Diese Dissertation befasst sich mit den möglichen Folgen einer Kolonisation mit Helicobacter pylori (H. pylori) im Kindesalter. Von besonderem Interesse ist dabei die Entwicklung des Body-Mass-Index (BMI). Dazu werden die Daten einer populationsbezogenen Querschnittsstudie, welche 1998 und 2006 unter Leipziger Schulanfängern bzw. Achtklässlern durchgeführt wurde, analysiert. Insgesamt konnten 1349 bzw. 1161 Kinder, deren H. pylori-Status mittels 13C‑Harnstoff-Atemtest untersucht wurde, in die Untersuchung inkludiert werden. Dabei bestätigte sich, dass die Besiedlung mit H. pylori u.a. signifikant mit einem geringeren sozialen Status und einer geringeren Körpergröße der Kinder assoziiert ist. Der BMI der untersuchten Kinder unterscheidet sich jedoch nicht signifikant in Abhängigkeit von einer Kolonisation mit H. pylori. Auf diesen Ergebnissen basierend werden zwei Hypothesen diskutiert. Zum einen wird analysiert, inwieweit ein Einfluss einer Infektion mit dem Erreger auf den BMI der Kinder nicht sicher auszuschließen ist und dieser eventuell aufgrund der Komplexität der Gewichtsentwicklung in den Ergebnissen dieser Untersuchung nicht erkennbar ist. Zum anderen wird die geringere Körpergröße H. pylori‑besiedelter Kinder nicht auf mit der Infektion in Verbindung stehende Ernährungsstörungen in Zusammenhang gebracht, da sonst vor einer entscheidenden Größenminderung das Gewicht bzw. der BMI der Studienteilnehmer zurück bleiben müsste.

Objetivo: Determinar la frecuencia de Helicobacter pylori en muestras histopatológicas gástricas malignas y premalignas del servicio de anatomía patológica del Hospital Regional Lambayeque durante los años 2016 al 2019. Material y métodos. Estudio censal, observacional descriptivo, retrospectivo y transversal. La población de estudio estuvo conformada por los pacientes cuyas muestras histológicas gástricas fueron recibidas y estudiadas en el servicio de anatomía patológica del Hospital Regional Lambayeque. Resultados. Cumplieron con los criterios de selección 566 pacientes. La edad media fue 57,3; rango de 8 a 97 años. Hubo un predominio de pacientes entre la quinta (23.9%), sexta (24%) y séptima (17%) década de la vida. La frecuencia global de Helicobacter Pylori en las muestras seleccionadas fueron de 70.5%, con un predominio en el sexo masculino (71.2%). Los hallazgos anatomopatológicos se distribuyeron de la siguiente manera: 147 pacientes (26%) con gastritis crónica atrófica (GCA), 333 (58.8%) con metaplasia intestinal (MI), 60 (10.6%) con displasia y 26 (4.6%) con cáncer gástrico. Metaplasia intestinal fue el hallazgo más común; el mismo que se encontró en 166 personas (49.85%) con MI completa, 73 (21.92%) con MI incompleta y 94 (28.22%) con MI mixta. Conclusiones La frecuencia de Helicobacter Pylori (HP) fue alta en las lesiones premalignas, mientras que no hubo diferencias en la presencia o ausencia en muestras gástricas malignas. Conforme avanzaba la edad disminuía la frecuencia del HP pero aumentaban la gravedad de las lesiones. / Objective: Determine the frequency of Helicobacter pylori in malignant and premalignant gastric histopathological samples from the pathological anatomy service of the Hospital Regional Lambayeque during the years 2016 to 2019. Material and methods. Census, observational, descriptive, retrospective and cross-sectional study. The study population was made up of patients whose gastric histological samples were received and studied in the pathological anatomy service of the Hospital Regional Lambayeque. Results. 566 patients fulfilled the selection criteria. The mean age was 57.3; range from 8 to 97 years. There was a predominance of patients between the fifth (23.9%), sixth (24%) and seventh (17%) decades of life. The overall frequency of Helicobacter Pylori in the selected samples was 70.5%, with a predominance in the male sex (71.2%). The anatomopathological findings were distributed as follows: 147 patients (26%) with chronic atrophic gastritis (CAG), 333 (58.8%) with intestinal metaplasia (IM), 60 (10.6%) with dysplasia and 26 (4.6%) with gastric cancer. Intestinal metaplasia was the most common finding; the same that was found in 166 people (49.85%) with complete MI, 73 (21.92%) with incomplete MI and 94 (28.22%) with mixed MI. Conclusions The frequency of Helicobacter Pylori (HP) was high in premalignant lesions, while there were no differences in the presence or absence in malignant gastric samples. As age advanced, the frequency of PH decreased but the severity of the lesions increased.

Infektionen mit H. pylori führen zu Veränderungen im Aufbau und der zellulären Zusammensetzung des Magenepithels. Aktuelle Studien haben gezeigt, dass Stromazellen, die sich in unmittelbarer Nähe der epithelialen Stammzelle befinden, die funktionelle Nische für dieses Kompartiment bilden und wichtige Faktoren für die Regulierung des Stammzellumsatzes und Differenzierung darstellen. Daher konzentriere ich mich bei dieser Arbeit auf die Rolle der Myh11+ Myofibroblasten, die sich sowohl unter als auch zwischen den Epitheldrüsenzellen befinden. Ich fand heraus, dass die Myofibroblasten in der Homöostase einen BMP-Gradienten entlang der Drüsenachse mit erhöhter Expression von Bmp2 im oberen Teil erzeugen, während die Drüsenbasis von Zellen umgeben ist, die Bmp-Inhibitoren produzieren. Basierend auf der Funktionsanalyse mit 3D-Organoidmodellen ist der Bmp-Signalweg ein zentraler Faktor für die rasche Differenzierung von Stammzellen in faveoläre mukusproduzierende Zellen. Darüber hinaus wurde ein auto-parakriner Signalweg gefunden, der zur Bildung von Bmp2 in Epithelzellen führt. Meine Untersuchungen Daten zeigten eine Verringerung des BMP-Signalwegs in H. pylori-infizierten Myofibroblasten. Darüber hinaus führte eine Infektion mit H. pylori nicht nur zum Verlust der stromalen, sondern auch der epithelialen Bmp2-Expression. Diese Beobachtung ging mit einer Zunahme von IFNγ einher, was auf eine Verbindung zwischen beiden Signalwegen hinwies. Tatsächlich zeigten anschließende Experimente mit Organoiden, dass IFNγ den Bmp-Signalweg hemmt und dadurch die terminale Differenzierung blockiert. Zusammenfassend zeigen meine Untersuchungen, dass das Schicksal einer Zelle, die zur Oberfläche der Magendrüse wandert, eine Induktion des BMP-Signalwegs erfährt. Die Reduktion dieses Signals durch IFNγ deutet auf einen Mechanismus hin, der Veränderungen in der zellulären Differenzierung und die Entwicklung von prämalignen epithelialen Läsionen im Verlauf einer H. pylori-Infektion bewirkt. / Infection with Helicobacter pylori (H. pylori) leads to alterations of the topology and cellular composition of the gastric epithelium. Recent studies have shown that stromal cells located in close proximity to the epithelial stem cell are creating the niche for this compartment and provide crucial factors that regulate stem cell turnover and fate decisions. Therefore, this thesis focuses on of Myh11+ myofibroblasts that are located beneath and between the epithelial gland cells. I found that during homeostasis, the myofibroblasts generate a BMP gradient along the gland axis with strong expression of Bmp2 in the upper part, whereas the base is surrounded by cells producing BMP inhibitors. Based on functional analysis with 3D organoid models, the BMP gradient occurs to be a main factor responsible for rapid differentiation of stem cells into pit surface mucous cells. Moreover, experiments led me to identify an auto-paracrine feed-forward BMP2 loop in epithelial cells, which further stabilizes BMP signaling once it is activated and induces terminal differentiation. Data presented in this study demonstrated a reduction of BMP signaling in H. pylori-infected myofibroblasts. Furthermore, infection with H. pylori resulted in loss of not only stromal, but also epithelial Bmp2 expression. This observation was accompanied with increase of Interferon γ (IFNγ), which indicated a link between both pathways. Consistently, stimulation of organoids with IFNγ impairs BMP signaling and the BMP2 feed-forward loop, and thereby blocks terminal differentiation. Together, this study shows that the fate of a cell migrating into the surface of the gastric gland is determined by an induction of BMP signaling and stabilized by an auto-paracrine BMP signaling enhancement. Reduction of this signaling by IFNγ revealed a mechanism which contributes to altered cellular differentiation and development of premalignant epithelial alterations in the context of H. pylori infection.

Das Gen für die Expression von Helicobacter pylori Urease wurde in das Genom von Salmonella typhi Ty21a (Typhoral() integriert. Der resultierende Stamm erhielt die Bezeichnung Salmonella typhi Ty21a(pDB1). Neun gesunden Probanden wurde Salmonella typhi Ty21a(pDB1) verabreicht. In der Kontrollgruppe erhielten drei gesunde Probanden Salmonella typhi Ty21a. Schwerwiegende Nebenwirkungen wurden bei keinem der Probanden beobachtet. Zehn von 12 Probanden zeigten eine humorale Immunantwort gegen Antigene von Salmonella typhi, nachgewiesen über die Detektion spezifischer Antikörper produzierender Zellen, aber bei nur zwei Probanden ließ sich eine Serokonversion nachweisen. Eine zelluläre Immunantwort gegen das H-Antigen von Salmonella typhi konnte bei insgesamt fünf Probanden nachgewiesen werden. Insgesamt sechs Probanden zeigten eine zelluläre Immunantwort gegen Urease von Helicobacter pylori in zumindest einem von drei der zur Anwendung gebrachten Testsysteme (Proliferation, T-cell-Elispot, IFN-gamma Elisa). Eine humorale Immunantwort gegen Urease von Helicobacter pylori konnte bei keinem der Probanden nachgewiesen werden. Ty21a(pDB1) ist somit ein geeigneter Prototyp zur Optimierung einer Salmonella basierte Impfung zur Induktion einer zellulären Immunantwort, die zu einer protektiven Immunität gegenüber Helicobacter pylori führen könnte. / Helicobacter pylori urease was expressed in the common live typhoid vaccine Salmonella typhi Ty21a (Typhoral() yielding Salmonella typhi Ty21a(pDB1). Nine volunteers received Salmonella typhi Ty21a(pDB1) and three control volunteers received Salmonella typhi Ty21a. No serious adverse effects were observed in any of the volunteers. Ten out of 12 volunteers developed humoral immune responses to the Salmonella carrier as detected by antigen-specific antibody-secreting cells but only two volunteers seroconverted. A total of five volunteers showed cellular responses to the carrier. Six out of nine volunteers that had received Salmonella typhi Ty21a(pDB1) showed a T-cell response to Helicobacter urease in at least one of the three assays for detection of cellular response (Proliferation, T-cell-Elispot, IFN-gamma Elisa). No volunteer had detectable humoral responses to urease. Salmonella typhi Ty21a(pDB1) is a suitable prototype to optimize Salmonella-based vaccination for efficient cellular responses that could mediate protective immunity against Helicobacter.

Bakterielle Infektionen aktivieren den Transkriptionsfaktor NF-κB. Dies trägt sowohl zur Immunantwort, als auch zum Überleben der Wirtszellen bei. In Infektionen mit dem Bakterium Helicobacter pylori stellt diese doppelte Funktion einen mechanistischen Link zwischen der chronischen Entzündung und der Krebsentstehung dar. Für das intrazelluläre Bakterium Legionella pneumophila ist das Überleben der Wirtszelle notwendig für die Vermehrung. Bisher sind jedoch bei beiden Infektionen die Signalwege, die zur NF-κB-Aktivierung führen, nicht ausreichend untersucht. Um NF-κB analysieren zu können, wurden hier monoklonale Zelllinien hergestellt, die ein Fusionsprotein der NF-κB-Untereinheit p65 mit GFP stabil exprimieren. Die Kerntranslokation von p65-GFP kann mit Fluoreszenz-Mikroskopie visualisiert und mit automatischer Bildanalyse quantifiziert werden. Mit dieser Methode konnte zum ersten Mal eine durch ein Bakterium induzierte Oszillation von p65-GFP gezeigt werden. In einem RNAi-basierten Hochdurchsatzscreen wurde diese Methode eingesetzt um neue Faktoren im NF-κB-Signalweg zu identifizieren. Dabei wurde die Infektion mit H. pylori mit den Induktoren TNFα und IL-1β verglichen. Insgesamt wurden 24 Regulatoren identifiziert. Die Identifikation dieser Faktoren vertieft nicht nur unser Verständnis des NF-κB-Signalweges, sondern bietet auch neue molekulare Ziele für mögliche zukünftige Therapien. Bei der detaillierten Analyse der L. pneumophila-induzierten NF-κB-Aktivierung konnte ein einzigartiger, zwei-phasiger Ablauf gezeigt werden. Zunächst verursachte bakterielles Flagellin eine starke, aber kurze Aktivierung. Später war p65 dauerhaft über Stunden im Kern lokalisiert, was eng an die Replikation der Bakterien gekoppelt war. Da die kontinuierliche Kernlokalisation für Transkriptionsfaktoren der NF-κB Familie sehr ungewöhnlich ist, könnte dies ein Hinweis für eine Manipulation durch das Bakterium sein, um das Überleben der Wirtszelle zu sichern. / Infection with pathogens leads to activation of the transcription factor NF-κB. This contributes both to the immune response as well as survival of host cells. In infection with the bacterium Helicobacter pylori, this dual function provides a mechanistic link between the chronic inflammation and cancer development. In infection with the intracellular pathogen Legionella pneumophila, the survival oft he host cell is necessary for replication. However, in both infections, the signaling pathways leading to NF-κB activation are not well understood. Here, in order to investigate NF-κB activation, monoclonal cell lines were generated that stably express the NF-κB subunit p65 fused to GFP. Nuclear translocation of p65-GFP can be visualized by fluorescence microscopy and quantified by software-based picture analysis. Using this technology, oscillations of p65-GFP nuclear translocation could be shown after H. pylori infection. To identify new factors important for NF-κB activation, the new assay was used to conduct an RNAi-based screen. In the screen, infection with H. pylori was compared to induction with the cytokines TNFα and IL-1β. In total, 24 key regulators for NF-κB were identified. The identification of these factors broadens our understanding of NF-κB signaling and could provide targets for future therapies. Finally, detailed observation of NF-κB activation induced by L. pneumophila in single cells revealed a unique, biphasic NF-κB activation. During the first hours, bacterial flagellin induced strong but transient activation. Then, p65 translocated continuously to the nucleus over hours without oscillation. Testing an array of bacterial mutants, a tight link between bacterial replication and continuous NF-κB activation could be shown. Because this continuous nuclear localization is very unusual for a transcription factor of the NF-κB family, this indicates that L. pneumophila could manipulate NF-κB to ensure host cell survival.

published_or_final_version / Pathology / Doctoral / Doctor of Philosophy

published_or_final_version / abstract / Medicine / Doctoral / Doctor of Philosophy

published_or_final_version / abstract / Medicine / Master / Doctor of Medicine

published_or_final_version / abstract / Chemistry / Doctoral / Doctor of Philosophy

The development of improved sequencing technologies hasenabled the field of genomics to evolve. Handling andsequencing of large numbers of samples require an increasedlevel of automation in order to obtain high throughput andconsistent quality. Improved performance has lead to thesequencing of numerous microbial genomes and a few genomes fromhigher eukaryotes and the benefits of comparing sequences bothwithin and between species are now becoming apparent. Thisthesis describes both the development of automated purificationmethods for DNA, mainly sequencing products, and a comparativesequencing project. The initially developed purification technique is dedicatedto single stranded DNA containing vector specific sequences,exemplified by sequencing products. Specific capture probescoupled to paramagnetic beads together with stabilizing modularprobes hybridize to the single stranded target. After washing,the purified DNA can be released using water. When sequencingproducts are purified they can be directly loaded onto acapillary sequencer after elution. Since this approach isspecific it can be applied to multiplex sequencing products.Different probe sets are used for each sequencing product andthe purifications are performed iteratively. The second purification approach, which can be applied to anumber of different targets, involves biotinylated PCR productsor sequencing products that are captured using streptavidinbeads. This has been described previously, buthere theinteraction between streptavidin and biotin can be disruptedwithout denaturing the streptavidin, enabling the re-use of thebeads. The relatively mild elution conditions also enable therelease of sensitive biotinylated molecules. Another project described in this thesis is the comparativesequencing of the 40 kbcagpathogenicity island (PAI) in fourHelicobacter pyloristrains. The results included thediscovery of a novel gene, present in approximately half of theSwedish strains tested. In addition, one of the strainscontained a major rearrangement dividing thecagPAI into two parts. Further, information about thevariability of different genes could be obtained. Keywords:DNA sequencing, DNA purification, automation,solid-phase, streptavidin, biotin, modular probes,Helicobacter pylori,cagPAI. / <p>NR 20140805</p>