Células transformadas de E.coli DH5-α expressando a proteína verde fluorescente (GFPuv, pico de excitação e emissão de 394nm e 509nm) foram submetidas a extração pelo método de partição de três fases (TPP) e o extrato obtido purificado por cromatografia de interação hidrofóbica (HIC). O objetivo principal deste trabalho foi estudar a termoestabilidade da GFPuv extraída, para avaliar a sua possível utilização como indicador biológico econômico, de resposta rápida e precisa para processos térmicos de esterilização utilizando o calor úmido. A estabilidade térmica da proteína foi estudada em diferentes soluções-tampão (acetato, fosfato e tris-HCI 10mM) no intervalo de valor de pH de 5,O a 9,0 e, em temperaturas entre 75° e 95°C. Os parâmetros de resistência térmica determinados foram: o tempo de redução decimal (Valor D - min), valor z (°C), coeficiente Q10 e valor de energia de ativação (kcal/mol). A termoestabilidade da GFPuv, expressa em valor D, mostrou correlação linear para valores de pH ≥ 5,50, em tampão acetato. Em tampão fosfato, para valores de pH ≥ 7,50 a estabilidade térmica da proteína foi independente do valor de pH da solução. Em tampão tris-HCI, o valor D mostrou-se inconstante ao aumento do valor de pH da solução. No intervalo de temperatura estudada, em tampão acetato a GFPuv apresentou melhor termoestabilidade (Ea de 19,27 kcal/mol) do que em tampão fosfato (Ea de 26,18 kcal/mol ao valor de pH 6,S) e em tampão tris-HCI (Ea 28,19 kcallmol ao valor de pH 7,0). Em tampão acetato e tris-HCI ao valor de pH 7,0, a termoestabilidade da proteína mostrou-se equivalente. Entretanto, em tampão fosfato aos valores de pH 7,5 e 8,0 e em tampão tris-HCI aos valores de pH 8,0 e 8,5 a GFPuv apresentou menor estabilidade térmica A GFPuv apresenta potencialidade para ser utilizada como indicador biológico em processos térmicos que utilizam calor úmido às temperaturas inferiores a 100°C. / Transformed cells of Escheríchía coli DH5-α expressing recombinant green fluorescent protein (GFPuv, excitation and emission peaks at 394nm and 509nm), were subjected to the three-phase partitioning (TPP) method and the release extracts were eluted through methyl HIC column with a buffer solution (10 mM Tris-HCI, 10mM EDTA, pH=8.0). The purpose of this work was to study the thermal stability of the TPP-extracted recombinant protein, GFPuv, to determine its utility as a quick, accurate and economical biological indicator for moist heat-treatments. The thermal stability of the extracted GFPuv was studied in different buffer solutions (acetate, phosphate and tris-HCI 10mM) in the range of pH between 5.0 and 9.0 and at temperature between 75-95°C. The thermal resistance parameters determinated were: decimal reduction times (D-values, min), z-value (۰C), Q<sub<10 coefficient and Activation Energy (Ea, Kcal/mol). The thermal stability of GFPuv, expressed in D-values, showed linear correlation for pH ≥ 5.50 in acetate buffer. In phosphate buffer, for pH ≥ 7.50 the thermal stability was independent of pH value. In tris-HCI buffer the D-value was shown variable with the increase of pH value. In the studied temperature range, the acetate buffer at pH 6.0 presented better thermal stability for GFPuv (Ea 19.27kcal/mol) than phosphate (Ea 26.18 kcal/mol at pH 6.5) and tris-HCI buffer (Ea 28.19 kcal/mol at pH 7.0). In acetate and tris-HCI buffers at pH 7.0, GFPuv showed equivalent thermal stability. However, GFPuv showed lower thermal stability in phosphate buffer at pH 7.5 and 8.0 and in tris-HCI buffer at pH 8.0 and 8.5. The TPP-extracted GFPuv has great potential to be applied as a biological indicator in moist heat processes at temperatures below 100°C.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:IBICT/oai:teses.usp.br:tde-25062012-114829 |
| Date | 29 April 2003 |
| Creators | Marina Ishii |
| Contributors | Thereza Christina Vessoni Penna, Mitsuko Taba Ohara, Adalberto Pessoa Junior |
| Publisher | Universidade de São Paulo, Tecnologia Bioquímico-Farmacêutica, USP, BR |
| Source Sets | IBICT Brazilian ETDs |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | English |
| Type | info:eu-repo/semantics/publishedVersion, info:eu-repo/semantics/masterThesis |
| Source | reponame:Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da USP, instname:Universidade de São Paulo, instacron:USP |
| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess |
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