Uno de los problemas a los que se enfrenta la agricultura son los daños producidos por los virus que causan cada año considerables pérdidas económicas en diversos cultivos de todo el mundo. El control de las enfermedades virales es difícil debido a su compleja y dinámica epidemiología, con casos frecuentes de emergencia y rápida dispersión a escala global, así como por su gran capacidad evolutiva que les permite superar distintas estrategias de control, como por ejemplo el cultivo de variedades resistentes obtenidas por mejora genética. El primer paso para evaluar el estado sanitario de un cultivo y poder aplicar un programa de manejo integrado es disponer de métodos de diagnóstico y detección de los principales virus que sean específicos, fiables, rápidos y sensibles. Dada la situación dinámica de las virosis, en la que continuamente están apareciendo nuevos virus o variantes, es recomendable que los métodos de diagnóstico puedan desarrollarse rápidamente para responder a la demanda y que sean flexibles de manera que se pueda ajustar al nivel de especificidad requerido (no solamente para la especie viral sino también para categorías taxonómicas superiores, como género y familia o inferiores como cepa o grupo de aislados virales). En este respecto, los métodos moleculares basados en la reacción en cadena de la polimerasa (polymerase chain reaction, PCR) y la hibridación molecular de ácidos nucleicos cumplen estos criterios. Los métodos de PCR tienen la ventaja de ser muy sensibles mientras que los basados en la hibridación permiten analizar simultáneamente un elevado número de muestras. Una modalidad, la hibridación de flujo de improntas vegetales (flow-through hybridization of tissue prints), recientemente desarrollada, supone una reducción drástica del tiempo necesario para el análisis al evitar el procesamiento de las muestras y acelerar el proceso de hibridación. En el desarrollo, tanto de la PCR como de la hibridación, es necesario conocer la secuencia nucleotídica de al menos una porción del genoma del virus que se quiere detectar, pero si se quiere sacar el máximo provecho, por una parte, hay que estimar la variabilidad genética entre los distintos aislados del virus, para así evitar o minimizar los falsos negativos (ej. reacción negativa con algunos aislados genéticamente divergentes), y por otra parte, hay que considerar la relación genética del virus objeto con repecto a otros virus, para evitar falsos positivos (ej. reacción positiva con aislados pertenecientes a otros virus). En esta tesis doctoral se abordaron dos retos relacionados con el desarrollo de métodos moleculares de detección de ribovirus (con genoma de RNA) que afectan a cultivos hortícolas. El primero corresponde a la detección del género Fabavirus, que está compuesto por cinco especies virales: virus 1 del marchitamiento del haba (Broad bean wilt virus 1, BBWV-1), virus 2 del marchitamiento del haba (Broad bean wilt virus 2, BBWV-2), virus del mosaico de la genciana (Gentian mosaic virus, GeMV) y virus del mosaico suave de cucurbitáceas (Curcubit mild mosaic virus, CuMMV) y virus del mosaico suave de la ortiga blanca (Lamium mild mosaic virus, LMMV). En primer lugar se secuenció el genoma completo del único aislado disponible de LMMV, ya que era la única especie viral de este género de la que no se disponía ninguna secuencia nucleotídica. La comparación de esta secuencia con la del genoma completo de los otros fabavirus confirmó que LMMV es una especie viral per se al ajustarse a los criterios actualmente aceptados de demarcación entre generos, especies y aislados virales. Se encontró varias repeticiones de un motivo de diez nucleotídos en las zonas no traducibles del extremo 5’ de todos los miembros del género Fabavirus que se puede considerar como una seña de identidad y serviría para asignar nuevos virus a este género viral. En segundo lugar, a partir de todas las secuencias nucleotídicas disponibles de todos los virus del género Fabavirus se diseñó una pareja de iniciadores conservados para poder detectar por retrotranscripción (reverse transcription, RT) y PCR (RT-PCR) todos los fabavirus en una única reacción. También se diseñaron cinco parejas de iniciadores, cada una específica para una especie viral, para poder detectar e identificar cualquiera de estos virus en una única reacción mediante RT-PCR múltiple (multiplex RT-PCR). La combinación de ambos procedimientos de RT-PCR permite detectar e identificar cada una de las cinco especies conocidas del género Fabavirus, así como descubrir nuevas especies dentro de este género. En tercer lugar, se diseñó una sonda molecular correspondiente a la región del genoma que contenia las repeticiones del motivo de diez nucleótidos, con la que se pudo detectar las cinco especies del género Fabavirus mediante hibridación molecular de flujo. Esta es la la primera vez que se consigue una sonda conservada para un género viral. También se diseñaron cinco sondas, cada una específica para cada una de cinco las especies conocidas del género. De manera que mediante hibridación de flujo con las seis sondas se pueden identificar BBWV-1, BBWV-2, LMMV, GeMV y CuMMV y descubrir nuevas especies dentro del género Fabavirus. Para comprobar la especificidad de las técnicas de RT-PCR e hibridación desarrolladas aquí, ambas se probaron con distintos aislados de una misma especie viral que eran genéticamente muy divergentes (identidad ~80%) y no se produjeron falsos negativos. Así mismo se constató in silico o in vitro que estas técnicas no producían falsos positivos al no detectar otros virus relacionados fuera del género Fabavirus, como son aquellos que pertenecen a los géneros Comovirus y Nepovirus, que junto el género Fabavirus forman la subfamilia Comovirinae. El otro reto que se planteó fue la detección e identificación de los siete ribovirus más importantes en los cultivos de tomate del área mediterránea y otras áreas subtropicales: virus del mosaico del pepino (Cucumber mosaic virus, CMV), virus del bronceado del tomate (Tomato spotted wilt virus, TSWV), virus del mosaico del tomate (Tomato mosaic virus, ToMV), virus del la clorosis del tomate (Tomato chlorosis virus,ToCV), virus de la clorosis infecciosa del tomate (Tomato infectious clorosis virus, TICV), virus del mosaico del pepino dulce (Pepino mosaic virus, PepMV), y virus del torrado del tomate (Tomato torrado virus, ToTV). Primero se caracterizó la variabilidad genética de ToMV puesto que era el único de estos virus en la que no se había estudiado este atributo. Se encontró tres grupos de aislados que tenían entre ellos identidades nucleotídicas menores al 90%. Sin embargo, solamente uno de estos grupos se había dispersado por el mundo y se caracterizaba por una gran estabilidad y muy baja variabilidad genética (identidades mayores del 98%). A partir del análisis de todas las secuencias disponibles de estos siete virus se diseñaron siete parejas de iniciadores específicos para cada virus. Se tuvo en cuenta la variabilidad genética dentro de cada uno de los siete virus para evitar o minimizar los falsos negativos. Mediante dos RT-PCR múltiples (una para CMV, ToMV y TICV y la otra para TSWV, ToCV, ToTV y PepMV) se pudo detectar e identificar cada especie viral tanto en infecciones únicas como múltiples en muestras de campo de Sicilia con una prevalencia variable según el virus y el área geográfica. Los métodos moleculares de detección desarrollados en esta tesis permiten llevar a cabo prospecciones rutinarias en grandes áreas de cultivo, recabando información epidemiológica muy valiosa para el manejo de enfermedades a diferentes escalas geográficas, y constituyen una primera línea de defensa frente a la ocurrencia de brotes de las enfermedades virales. El desarrollo y adopción de esta metodología supone un aporte que contribuiría a mejorar la gestión de la calidad por parte de empresas productoras y distribuidoras de semillas o propágulos asexuales, y a las agencias gubernamentales reguladoras del comercio internacional de estos productos con la finalidad de disminuir los riesgos y reducir el enorme impacto económico, valorado en decenas de millones de euros anuales, en pérdidas directas e indirectas, que implica la emergencia y dispersión de los virus en las economías de los países afectados. / Rangel Aranguren, EA. (2015). Desarrollo de métodos moleculares de detección de virus de RNA de cultivos hortícolas [Tesis doctoral no publicada]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/58269 / TESIS

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / CHAPTER I - Prostate cancer is a common disease in the world and in some countries it is one of the main causes of male population mortality. Some molecular markers have been associated with prostate carcinogenesis. To observe changes in transcript levels of the AR, SRD5A2, KLK2, PSMA and PCA3 genes, the mRNA was analyzed in tissues with prostatic adenocarcinoma (PCa, N= 48) and benign prostatic hyperplasia (BPH, N= 25), performed through a differential multiplex RT-PCR assay. Significant differences were observed in the relative expression of these genes between cancerous and non-cancerous tissues. The optical density ratio of the cDNA amplicons between PCa and BPH for the AR gene was 1.6-fold higher for the prostatic adenocarcinoma. On the other hand, the SRD5A2 mRNA levels were associated with BPH and were 1.4-fold higher than that of PCa. For KLK2, PSMA and PCA3, the transcriptional levels were respectively, 1.9-, 1.9- and 5-fold higher in PCa than those in BPH tissues. Of the diagnostics tests carried through individually, the PCA3 gene was that presented higher sensitivity and accuracy, and the inclusion of the serum PSA improved the sensitivity (of 76 to 92%), positive preditive value (of 85 to 94%), negative preditive value (of 60 to 62%) and accuracy (of 74 to 78%). The results suggest that the higher AR, KLK2, PSMA, and PCA3 and/or reduced SRD5A2 genes expression in prostatic tissues may indicate the occurrence of prostate adenocarcinoma; however the PCA3 and serum PSA analysis together are highly promising as auxiliary method in the diagnosis of this cancer. CHAPTER II - Purpose: Prostate cancer (PCa) is the most commonly diagnosed malignancy in men, and it consists of multifactorial and multifocal events. Due to the complexity of the disease process, which includes genome alterations, local invasion, micrometastatic cell extravasations to circulation, invasion of secondary organ tissues, and resistance to hormonal blockage, many markers must be used to represent the multiple and variable events that lead to cancer development. The low specificity of the unique serum marker for prostate cancer diagnostics, PSA, has leaded us to investigate four potential markers in the peripheral blood of patients by detecting their mRNA levels and associating them to clinical parameters. Methods: The expression levels of the KLK2, KLK3, PCA3 and PSMA transcripts were determined by Nested RT-PCR. Patients with PCa (99) and with benign prostatic hyperplasia (BPH, 36), and healthy volunteers (104) were investigated. Results: Significant differences for the RNA relative levels have been found for the KLK2, PCA3 and PSMA transcripts between PCa and BPH patients or healthy volunteers. The KLK2 and PSMA levels also presented a positive association (P<0.05) with extra-prostatic disease (pT3). The combined positive RT-PCR Nested for the KLK2, PCA3, PSMA genes with serum PSA higher than 4ng/mL presented a 10-fold higher chance of cancer occurrence than healthy controls, with sensitivity, specificity and positive predictive value of 57%, 89% and 93%, respectively. Conclusions: The combined analysis of KLK2, PCA3 and PSMA transcripts may become a useful tool for the discrimination of PCa patients from those with benign disease or healthy individuals. Additionally, the KLK2 and PSMA transcripts may also be used as prognostic markers for the presence of extra-capsular disease and assisting in the prediction of the post-operative outcome. CHAPTER III - Purpose: Transcripts of PCA3/DD3 gene are at the moment the most specific molecule found in prostate cancer specimens. This mRNA can be detected in important sample targets for clinical analyses, such as prostatic tissues, urine after prostatic massage, and the peripheral blood. Methods: The present study evaluated the PCA3 gene expression in prostatic tissues and in peripheral blood of BPH and PCa patients, by RT-PCR assays, and based on its detection together with other clinical parameters, we proposed a model for molecular monitoring in order to improve diagnosis as an auxiliary technology. Results: The concomitant use of PCA3 transcript detection in the peripheral blood and in prostate tissues has improved diagnosis, with sensitivity and an accuracy of 77%. For the molecular staging, patients have been classified as: localized disease (PBL-; negative PCA3) and circulating tumors cells disease (PBL+; positive PCA3). The higher frequencies of PBL- had been observed in T1-T2 stages (75%); on the other hand, the higher PCA3 positivity was observed for the T3-T4 staging (43%), while the T1-T2 stages presented 25% positivity. A correlation was found between the molecular staging and serum PSA < 10ng/mL before surgery, and approximately 60% of patients with T3-T4 stages that presented biochemical failure after radical prostatectomy presented a positive PCA3 result (P= 0.05), with an odds ratio of 16-fold higher for the possibility of disease recurrence in relation to the T1-T2 patients, and an accuracy of 82%. Conclusion: These data demonstrated the importance of the PCA3 gene as an auxiliary method in prostate cancer diagnosis, by distinguishing PCa from BPH patients, and also demonstrated its prognostic value in recurrent disease for post-operative patients. CHAPTER IV - Approximately 98% of all the products transcribed in the human genome correspond to non coding RNAs (ncRNA). Many ncRNA functions are attributed to this structural particularity given mainly for the secondary structures formed from its linear sequence of bases. Among the ncRNA types are tRNA, rRNA, small nuclear RNA, small nucleolar RNA, small interference RNA (siRNA), microRNA (miRNA) and catalytic RNAs (ribozymes). The bioinformatics has supplied useful tools in the prediction of optimal or suboptimal secondary structures allowing the design of interference RNA as miRNAs or siRNAs. In human, miRNAs have been associated with the development of diverse complex diseases as cancer. The PCA3 (DD3) gene was molecularly characterized as cancer and prostate specific, and its transcripts are non-coding, once no peptide products have been found. Due to its structural characteristics, the PCA3 gene belongs thus to the increasing family of ncRNA. In the present work, four new variant molecules of the PCA3 gene have been sequence characterized and their frequencies demonstrated in prostate cancer and in benign prostatic hyperplasia patients, as well as in healthy individuals. We have also investigated and predicted the putative secondary structures formed in order to elucidate its role in prostate cancer biology. No association has been found between the frequency of these molecules and prostate pathologies (PCa or BPH). On the other hand, PCA3 variants were found in 10% (12/115) of cases in the general population. Similar analyses of the possible polypeptides of these molecules demonstrated that it remains as a non-coding RNA, and introns presents in the first, second and fourth variants suggesting a possible role as a miRNA with intracellular activity to these molecules to the PCA3 gene. In prostatic tissues, 100% of the prostate cancer cases presented the RNA molecule with an exon 2 splicing. However, further investigation must be carried out to demonstrate the true role of these splicing variants in prostate tumors and in other pathologies, once these molecules have been preferentially found in the peripheral blood. / CAPÍTULO I - O câncer de próstata é uma doença comum no mundo e já assumiu em alguns países uma das principais causas de mortalidade da população masculina. Vários marcadores moleculares têm sido associados à gênese do câncer de próstata. A fim de demonstrar a expressão diferencial dos níveis transcricionais dos genes AR, SRD5A2, KLK2, PSMA e PCA3 em doenças prostáticas, o RNAm foi analisado em tecidos com adenocarcinoma prostático (CaP, N= 48) e hiperplasia prostática benigna (HPB, N= 25) por meio da técnica RT-PCR multiplex semi-quantitativa. Foram observadas diferenças significativas na expressão relativa desses genes entre os tecidos cancerosos e nãocancerosos. A taxa de densidade ótica entre os amplicons para cDNA provenientes do gene AR foi 1.6 vezes maior no adenocarcinoma prostático. Por outro lado, os níveis de RNAm do gene SRD5A2 foi associado com a HPB e foi 1.4 vezes maior do que no CaP. Para os genes KLK2, PSMA e PCA3, os níveis transcricionais foram respectivamente, 1.9, 1.9 e 5 vezes maior no câncer comparado a tecidos benignos. Dos testes diagnósticos realizados, o gene PCA3 individualmente foi o que apresentou as melhores sensibilidade e acurácia, sendo que a inclusão das medidas de PSA sérico melhorou a sensibilidade (de 76 para 92%), o valor preditivo positivo (de 85 para 94%), o valor preditivo negativo (de 60 para 62%) e a acurácia (de 74 para 78%). Os dados sugerem que a maior expressão dos genes AR, KLK2, PSMA e PCA3 ou expressão reduzida do gene SRD5A2 em tecidos prostáticos podem indicar a ocorrência do adenocarcinoma da próstata, sendo que as análises do gene PCA3 juntamente aos do PSA sérico são altamente promissores como método auxiliar no diagnóstico desse tipo de câncer. CAPÍTULO II - O câncer de próstata (CaP) e o mais comumente diagnosticado na população masculina e consiste de eventos multifatoriais e multifocais. Devido a complexidade da doença, a qual inclui alterações genômicas, invasão local, liberação de células micrometastáticas para a circulação, invasão secundaria de tecidos de outros órgãos, e resistência ao bloqueio hormonal, muitos marcadores podem ser usados para representar os eventos múltiplos e variáveis que levam ao desenvolvimento do câncer. A baixa especificidade do único marcador para diagnostico do câncer de próstata, PSA, tem nos levado a investigar quatro potenciais marcadores no sangue periférico de pacientes pela detecção de seus níveis de RNAm e associá-los a parâmetros clínicos. Os níveis de expressão dos transcritos do KLK2, KLK3, PCA3 e PSMA foram avaliados pela RT-PCR Nested, em pacientes com CaP (99), com hiperplasia prostática benigna (HPB, 36) e voluntários saudáveis (104). Diferenças significativas foram encontradas para a expressão dos genes KLK2, PSMA e PCA3 entre os pacientes com CaP e os pacientes com HPB ou voluntários saudáveis. Os níveis do KLK2 e PSMA também apresentaram associação positiva (P<0.05) com doença extra-prostática (pT3). A RT-PCR Nested positiva combinada para os genes KLK2, PCA3 e PSMA com PSA sérico maior que 4ng/mL apresentou uma chance 10 vezes maior de ocorrência do câncer comparado aos controles saudáveis, com sensibilidade, especificidade e acurácia de 57%, 89% e 93%, respectivamente. A análise combinada dos genes KLK2, PCA3 e PSMA pode ser uma ferramenta útil na distinção de pacientes com CaP daqueles com doença benigna ou de indivíduos saudáveis. Ainda, a analise dos transcritos KLK2 e PSMA podem ser usados como marcadores prognósticos para a presença de doença extra-capsular e auxiliando na predição de recidiva da doença no pós-operatório. CAPÍTULO III - Os transcritos do gene PCA3/DD3 são até o momento as moléculas mais específicas encontradas em espécimes de câncer de próstata. Esses RNAm podem ser detectados em importantes alvos para a análise clínica como tecidos prostáticos, na urina após massagem prostática e em sangue periférico. O presente estudo avaliou a expressão do gene PCA3 em tecidos prostáticos e em sangue periférico de pacientes com HPB e CaP, por técnicas de RT-PCR, e baseado na sua detecção juntamente com os parâmetros clínicos, foi proposto um modelo de estadiamento molecular como técnica assessória para melhor o diagnóstico da doença. O uso concomitante da detecção dos transcritos do gene PCA3 no sangue periférico e no tecido prostático melhorou o diagnóstico, com sensibilidade e acurácia de 77%. Para o estadiamento molecular, os pacientes foram classificados como contendo a doença localizada (PBL-) e em doença com células tumorais circulantes (PBL +). Maiores freqüências de tumor localizado pelo estadiamento molecular foram observadas nos estadios T1-T2 (75%), enquanto que 25 e 43% dos cânceres T1-T2 e T3-T4, respectivamente, apresentaram PCA3 positivo (células circulantes). Uma correlação foi encontrada para o estadiamento molecular para doença localizada e PSA sérico pré-cirúrgico < 10ng/mL, e aproximadamente 60% dos pacientes TNM T3-T4 que apresentaram falha bioquímica após a cirurgia radical apresentaram RTPCR positiva do PCA3 (P= 0.05), com um Odds Ratio 16 vezes maior para a possibilidade de recorrência da doença em relação aos pacientes T1-T2 e uma acurácia de 82%. Esses dados demonstram a importância da detecção do gene PCA3 como método no diagnóstico do câncer de próstata, por distinguir pacientes com CaP daqueles com HPB, e também demonstrando seu valor prognóstico na doença recorrente no pósoperatório dos pacientes. CAPÍTULO IV - Aproximadamente 98% de todos os produtos transcritos do genoma humano correspondem a RNAs não codificantes (RNAnc). Muitas funções dos RNAnc são atribuídas a suas particularidades estruturais dadas principalmente pelas estruturas secundárias formadas a partir da sua sequência linear de bases. Dentre os tipos de RNAnc estão os RNAt, RNAr, small nuclear RNA, small nucleolar RNA, small interference RNA (siRNA), microRNA (miRNA) e RNAs catalíticos (ribozimas). A bioinformática tem fornecido ferramentas úteis na predição de estruturas secundárias ótimas ou subótimas permitindo o design de RNAs de interferência como os miRNAs ou siRNAs. Em humanos, os miRNAs tem sido associados ao desenvolvimento de diversas doenças complexas como o câncer. O gene PCA3 (DD3) foi molecularmente caracterizado como câncer- e próstata- específico e os seus RNAs são os responsáveis por essa característica, isso porque nenhum produto protéico tem sido encontrado para esse gene. Devido às suas características estruturais, o gene PCA3, pertence assim à crescente família de RNAnc. No presente trabalho foi analisado as freqüências de quatro moléculas variantes do gene PCA3, além das anteriormente reportadas, como também foram preditas as suas estruturas secundárias na tentativa de elucidar o seu papel na biologia do câncer de próstata. Nenhuma associação foi encontrada entre a freqüência dessas moléculas e as patologias da próstata como hiperplasia benigna ou câncer, sendo que na população geral analisada essas variantes foram encontradas em apenas 10% (12/115) dos casos. As análises de homologia de possíveis polipeptídeos para essas moléculas demonstram que permanece o papel de RNA não-codificante para o gene PCA3. Ainda, a presença de introns nas variantes 1, 2 e 4 podem sugerir um papel intracelular de miRNA para essas moléculas do gene PCA3. Nos tecidos prostáticos, 100% dos casos de câncer foi representando pela molécula com splicing do exon 2. Contudo, para as variantes de splicing, novas pesquisas deverão ser realizadas incluindo outras patologias além das doenças prostáticas e outros tipos tumorais para verificar o real impacto dessas moléculas, uma vez que foram encontradas preferencialmente no sangue periférico. / Doutor em Genética e Bioquímica