupirocin resistance gene) was compared to the disk diffusion susceptibility test and conventional identification test methods. The Multiplex PCR technic results were in complete agreement with the results obtained from conventional methods. Genetic relationship among the 30 MRSA strains, five isolated from workers and twenty five from patients, was established by antibiotyping and molecular typing by RAPD. On the basis of the antibiotyping, the 30 strains were grouped into four clusters (A to D), of a which 87% were grouped into antibiotype A. According to the profile of RAPD, eight clusters... (Complete abstract, click electronic address below).

En los últimos años los casos de infecciones causadas por enterococos resistente a vancomicina (ERV) han ido cobrando importancia debido a su capacidad innata para almacenar información e inclusive transferirla a otras cepas. Los ERV han sido aislados de Unidades de Cuidados Intensivos (UCI), de infecciones de tracto urinario, bacteriemias, endocarditis, etc. Las dos especies clínicamente importantes son Enterococcus faecium y Enterococcus faecalis, las cuales portan genes de resistencia a vancomicina. El objetivo de esta investigación fue analizar genéticamente las cepas ERV del Hospital Nacional Guillermo Almenara Irigoyen (HNGAI). Para ello se recolectaron cepas ERV y se realizó la evaluación molecular en el Laboratorio de Microbiología y Biotecnología Molecular de la Universidad Nacional Mayor de San Marcos – Lima. Se seleccionaron un total de 28 cepas, 82% (n = 23) correspondieron a la especie E. faecium y 18% (n = 5) a E. faecalis. Se determinó el nivel de resistencia a vancomicina con la Concentración Mínima Inhibitoria (CMI) mediante el E-test, 23 cepas de Enterococcus faecium obtuvieron una CMI ≥ 256µg/mL; 5 cepas de Enterococcus faecalis mostraron subpoblaciones heterorresistentes a vancomicina dentro del halo de inhibición. Para determinar la ubicación de la resistencia se utilizó la prueba de curación de plásmidos resultando que el 96% (n = 22) de las cepas de E. faecium mantuvo la resistencia después del curado y el 100% de Enterococcus faecalis mostraron sensibilidad y transferibilidad, siendo la frecuencia de transferencia más alta de 5 x10-3 para la cepa EC0507. Mediante PCR múltiplex se determinó la presencia de un sólo genotipo vanA, en todas las cepas Enterococcus faecium y Enterococcus faecalis. De esta manera se concluye que existe un solo genotipo vanA en los ambientes intrahospitalarios del HNGAI y que estos pueden ser transferibles.

Uno de los problemas a los que se enfrenta la agricultura son los daños producidos por los virus que causan cada año considerables pérdidas económicas en diversos cultivos de todo el mundo. El control de las enfermedades virales es difícil debido a su compleja y dinámica epidemiología, con casos frecuentes de emergencia y rápida dispersión a escala global, así como por su gran capacidad evolutiva que les permite superar distintas estrategias de control, como por ejemplo el cultivo de variedades resistentes obtenidas por mejora genética. El primer paso para evaluar el estado sanitario de un cultivo y poder aplicar un programa de manejo integrado es disponer de métodos de diagnóstico y detección de los principales virus que sean específicos, fiables, rápidos y sensibles. Dada la situación dinámica de las virosis, en la que continuamente están apareciendo nuevos virus o variantes, es recomendable que los métodos de diagnóstico puedan desarrollarse rápidamente para responder a la demanda y que sean flexibles de manera que se pueda ajustar al nivel de especificidad requerido (no solamente para la especie viral sino también para categorías taxonómicas superiores, como género y familia o inferiores como cepa o grupo de aislados virales). En este respecto, los métodos moleculares basados en la reacción en cadena de la polimerasa (polymerase chain reaction, PCR) y la hibridación molecular de ácidos nucleicos cumplen estos criterios. Los métodos de PCR tienen la ventaja de ser muy sensibles mientras que los basados en la hibridación permiten analizar simultáneamente un elevado número de muestras. Una modalidad, la hibridación de flujo de improntas vegetales (flow-through hybridization of tissue prints), recientemente desarrollada, supone una reducción drástica del tiempo necesario para el análisis al evitar el procesamiento de las muestras y acelerar el proceso de hibridación. En el desarrollo, tanto de la PCR como de la hibridación, es necesario conocer la secuencia nucleotídica de al menos una porción del genoma del virus que se quiere detectar, pero si se quiere sacar el máximo provecho, por una parte, hay que estimar la variabilidad genética entre los distintos aislados del virus, para así evitar o minimizar los falsos negativos (ej. reacción negativa con algunos aislados genéticamente divergentes), y por otra parte, hay que considerar la relación genética del virus objeto con repecto a otros virus, para evitar falsos positivos (ej. reacción positiva con aislados pertenecientes a otros virus). En esta tesis doctoral se abordaron dos retos relacionados con el desarrollo de métodos moleculares de detección de ribovirus (con genoma de RNA) que afectan a cultivos hortícolas. El primero corresponde a la detección del género Fabavirus, que está compuesto por cinco especies virales: virus 1 del marchitamiento del haba (Broad bean wilt virus 1, BBWV-1), virus 2 del marchitamiento del haba (Broad bean wilt virus 2, BBWV-2), virus del mosaico de la genciana (Gentian mosaic virus, GeMV) y virus del mosaico suave de cucurbitáceas (Curcubit mild mosaic virus, CuMMV) y virus del mosaico suave de la ortiga blanca (Lamium mild mosaic virus, LMMV). En primer lugar se secuenció el genoma completo del único aislado disponible de LMMV, ya que era la única especie viral de este género de la que no se disponía ninguna secuencia nucleotídica. La comparación de esta secuencia con la del genoma completo de los otros fabavirus confirmó que LMMV es una especie viral per se al ajustarse a los criterios actualmente aceptados de demarcación entre generos, especies y aislados virales. Se encontró varias repeticiones de un motivo de diez nucleotídos en las zonas no traducibles del extremo 5’ de todos los miembros del género Fabavirus que se puede considerar como una seña de identidad y serviría para asignar nuevos virus a este género viral. En segundo lugar, a partir de todas las secuencias nucleotídicas disponibles de todos los virus del género Fabavirus se diseñó una pareja de iniciadores conservados para poder detectar por retrotranscripción (reverse transcription, RT) y PCR (RT-PCR) todos los fabavirus en una única reacción. También se diseñaron cinco parejas de iniciadores, cada una específica para una especie viral, para poder detectar e identificar cualquiera de estos virus en una única reacción mediante RT-PCR múltiple (multiplex RT-PCR). La combinación de ambos procedimientos de RT-PCR permite detectar e identificar cada una de las cinco especies conocidas del género Fabavirus, así como descubrir nuevas especies dentro de este género. En tercer lugar, se diseñó una sonda molecular correspondiente a la región del genoma que contenia las repeticiones del motivo de diez nucleótidos, con la que se pudo detectar las cinco especies del género Fabavirus mediante hibridación molecular de flujo. Esta es la la primera vez que se consigue una sonda conservada para un género viral. También se diseñaron cinco sondas, cada una específica para cada una de cinco las especies conocidas del género. De manera que mediante hibridación de flujo con las seis sondas se pueden identificar BBWV-1, BBWV-2, LMMV, GeMV y CuMMV y descubrir nuevas especies dentro del género Fabavirus. Para comprobar la especificidad de las técnicas de RT-PCR e hibridación desarrolladas aquí, ambas se probaron con distintos aislados de una misma especie viral que eran genéticamente muy divergentes (identidad ~80%) y no se produjeron falsos negativos. Así mismo se constató in silico o in vitro que estas técnicas no producían falsos positivos al no detectar otros virus relacionados fuera del género Fabavirus, como son aquellos que pertenecen a los géneros Comovirus y Nepovirus, que junto el género Fabavirus forman la subfamilia Comovirinae. El otro reto que se planteó fue la detección e identificación de los siete ribovirus más importantes en los cultivos de tomate del área mediterránea y otras áreas subtropicales: virus del mosaico del pepino (Cucumber mosaic virus, CMV), virus del bronceado del tomate (Tomato spotted wilt virus, TSWV), virus del mosaico del tomate (Tomato mosaic virus, ToMV), virus del la clorosis del tomate (Tomato chlorosis virus,ToCV), virus de la clorosis infecciosa del tomate (Tomato infectious clorosis virus, TICV), virus del mosaico del pepino dulce (Pepino mosaic virus, PepMV), y virus del torrado del tomate (Tomato torrado virus, ToTV). Primero se caracterizó la variabilidad genética de ToMV puesto que era el único de estos virus en la que no se había estudiado este atributo. Se encontró tres grupos de aislados que tenían entre ellos identidades nucleotídicas menores al 90%. Sin embargo, solamente uno de estos grupos se había dispersado por el mundo y se caracterizaba por una gran estabilidad y muy baja variabilidad genética (identidades mayores del 98%). A partir del análisis de todas las secuencias disponibles de estos siete virus se diseñaron siete parejas de iniciadores específicos para cada virus. Se tuvo en cuenta la variabilidad genética dentro de cada uno de los siete virus para evitar o minimizar los falsos negativos. Mediante dos RT-PCR múltiples (una para CMV, ToMV y TICV y la otra para TSWV, ToCV, ToTV y PepMV) se pudo detectar e identificar cada especie viral tanto en infecciones únicas como múltiples en muestras de campo de Sicilia con una prevalencia variable según el virus y el área geográfica. Los métodos moleculares de detección desarrollados en esta tesis permiten llevar a cabo prospecciones rutinarias en grandes áreas de cultivo, recabando información epidemiológica muy valiosa para el manejo de enfermedades a diferentes escalas geográficas, y constituyen una primera línea de defensa frente a la ocurrencia de brotes de las enfermedades virales. El desarrollo y adopción de esta metodología supone un aporte que contribuiría a mejorar la gestión de la calidad por parte de empresas productoras y distribuidoras de semillas o propágulos asexuales, y a las agencias gubernamentales reguladoras del comercio internacional de estos productos con la finalidad de disminuir los riesgos y reducir el enorme impacto económico, valorado en decenas de millones de euros anuales, en pérdidas directas e indirectas, que implica la emergencia y dispersión de los virus en las economías de los países afectados. / Rangel Aranguren, EA. (2015). Desarrollo de métodos moleculares de detección de virus de RNA de cultivos hortícolas [Tesis doctoral]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/58269

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / This study evaluated molecular characteristic of Rhodococcus equi isolates obtained from horses and standardized by PCR multiplex assay, which amplifies the vap gene family (vapA, B, C, D, E, F, G e H). One hundred eighty Rhodococcus equi isolates from different sources: healthy horse s feces (112), soil (12), stalls (23) and clinical isolates (33) of horsebreeding farms, were studied. The technique was standardized and confirmed by sequencing of amplified vap gene family controls. Thirty-two (17.8%) R. equi isolates evaluated were positive for vapA gene and carried at least three another vap genes associated. All 147 isolates from equine feces, stalls and soil from horse-breeding farms did not demonstrate any virulence-associated proteins genes. Thirty-two (97.0%) out of 33 clinical equines isolates were positive to multiplex PCR assay for vap gene family and demonstrated six molecular profile, 100% with vapA, vapD and vapG genes, 86.6% vapF, 76,6% vapH, 43.3% vapC, 36.6% vapE and none vapB. The most frequent molecular profile was vap A, D, F, G and H present in 37.5% of strains. Morever, there was no molecular epidemiological pattern for R. equi isolates from each horse-breeding farm studied. Thus this technique allows the identification of eight vap genes family (vapA, B, C, D, E, F, G e H), it is a practical an efficient method of conducting clinical and epidemiological studies on R. equi isolates. / O presente estudo tem por objetivo a caracterização molecular de isolados de Rhodococcus equi de eqüinos pela padronização de uma técnica de PCR multiplex para detecção dos genes da família vap (vapA, B, C, D, E, F, G e H). Foram analisadas 180 amostras de Rhodococcus equi de diferentes origens: fezes (112), solo (12) instalações (23) e isolados clínicos (33). A técnica foi padronizada e confirmada pelo sequenciamento da cepa padrão de R. equi (ATCC 33701), e de uma amostra de paciente humano contendo o gene vapB. Trinta e dois (17,8%) foram positivos para vapA e carregavam no mínimo 4 genes vap associados. Os 147 isolados oriundos de fezes, instalações e sola não apresentavam genes vap. Trinta e dois (97.0%) dos isolados clinicos foram positivos na PCR multiplex e demonstraram seis padrões moleculares, 100% com vapA, vapD and vapG, 86.6% vapF, 76,6% vapH, 43.3% vapC, 36.6% vapE e nenhum com vapB. O perfil molecular mais freqüente foi vap A, D, F, G eH presente em 37.5% das cepas. foram obtidos, sendo que os genes vapA, vapD e vapG estavam presentes em todas as amostras. Não foi obtido nenhum padrão molecular para cada propriedade estudada. Esta nova técnica constitui-se um método prático e eficaz para condução de estudos clínicos e epidemiológicos, bem como, por relevar os aspectos moleculares da infecção.

FundaÃÃo Cearense de Apoio ao Desenvolvimento Cientifico e TecnolÃgico / A doenÃa de Chagas à causada pelo parasito intracelular Trypanosoma cruzi e afeta em torno de 17 milhÃes de pessoas na AmÃrica Latina. A fase crÃnica da doenÃa caracteriza-se por baixo nÃvel de parasitemia e alto nÃvel de anticorpos Anti-T.cruzi e o diagnÃstico à feito preferencialmente utilizando-se mÃtodos sorolÃgicos, incluindo imunofluorescÃncia indireta (IFI), hemaglutinaÃÃo indireta (HAI) e imunoensaio enzimÃtico (ELISA). SÃo testes que apresentam alta sensibilidade, mas sofrem de baixa especificidade, e um variÃvel nÃmero de indivÃduos apresenta testes sorolÃgicos inconclusivos. Nos Ãltimos anos, muitos estudos tÃm usado a tecnologia da ReaÃÃo em Cadeia da Polimerase (PCR) para detectar sequÃncias de DNA de T. cruzi em sangue de pacientes chagÃsicos crÃnicos. A alta especificidade da PCR tem apontado para sua aplicaÃÃo como mÃtodo confirmatÃrio no diagnÃstico de pacientes com provas sorolÃgicas inconclusivas. O objetivo desse trabalho foi realizar uma anÃlise comparativa entre a PCR e os mÃtodos convencionais mais utilizados para o diagnÃstico - sorologia e xenodiagnÃstico, na detecÃÃo da infecÃÃo por T. cruzi, em indivÃduos com doenÃa de Chagas crÃnica. Sangue de 67 pacientes chagÃsicos crÃnicos, ambos os sexos, provenientes do ambulatÃrio de doenÃa de Chagas do Hospital UniversitÃrio Walter CantÃdio, da Universidade Federal do CearÃ, foram avaliados para T. cruzi, utilizando testes sorolÃgicos (IFI, HAI e ELISA), PCR-Multiplex e xenodiagnÃstico. AlÃm disso, foi avaliado tambÃm a PCR-Multiplex em dejetos de triatomÃneos provenientes do xenodiagnÃstico destes pacientes. De acordo com o resultado dos testes sorolÃgicos, os pacientes foram classificados em 3 grupos: 1Â. Sorologia positiva (quando 2 ou 3 resultados dentre os 3 testes sorolÃgicos foram positivos), 2Â. Sorologia inconclusiva ou indeterminado (apenas 2 resultados foram negativos) e 3Â. Sorologia negativa (quando os 3 resultados foram negativos). Dentre as 59 amostras com sorologia positiva foram obtidos 18 (30,5%) resultados positivos de PCR-Multiplex em sangue perifÃrico e 41 (69,5%) resultados negativos. Nos PCR-Multiplex em dejetos de triatomÃneos foram obtidos 20 (33,9%) resultados positivos e 39 (66,1%) resultados negativos. As 2 amostras com sorologia inconclusiva foram negativas na PCR-Multiplex, tanto em sangue perifÃrico como em dejetos de triatomÃneos. As amostras com sorologia negativa (n=6) apresentaram 2 resultados positivos (33,3%) na PCR-Multiplex em sangue e 4 resultados negativos (66,7%). Nos dejetos de triatomÃneos, as 6 amostras com sorologia negativa foram negativas na PCR-Multiplex. Estes resultados mostraram que o ensaio da PCR-Multiplex em amostras de sangue perifÃrico e em dejetos de triatomÃneos, empregando iniciadores para regiÃes diferentes, no caso, DNA nuclear e DNA do cinetoplasto, podem ser aplicados para o diagnÃstico da doenÃa de Chagas crÃnica (mesmo com diferentes metodologias de extraÃÃo de DNA total). Os dados mostraram tambÃm que a PCR-Multiplex em dejetos de triatomÃneos à mais sensÃvel que o ensaio do xenodiagnÃstico.

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:27:22Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2010-10-26Bitstream added on 2014-06-13T18:56:02Z : No. of bitstreams: 1 guastalli_eal_me_jabo.pdf: 288811 bytes, checksum: 03b7643862d7f270422c422ff91b53b9 (MD5) / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / Foram isoladas 90 estirpes de E. coli de fígados e de intestinos, de pintainhas de postura comercial, com sete dias de idade. Com o objetivo de caracterizar as estirpes isoladas, a patogenicidade das mesmas foi determinada, em inoculação “in vivo”. O teste revelou 44 estirpes de alta ou de intermediária patogenicidade, que foram analisadas por PCR multiplex quanto á presença de oito genes de virulência (astA, iss, iucD, irp2, papC, tsh, vat e cva/cvi) e tiveram os sorotipos O:H identificados. Os resultados demonstraram que todas as estirpes analisadas continham pelo menos um dos oito genes pesquisados e que a maioria (93,20%) possuíam o gene iss. Foram detectados 17 perfis genéticos diferentes, sendo 15 deles com combinações de dois ou mais genes, representando 70,45% do total de estirpes analisadas. Onze sorogrupos e onze antígenos “H” foram identificados, sendo O8 (15,89%) e o H17 (23,8%) os mais frequentes. Com o objetivo de verificar a susceptibilidade das estirpes aos antimicrobianos: ampicilina, enrofloxacina, eritromicina, espectinomicina, estreptomicina, fosfomicina, kanamicina, lincomicina, norfloxacina, sulfa+trimetoprim e tetraciclina, comumente utilizados na avicultura, todas as estirpes de E. coli isoladas foram analisadas. O antimicrobiano que apresentou maior atividade antibacteriana foi a espectinomicina (92,2%) e o de menor atividade foi a lincomicina. Nenhuma das estirpes foi sensível a todos os antimicrobianos testados. Os resultados demonstraram uma diversidade de sorotipos e de genes de virulência envolvidos no quadro clínico de colibacilose estudado, como também sorogrupos que não haviam sido relatados em APEC e a alta incidência de resistência antimicrobiana / A total of 90 strains of E. coli were isolated from the livers and intestines of seven-day-old commercial layer chicks. With the objective of characterising the isolated strains, their pathogenicity levels were determined by in vivo inoculation. These tests identified 44 strains with high or intermediate levels of pathogenicity, which were then analysed by multiplex PCR for the presence of eight virulence genes (astA, iss, iucD, irp2, papC, tsh, vat e cvi/cva) and the serotypes O:H were identified. The results demonstrated that these isolated strains contained at least one of the eight genes of interest, and the majority (93.20%) possessed the iss gene. Seventeen different genetic patterns were detected, 15 of which had combinations of two or more genes, representing 70.45% of all analysed strains. Eleven serogroups and eleven antigens “H” were identified, O8 (15.89%) and H17 (23.80%) were most frequent. Aiming to verify the susceptibility of strains to antimicrobial agents: ampicillin, enrofloxacin, erythromycin, spectinomycin, streptomycin, fosfomycin, kanamycin, lincomycin, norfloxacin, trimethoprim sulfa and tetracycline, commonly used in poultry, all strains of E. coli isolates were analyzed. The antibiotics that showed the highest antibacterial activity was spectinomycin (92.2%) and less activity was the lincomycin (100%) strains were resistant. None of the strains were sensitive to all antibiotics tested. The results showed a diversity of serotypes and virulence genes involved in the clinical study of colibacillosis, as well as serogroups that had not been reported in APEC and the high incidence of antimicrobial resistance

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:27:23Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2006-06-30Bitstream added on 2014-06-13T19:55:58Z : No. of bitstreams: 1 machado_tro_me_jabo.pdf: 255795 bytes, checksum: 94bed73df71cf07445d3e1f703d8704c (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Um total de 109 cepas de Staphylococcus coagulase-negativa foi isolado de mastite bovina clinica e subclinica em 35 fazendas de leite situadas em 9 estados brasileiros no período de fevereiro a maio de 2005, elas foram investigadas em relação a sua susceptibilidade in vitro a diversos agentes antimicrobianos. Entre as cepas obtidas, a resistência a penicilina foi a mais freqüente (93,5%), seguida pela resistência a sulfonamida (88,9%), novobiocina (88,6%) e ampicilina (85,3%). Todas as cepas examinadas mostraram resistência a pelo menos 1 das drogas antimicrobianas testadas. Cepas apresentando resistência múltipla foram extremamente comuns, com 10,0% dos isolados apresentando resistência a todas as drogas antimicrobianas. Os resultados obtidos indicaram que as cepas de Staphylococcus coagulase-negativas isoladas no Brasil apresentaram um alto grau de resistência a antimicrobianos. Estes resultados são provavelmente uma conseqüência da pressão devido ao uso intensivo de drogas antimicrobianas e eles são um motivo de preocupação em relação a saúde pública. / A total of 109 strains of coagulase-negative Staphy/ococci were isolated from bovine clinical and subdinical mastitic cattle in 35 dairy farms, in 9 states of Brazil from february to may 2005, and investigated for in vitro susceptibility to several antimicrobial agents. Among the isolates, resistance to penicillin was most frequent (93.5%), followed by resistance to sulphonamide (88.9%), novobiocin (88.6%) and ampicillin (85.3%). Ali isolates exhibited resistance to at least 1 of the antimicrobial drugs tested. Multidrug resistant isolates were quite common, 10.0% of the isolates showing resistance to ali antimicrobial drugs tested. This indicates that coagulase-negative Staphy/ococci in 3razil exhibit a high degree of antimicrobial agents' resistance, probably as a :onsequence of the pressure of the intensive use of antimicrobial drugs, a practice that :onstitute a public health concem.

Submitted by Sandra Pereira (srpereira@ufrrj.br) on 2016-08-03T15:45:32Z No. of bitstreams: 1 2010 - Raquel Silva Lisboa.pdf: 4230911 bytes, checksum: e7087ccd29d417f592ca09ec5f49c657 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-08-03T15:45:32Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2010 - Raquel Silva Lisboa.pdf: 4230911 bytes, checksum: e7087ccd29d417f592ca09ec5f49c657 (MD5) Previous issue date: 2010-04-14 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Cient?fico e Tecnol?gico, CNPq. / Dogs can be infected with various hemoparasites, and the occurrence of co-infections between Ehrlichia canis, Babesia canis, Anaplasma platys, and Hepatozoon canis species is very common, since they have the same tick vector. The objectives of this study were to delineate a multiplex PCR technique for the simultaneous diagnostic of microorganisms of Babesia and Ehrlichia genera in canine blood samples, and to realize the partial characterization of fragments of the 16S rRNA gene of the family Anaplasmataceae agents and, of 18S rRNA gene of Babesia detected in some samples PCR-positive, comparing the sequences obtained with sequences of other strains previously deposited in GenBank. Total DNA of 119 blood samples was extracted, of these, 40 were selected by showing cytoplasmatic inclusions in leukocytes and/or platelets suggesting infection by agents of Anaplasmataceae family (1E to 40E), 37 by showing piroplasms (1B to 37B), and two by presenting structures of both agents (M1 and M2), and finally, 40 samples with negative parasitological diagnostic and hematological exam without alterations. All these samples were tested by PCR to confirm the absence or presence of these hemoparasites, and them utilized in the multiplex PCR delineation. In multiplex PCR reactions the primers A17/EC3 were used to amplify an approximately 600bp region of the 16S rRNA gene of Ehrlichia species and the primers PIRO-A1/PIRO-B were used to amplify an approximately 450bp region of the 18S rRNA gene of Babesia species. Validation of multiplex PCR was performed by real time multiplex PCR. The multiplex PCR was able to simultaneously detect both agents in a DNA sample of a dog naturally co-infected and all the single infections by Babesia, but does not detected all the Ehrlichia infections. The real-time multiplex PCR was more sensitive in detect both single and also co-infections, as well as positive DNA mixtures for the two agents. The sequencing results confirmed the isolates identity, and that the primers PIRO-A1/PIRO-B also amplified the DNA of Hepatozoon canis. Phylogenetic analysis indicated that E. canis, A. platys, B. canis and H. canis species found in this study showed close similarities with sequences previously deposited in GenBank, forming monophyletic groups. / Os c?es podem se infectar com diversos hemoparasitos, sendo muito comum a ocorr?ncia de coinfec??es entre as esp?cies Ehrlichia canis, Babesia canis, Anaplasma platys e Hepatozoon canis, visto que possuem o mesmo carrapato vetor. Este estudo teve como objetivos delinear uma t?cnica de PCR multiplex para diagnosticar simultaneamente microrganismos dos g?neros Ehrlichia e Babesia em amostras de sangue de c?es e realizar a caracteriza??o parcial de fragmentos do gene 16S rRNA de agentes da fam?lia Anaplasmataceae e do gene 18S rRNA de Babesia detectados em algumas amostras positivas pela PCR, comparando as sequ?ncias obtidas com as sequ?ncias de outras cepas depositadas previamente no GenBank. O DNA total de 119 amostras de sangue foi extra?do. Destas, 40 foram selecionadas por apresentar inclus?es citoplasm?ticas em leuc?citos e/ou plaquetas sugestivas de infec??o por agentes da fam?lia Anaplasmataceae (1E a 40E), 37 por apresentar formas parasit?rias de piroplasm?deos (1B a 37B), duas por apresentar estruturas de ambos os agentes (M1 e M2) e, finalmente, 40 amostras com diagn?stico parasitol?gico negativo e exame hematol?gico sem altera??es. Todas estas amostras foram testadas por PCR, para a confirma??o da aus?ncia ou presen?a destes hemoparasitos, e depois utilizadas no delineamento da PCR multiplex. Nas rea??es de PCR multiplex utilizou-se os oligonucleot?deos iniciadores A17/EC3 que amplificam um produto de aproximadamente 600pb de uma por??o do gene 16S rRNA de esp?cies de Ehrlichia e os oligonucleot?deos iniciadores PIRO-A1/PIRO-B que amplificam um produto de aproximadamente 450pb de uma por??o do gene 18Sr RNA de esp?cies de Babesia. A valida??o da PCR multiplex foi realizada por PCR multiplex em tempo-real. A PCR multiplex foi capaz de detectar simultaneamente os dois agentes em uma amostra de DNA de um c?o naturalmente coinfectado e todas as infec??es individuais por Babesia, mas n?o detectou todas as infec??es por Ehrlichia. A PCR multiplex em tempo real foi mais sens?vel em detectar tanto infec??es ?nicas quanto coinfec??es, al?m de misturas de DNA positivo para os dois agentes. Os resultados dos sequenciamentos confirmaram a identidade dos isolados, e que os oligonucleot?deos PIRO-A1/PIRO-B amplificaram tamb?m, o DNA de Hepatozoon canis. As an?lises filogen?ticas indicaram que as esp?cies de E. canis, A. platys, B. canis e H. canis encontradas neste estudo possuem similaridades pr?ximas com sequ?ncias previamente depositadas no GenBank, formando grupos monofil?ticos.

La paléoparasitologie est l’étude des restes de parasites préservés dans des échantillons archéologiques et permet de mieux comprendre l’état de santé des populations anciennes et d’obtenir des informations d’ordre anthropologique ou ethnologique, sur les régimes alimentaires ou les conditions d’hygiène au quotidien. Les restes de parasites peuvent être retrouvés sous forme de macro-restes (vers ou larves), d’antigènes, d’ADN ou d’œufs. Cesderniers peuvent être particulièrement bien préservés au cours du temps car ils sont composés en partie de chitine, les rendant résistants aux processus de dégradation. L’observation microscopique de leurs caractéristiques morphologiques et micrométriques permet d’identifier les taxons au niveau du genre ou de la famille. Dans le cadre de cette thèse, plusieurs helminthes gastro-intestinaux, dont les œufs sont fréquemment retrouvés dans des échantillons archéologiques, ont été ciblés par une approche génétique. Il s’agit des vers plats Tæniasaginata, T. solium, T. asiatica, Echinococcus granulosus, E. multilocularis, Diphyllobothriumlatum, D. dendriticum et D. nihonkaiense, des nématodes Trichuris trichiura, Enterobiusvermicularis et Ascaris sp. et des douves Fasciola hepatica, F. gigantica, Dicrocoeliumdendriticum et D. chinensis.La méthode « aMPlex Torrent » permet de détecter, dans un grand nombre d’échantillons archéologiques, une faible quantité d’ADN de parasites. Cette approche combine la spécificité et la sensibilité de la PCR au haut-débit du séquençage de nouvelle génération. Plusieurs vestiges, provenant de périodes et de régions géographiques diverses, ont été analysés. Des résultats génétiques ont été obtenus pour des échantillons aussi anciens que 7200 BP. Nous avons par ailleurs obtenus les premières séquences anciennes de Taenia sp., Diphyllobothriumsp., Echinococcus sp., et les premières séquences européennes d’Enterobius vermicularis. Auvu de ces résultats, notre approche apparait comme étant complémentaire à la microscopie. / Palaeoparasitogy, the study of parasite remains from archaeological samples, is adiscipline that can highlight questions about the health status of the ancient populations. It can give important anthropological or ethnological information such as the diet and the hygiene conditions of past societies. The remains can be preserved as macroremains (worms or larvae),antigens, DNA or eggs. Because they are partially made of chitin, eggs of gastrointestinalhelminths resist well over time to the taphonomic degradation process. It is possible to distinguish between different families or genera of parasites by looking at the morphological features of eggs. However, since several taxa share common features, the determination is rarelypossible at the species level. For this thesis, several parasite species for which eggs arecommonly observed in archeological samples have been studied by a genetic approach. Westudied the tapeworms Tænia saginata, T. solium, T. asiatica, Echinococcus granulosus, E.multilocularis, Diphyllobothrium latum, D. dendriticum, and D. nihonkaiense; the nematodesTrichuris trichiura, Enterobius vermicularis, and Ascaris sp.; and the flukes Fasciola hepatica,F. gigantica, Dicrocoelium dendriticum, and D. chinensis.The “aMPlex Torrent” approach has been set up to detect minute amounts of DNA from parasites in multiple archaeological samples. This approach combines the specificity andsensitivity of PCR to the throughput of Next-Generation sequencing. Several samples have been analyzed by this approach. We obtained genetic results for samples as old as 7200 BP and from various geographical and archeological contexts. We obtained the first ancient DNA sequences for Taenia sp., Diphyllobothrium sp., Echinococcus sp. and the first European sequences forEnterobius vermicularis. Genetic analyses and microscopic observations appear to be complementary. Indeed, at least one taxon per sample was detected by one of the two approaches.