Lípides nitrados (NO2-FA) são apontados como uma nova classe de mediadores lipídicos, podendo atuar como reservatórios endógenos de óxido nítrico (&#8226NO) bem como moduladores pluripotentes de sinalização celular. Recentemente, tem sido sugerido que os doadores de &#8226NO estariam envolvidos na regulação da angiogênese. Evidências contundentes indicam ainda que o processo de neovascularização poderia contribuir para a patogênese de uma serie de condições clínicas, entre elas a aterosclerose. Contudo, apesar de diversos estudos terem explorado os efeitos biológicos dos NO2-FA, os efeitos destes compostos sobre o processo de angiogênese não haviam sido descritos. Dessa maneira, o presente trabalho investigou os efeitos dos NO2-FA (derivados da nitração do ácido linoléico e oléico) noprocesso de angiogênese. Demonstrou-se que os NO2-FA podem atuar como mediadores pró-angiogênicos. Este efeito foi caracterizado em células endoteliais humanas, assim como, em modelos ex vivo e in vivo. Nas células endoteliais, observou-se que os No2-FA não influenciaram a proliferação ou a viabilidade celular, ao passo que estimularam a migração. Demonstrou-se também que os NO2-FA podem modular o brotamento ex vivo de novos vasos, em cultura de anéis de aorta de rato, bem como o processo angiogênico in vivo observado na membrana corioalantóica de embrião de galinha. Adicionalmente, os NO2-FA induziram a expressão do fator de crescimento endotelial vascular (VEGF), que é o principal mediador do processo de angiogênese. Em relação ao mecanismo de ação, os achados sugerem que os efeitos demonstrados seriam via mecanismos dependentes de &#8226NO, uma vez que foram abolidos na presença de um seqüestrador de &#8226NO, enquanto concentrações equivalentes dos lípides precursores não demonstraram qualquer influência nas condições experimentais utilizadas neste estudo. Por fim, os efeitos pró-angiogênicos dos NO2-FA foram mediados pela estabilização da proteína do fator induzível por hipóxia -1α (HIF-1α), uma vez que estes compostos promoveram acúmulo desta proteína e falharam em demonstrar efeitos indutores em células knockdown para o gene HIF-1α. Em conjunto, estes resultados indicam que os NO2-FA podem modular a migração de células endoteliais e estimular o processo de angiogênese resultante da ativação de HIF-1a via mecanismo dependente de &#8226NO. / Nitrated lipids (NO2-FA) are described as a new class of Iipid mediators that are able to act as endogenously nitric oxide (&#8226NO) reservoirs as well as pluripotent cell signaling modulators. Furthermore, recent findings suggest that &#8226NO donors could be involved in the regulation of angiogenesis. Compelling evidence also indicate that the neovascularization process might contribute to the pathogenesis of many clinical conditions, such as atherosclerosis. However, although several studies have explored the NO2-FA biological properties, the effects of these compounds on the angiogenic process remain unknown. Hence, the present study investigated the effects of the NO2-FA (derivates from the nitration of Iinoleic and oleic acids at physiological concentrations) on angiogenesis processo It is demonstrated that the No2-FA could act as pro-angiogenic mediators. This effect was observed not only in human endothelial cells but also in ex vivo and in vivo models. Using endothelial cells, it is showed that NO2-FA failed to affect cell proliferation ar influence cellular viability, but significantly stimulated cell migration. It was also found that the NO2-FA might modulate the ex vivo sprouting of new vessels as well as the in vivo angiogenic process, while inducing the expression of the vascular endothelial growth factor, the main mediator of angiogenesis. The data are consistent with the hypothesis that the observed effects mediated by NO-dependent mechanisms, since the presence of a &#8226NO scavenger abrogated the induced effects, whereas equimolar concentrations of its precursors, showed no effect on angiogenesis under our experimental conditions. Finally, the pro-angiogenic effects of NOrFA were mediated by the stabilization of the hypoxia inducible factor-1α (HIF-1α) protein, because these compounds increased the protein amount and failed to show inductive effects in HIF-1α knockdown cells. Taken together, these findings indicated that NO2-FA might modulate the endothelial cell migration and stimulate the process of angiogenesis by the HIF-1α induction through a &#8226NO-dependent mechanism.

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Esquistossomose é uma das doenças parasitárias com maior incidência mundial. Schistosoma mansoni, a única espécie encontrada no Brasil, tem um ciclo de vida complexo que inclui seis estágios de desenvolvimento distintos e dois hospedeiros, sendo um deles o homem. Nosso grupo identificou um gene que codifica um receptor que possui homologia com o receptor de TNF-&#945; humano em S. mansoni (SmTNFR) e descrevemos o efeito in vitro da citocina humana TNF-&#945; sobre a expressão gênica em larga escala no parasita. A via de sinalização através da qual o TNF-&#945; atua sobre o parasita permanece desconhecida. Em humanos, o TNF-&#945;, ao se ligar à isoforma do receptor que é mais semelhante ao SmTNFR, inicia uma cascata de fosforilação que conduz à ativação de diversas proteínas quinases que levam à ativação de fatores de transcrição. A nossa hipótese é a de que esta citocina humana atuaria no parasita de forma semelhante, resultando na alteração da expressão gênica do parasita observada em nosso trabalho anterior. No presente trabalho tivemos como objetivo verificar se há aumento de proteínas fosforiladas após o tratamento in vitro de vermes com o TNF-&#945; humano, e identificá-las, elucidando a via de sinalização induzida por esta citocina em S. mansoni. A fim de identificar as proteínas que são significativamente diferencialmente fosforiladas após exposição de S. mansoni à citocina humana, vermes machos adultos foram incubados em cultura por 15 min com TNF-&#945; (20 ng / ml), ou somente com o veículo, em controles, seguido da extração de proteínas totais. Utilizamos a abordagem fosfoproteômica por meio da realização de eletroforese bidimensional, seguida de coloração com corante específico para fosfoproteínas Pro-Q Diamond (Invitrogen). Para identificar quais proteínas tiveram fosforilação alterada pelo tratamento, fizemos uma análise quantitativa dos spots (volume dos spots) nas imagens dos géis corados com Pro-Q, utilizando o software 2D Platinum (GE). Em seguida a coloração de proteína total dos géis foi realizada utilizando Coomassie Blue Coloidal, para localização de todos os spots de proteínas de cada gel. Cortamos dos géis os spots de proteínas que apresentaram mudanças estatisticamente significativas na fosforilação (n = 3 réplicas; p <0,05, teste-t), com base na comparação de seus volumes relativos nas imagens dos géis das amostras tratadas comparadas com as controles, e em seguida as proteínas das amostras foram identificadas por espectrometria de massa. Analisamos três réplicas biológicas e observamos 45 spots que tiveram fosforilação significativamente alterada, sendo que 42 deles apresentaram fosforilação aumentada e 3 apresentaram fosforilação diminuída após o tratamento com a citocina. Entre os spots identificados por espectrometria de massa, verificou-se que proteínas relacionadas a processos metabólicos, sinalização celular, citoesqueleto e contração muscular estavam entre as que sofreram aumentos de fosforilação com o tratamento com TNF-&#945; humano. Embora a abordagem experimental adotada para este estudo não tenha sido sensível o suficiente para concluir qual via canônica de transdução de sinal é ativada por TNF-&#945; humano em S. mansoni, este estudo confirmou o aumento da fosforilação de proteínas-alvo induzido por TNF-&#945; humano, abrindo novos caminhos para uma investigação mais aprofundada que caracterize o papel das proteínas identificadas como alteradas por essa via de sinalização, e permita entender melhor a importância do TNF-&#945; humano na biologia do S. mansoni e na interação parasita-hospedeiro. / Schistosomiasis remains one of the parasitic diseases with the highest incidence worldwide. Schistosoma mansoni, the only species found in Brazil, has a complex life cycle which includes six life stages and two hosts, one of them being humans. Our group has identified a gene that encodes a TNF-alpha receptor-like in S. mansoni (SmTNFR) and described the in vitro effect of human TNF-alpha cytokine on large-scale gene expression of the parasite. The signaling pathways by which TNF-alpha acts upon the parasite remain unknown. In humans, when TNF-alpha binds to the receptor isoform that is most similar to SmTNFR it initiates a phosphorylation cascade that activates a signaling pathway leading to the activation of transcription factors. Our hypothesis is that this cytokine could act in the parasite through a phosphorylation cascade that activates transcription factors resulting in the change of gene expression observed in our previous work. The aim of this work was to verify if there were proteins that showed increased phosphorylation upon the in vitro treatment of worms with human TNF-alpha, identifying them, to try and elucidate the signaling pathway by which the cytokine acts in S. mansoni. In order to identify which proteins are significantly differentially phosphorylated upon exposure of S. mansoni to the human cytokine, we incubated male adult worms for 15 min in culture with human TNF-alpha (20 ng / ml), or with vehicle only, in controls, and we extracted total proteins from the parasites. We used the phosphoproteomics approach of bidimensional gel electrophoresis followed by phospho-specific staining of gels using Pro-Q Diamond dye (Invitrogen). To identify which proteins were phosphorylated or had their phosphorylation changed due to the treatment, we quantified the spots (determined the spots volumes) from Pro-Q stained gels using Image Master 2D Platinum software (GE). A total protein staining of the gels was performed using Coomassie Brilliant Blue (CBB) in order to localize all protein spots in the gel. We excised from CBB stained gels the protein spots that showed statistically significant changes in phosphorylation (n= 3 replicates; p-value<0.05, t-test), based on the relative volumes of their spot images with respect to the total volume of spots in the gel, with samples from treated compared to control parasites, and subsequently the proteins in these samples were identified by mass spectrometry. We have analyzed three biological replicates and observed 45 spots that were differentially phosphorylated; 42 of them had their phosphorylation increased and 3 had their phosphorylation decreased upon a 15-min-treatment of male adult worms with the cytokine. Among the spots identified by mass spectrometry, we found proteins related to metabolic process, cell signaling, and cytoskeleton and muscle contraction. Although the experimental approach adopted for this study was not sensitive enough to conclude which canonical signal transduction pathway is activated by human TNF-alpha in S. mansoni, this kind of study confirmed the increase in phosphorylation of target proteins induced by human TNF-alpha, opening new paths for further investigation in order to characterize the role of the proteins identified as altered by this specific signaling, which will lead to a better understanding of the importance of this cytokine in the biology of S. mansoni and in host-parasite interaction.

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