Invasive species are generally problematic where they occur, especially in terms of ecology, economy and disease. Members of the genus Rattus Fischer, 1803 particularly, are known as one of the most destructive invasive species to date since they cause widespread damage on terrestrial and island ecosystems. Two Rattus species have historically been reported as invasive species in South Africa, Rattus rattus Linnaeus, 1758, which has a widespread distribution throughout the country and Rattus norvegicus Berkenhout, 1769 which is primarily distributed along the coast of South Africa. A third species, Rattus tanezumi Temminck, 1844 (which forms part of the R. rattus species complex), a south-east Asian endemic, was first reported in 2005 to also occur in South Africa (and Africa). As this species is morphologically similar to R. rattus, its identification is reliant on molecular typing approaches. In the current study, molecular, morphological and disease aspects of South African Rattus were assessed. The nature and extent of variation between the three species was investigated using cytochrome b sequences and extensive mitochondrial d-loop database for comparative purposes. D-loop data identified one, four and two haplotypes for R. tanezumi, R. rattus and R. norvegicus, respectively whereas cytochrome b data identified additional haplotypes for R. rattus and R. tanezumi. Pairwise sequence divergence was highest between R. norvegicus and R. tanezumi (12.5% for D-loop and 12.0% for cyt b). Rattus norvegicus was recovered in the central parts of South Africa for the first time and occurred sympatrically with R. tanezumi at one locality, whereas Rattus rattus and R. tanezumi occurred sympatrically at three localities. The external and qualitative cranial morphology of all three species was compared in an attempt to find differences that could be used to morphologically differentiate between these Rattus species. Whereas R. norvegicus can easily be distinguished from R. rattus and R. tanezumi, there are no discernible morphological differences to distinguish R. rattus and R. tanezumi. A taxonomic synthesis and an identification key of the three species of Rattus based on qualitative morphology, molecular and cytogenetic data using genetically-identified individuals is provided. Members of South African Rattus were also found to be carriers of the bacteria Bartonella Strong et al., 1915 and Helicobacter Goodwin et al., 1989 emend. Vandamme et al., 1991. Bartonella elizabethae (Daly et al., 1993) Brenner et al., 1993, occurring in Rattus around the world was for the first time recovered from South African Rattus. This bacterium has been associated with infective endocarditis in humans and may pose a threat to immuno-compromised individuals in rural South African communities where Rattus occurs commensally. Two Helicobacter species, H. rodentium Shen et al., 1997 and H. muridarum Lee et al., 1992, were identified neither of which have known zoonotic potential. Apart from contributing to general small mammal studies in Africa, the present study may have implications in epidemiological, agricultural, biological conservation, and invasion biology research associated with problem rodents in the southern African subregion and beyond. / Dissertation (MSc)--University of Pretoria, 2010. / Zoology and Entomology / unrestricted

Colorectal cancer (CRC) is one of the most treatable cancers, with a 5-year survival rate of similar to 64%, yet over 50,000 deaths occur yearly in the United States. In 15% of cases, deficiency in mismatch repair leads to null mutations in transforming growth factor beta (TGF-beta) type II receptor, yet genotype alone is not responsible for tumorigenesis. Previous work in mice shows that disruptions in TGF-beta signaling combined with Helicobacter hepaticus cause tumorigenesis, indicating a synergistic effect between genotype and microbial environment. Here, we examine functional shifts in the gut microbiome in CRC using integrated - omics approaches to untangle the role of host genotype, inflammation, and microbial ecology. We profile the gut microbiome of 40 mice with/without deficiency in TGF-beta signaling from a Smad3 (mothers against decapentaplegic homolog-3) knockout and with/without inoculation with H. hepaticus. Clear functional differences in the microbiome tied to specific bacterial species emerge from four pathways related to human colon cancer: lipopolysaccharide (LPS) production, polyamine synthesis, butyrate metabolism, and oxidative phosphorylation (OXPHOS). Specifically, an increase in Mucispirillum schaedleri drives LPS production, which is associated with an inflammatory response. We observe a commensurate decrease in butyrate production from Lachnospiraceae bacterium A4, which could promote tumor formation. H. hepaticus causes an increase in OXPHOS that may increase DNA-damaging free radicals. Finally, multiple bacterial species increase polyamines that are associated with colon cancer, implicating not just diet but also the microbiome in polyamine levels. These insights into cross talk between the microbiome, host genotype, and inflammation could promote the development of diagnostics and therapies for CRC. IMPORTANCE Most research on the gut microbiome in colon cancer focuses on taxonomic changes at the genus level using 16S rRNA gene sequencing. Here, we develop a new methodology to integrate DNA and RNA data sets to examine functional shifts at the species level that are important to tumor development. We uncover several metabolic pathways in the microbiome that, when perturbed by host genetics and H. hepaticus inoculation, contribute to colon cancer. The work presented here lays a foundation for improved bioinformatics methodologies to closely examine the cross talk between specific organisms and the host, important for the development of diagnostics and pre/probiotic treatment.

Please read the abstract in the section front of this document / Dissertation (MSc)--University of Pretoria, 2007. / Chemical Pathology / unrestricted

Introduction. The operative link for gastritis assessment (OLGA) and the operative link on gastric intestinal meta-plasia assessment (OLGIM) staging systems have been sug-gested to provide risk of assessment for gastric cancer. Objec-tive. To evaluate the distribution of OLGA and OLGIM staging by age and Helicobacter pylori status. Material and methods. We studied 197 subjects undergoing elective upper gastrointestinal endoscopy. The presence of the H. pylori and histological changes were evaluated using the updated Sydney system. Stages III and IV of OLGA/OLGIM were considered high risk stages. Results. The H. pylori rate was 56.85% (112/197). High-risk OLGA/OLGIM cases were rare: 7/112 (6.5%) cases of OLGA in the H. pylori positive group and 6/85 (7%) in the H. pylori negative group; 5 (4.4%) cases of OLGIM in the H. pylori positive and 6 (7%) in the H. pylori negative. The proportion of advanced stages of OLGA and OLGIM increased with age (p < 0.001). High-risk OLGA was not found before age 40 regardless of the presence of H. pylori, but increased to 16.2%, 10.3%, 17.3% and 40.8% in subjects in the fourth, fifth, sixth and seventh decade of life respectively. The OLGIM high risk showed a similar trend: 0% before 40 years and up to 22.6% in people of 70 years. Conclusions. High-risk OLGA/OLGIM cases are infrequent before age 40 and increase significantly with age. No relation was found with the presence of the H. pylori. According to these protocols, only a fifth of the patients would strictly require endoscopic control. / Revisión por pares

In der Humanmedizin wird zur Beurteilung der Magenschleimhautproben das aktualisierte Sydney-System nach STOLTE (1997) angewendet. Das Ziel war es herauszufinden, ob das histologische Grading System auch in der Veterinärmedizin, für die Beurteilung von Pferdemagenschleimhautpräparaten, genutzt werden kann und ob daraus neue Erkenntnisse erwachsen. Von 60 Pferden wurden direkt post mortem Schleimhautproben aus der Pars glandularis (Drüsenschleimhaut), im Bereich der großen Kurvatur und dem Pylorus, entnommen. Die Patienten wurden in 4 Gruppen, 10 operierte (Kolik)pferde, 36 Pferde mit Kolik und infauster Prognose, 6 Pferde mit hochgradigen Magenulzera und 8 Pferde, die nicht auf Grund einer Kolik euthanasiert wurden, eingeteilt. Die makroskopische Beurteilung der 60 Pferdemägen erfolgte nach MURRAY et al. (1989) und MACALLISTER et al. (1995). Die histopathologische Beurteilung erfolgt in der Humanmedizin anhand der Helicobacter-like-Organismen Dichte, dem Grad der chronischen Entzündung, der Aktivität der Gastritis, der Atrophie und der intestinalen Metaplasie. Nach diesen Beurteilungsvariablen wurden die 120 Proben aus den 60 Pferdemägen beurteilt. Die ätiologischen Diagnosen sind in der Humanmedizin das Ergebnis jahrzehntelanger Forschung. Beim Pferd liegen dagegen zur Ätiologie der Gastritis noch keine gesicherten Erkenntnisse vor. Beim Pferd gibt es bestimmte Gastritisformen, die denen des Menschen ähnlich sind. Doch können die morphologischen Befunde in der Veterinärmedizin, nach den jetzigen Erkenntnissen, keinen Ätiologien zugeordnet werden. Die ätiologischen Diagnosen in dieser veterinärmedizinischen Studie beruhen auf der Diagnostik am Menschen und wurden noch nicht auf ihre Richtigkeit beim Pferd überprüft. Von den 60 untersuchten Pferdemägen wiesen 31 makroskopisch Läsionen in der Magenschleimhaut auf. 20 Pferde mit Veränderungen hatten diese in der Pars glandularis. Bei 44 der Pferde bestätigt der histologische Befund, nach dem aktualisierten Sydney- System, das makroskopische Grading. 13 der Pferde hatten nach dem aktualisierten Sydney-System histologisch einen pathologischen Befund, obwohl makroskopisch die Schleimhaut keine Auffälligkeiten aufwies. Bei nur 3 von den 60 Pferden konnte der histologische den makroskopischen Befund nicht bestätigen. Ätiologisch wurde, nach humanmedizinischen Beurteilungskriterien, bei 18 Pferden im Bereich der großen Kurvatur der Pars glandularis und, oder im Bereich des Pylorus eine C-Gastritis (chemische Gastritis), bei 11 Pferden eine like B-Gastritis (bakterielle Gastritis ohne den Nachweis von Helicobacter-like-Organismen), 3 Pferden eine B-Gastritis (bakterielle Gastritis mit dem Nachweis von Helicobacter-like-Organismen) und bei 9 Pferden eine Sonderform der Gastritis diagnostiziert. 6 Pferde bekamen die Diagnose: zur Zeit nicht klassifizierbar und 7 Pferde die deskriptive Diagnose erosive oder ulzerative Gastritis gestellt. 24 Pferde hatten keinen pathologischen Befund in einem der oben genannten Bereiche der Schleimhaut. Die histopathologischen Befunde der Pferde mit einer like-B-Gastritis oder einer B-Gastritis entsprachen nach humanmedizinischen Gesichtspunkten dem Bild einer Helicobacter-pylori-Gastritis beim Menschen. Bandartige Anordnung der Lymphozyten in der Lamina propria mucosae und neutrophile Granulozyten in Verbindung mit einer Atrophie des Drüsenkörpers, intestinaler Metaplasie und Erosionen. Bei drei Pferden konnte in der Warthin–Starry-Färbung und in der IHC-Reaktion Helicobacter-like-Organismen nachgewiesen werden. Die Pylorusschleimhaut war doppelt so häufig, im Vergleich zur Drüsenschleimhaut der großen Kurvatur, von einer like-B-Gastritis oder B-Gastritis betroffen. Die histologische Auswertung von Magenschleimhautbioptaten, in dieser Studie nach dem aktualisierten Sydney-System aus der Humanmedizin, komplettiert die makroskopische (endoskopische) Diagnostik. Nach den Ergebnissen der vorliegenden Studie gehört in der Pferdemedizin zu jeder Gastroskopie die Bioptatentnahme. Das aktualisierte Sydney-System kann in Zukunft in der Veterinärmedizin als Arbeitsgrundlage für die weitere wissenschaftliche Forschung genutzt werden.:Inhaltsverzeichnis Seite 1 Einleitung und Problemstellung 1 2 Literaturübersicht 2 2.1 Die makroskopische Anatomie des Pferdemagens 2 2.2 Histologie des Pferdemagens 4 2.2.1 Bau der Magenwand 4 2.2.2 Pars glandularis 4 2.2.2.1 Gemischte Kardia- und Pylorusdrüsenzone 5 2.2.2.2 Fundus- oder Eigendrüsenzone der großen Kurvatur 5 2.2.2.3 Pylorusdrüsenzone 5 2.2.3 Pars nonglandularis 6 2.2.4 Magendrüsen 6 2.2.5 Zelltypen der Magendrüsen 6 2.2.5.1 Schleimproduzierende Zellen 6 2.2.5.2 Belegzellen (Parietalzellen) 7 2.2.5.3 Hauptzellen 8 2.2.5.4 Weitere Zellen der Drüsenschleimhaut 9 2.3 Magenschleimhautbarriere und weitere Schutzmechanismen der Pars glandularis 10 2.3.1 Bicarbonat-Schleimsekret 10 2.3.2 Epitheliale Regeneration 10 2.3.3 Schleimhautdurchblutung 11 2.3.4 Prostaglandin E2 (PGE2) 11 2.3.5 Speichelproduktion und Duodenalreflux 11 2.3.6 Protein und Kalzium 12 2.3.7 Epidermaler Wachstumsfaktor (Epidermal Growth Factor, EGF) 12 2.4 Schutzmechanismen der Pars nonglandularis 13 2.5 Pathologische Veränderungen in der Schleimhaut des Pferdemagens 13 2.5.1 Makroskopische und mikroskopische Schleimhautveränderungen in der Pars glandularis und Pars nonglandularis 13 2.5.1.1 Erosionen und Ulzera (EGUS: equine gastric ulcer syndrome) 13 2.5.1.2 Desquamation und Verhornungsstörungen 14 2.5.1.3 Gastritis (Mensch und Pferd) 15 2.5.1.4 Helicobacter-like-Gastritis 16 2.5.1.4.1 Geschichte der Helicobacter-Forschung 16 2.5.1.4.2 Gastrale Helicobacterspezies 17 2.5.1.4.2.1 Helicobacter spp. beim Tier 17 2.5.1.4.2.2 Helicobacter pylori (H. pylori) 20 2.5.1.4.2.3 Infektion mit Helicobacter pylori 21 2.6 Methoden zum Nachweis von Helicobacter spp. 22 2.6.1 Histologischer Nachweis von Helicobacter pylori 22 2.6.2 Immunhistochemische Techniken (IHC) 22 2.6.3 Molekularbiologische Testmethoden 23 2.6.4 Mikrobiologischer Nachweis (Bakterienkultur) 23 2.6.5 Urease-Schnelltest 24 2.6.6 13C-Atemtest 24 2.6.7 15N-Urintest und 13C-Serumtest 24 2.6.8 Stuhl-Test 25 2.6.9 Serologie 25 2.7 Makroskopische veterinärmedizinische Klassifizierung der Magenschleimhautläsionen nach MURRAY et al. (1989) und MACALLISTER et al. (1995) 25 2.7.1 Bewertungssystem nach MURRAY et al. (1989): Grad 1-4 25 2.7.2 Bewertungssystem nach MACALLISTER et al. (1995), modifiziert nach LUNDBERG (1995): Werte I-IV 26 2.8 Histologische Gastritis-Klassifizierung nach dem aktualisierten Sydney-System aus der Humanmedizin nach STOLTE et al. 1997 26 2.8.1 Entstehung des Sydney-Systems nach STOLTE et al. 1990 (STOLTE 1997) 26 2.8.2 Das aktualisierte Sydney-System nach STOLTE et al. 1997 (STOLTE 1997) 27 2.8.2.1 Klassifikation 27 2.8.2.2 Graduierung der morphologischen Variablen im histologischen Bild 28 2.8.2.3 Zu graduierende Variable 29 2.8.2.3.1 Helicobacter pylori – Dichte 29 2.8.2.3.2 Grad der chronischen Entzündung 29 2.8.2.3.3 Graduierung der Aktivität der Gastritis 30 2.8.2.3.4 Atrophie des Drüsenkörpers 31 2.8.2.3.5 Intestinale Metaplasie 31 2.8.2.4 Andere, nicht zu graduierende Variable 33 2.8.2.4.1 Oberflächenepithel, Schleimdepletion und Erosion 33 2.8.2.4.2 Lymphfollikel 33 2.8.2.4.3 Foveoläre Hyperplasie 34 2.8.2.5 Gastritiden 34 3 Eigene Untersuchungen 37 3.1 Material und Methodik 37 3.1.1 Patientenmaterial und Anamnese 37 3.1.2 Makroskopische Befundbeschreibung des eröffneten Magens 38 3.1.3 Gewebeproben 38 3.1.3.1 Probenentnahme und Bearbeitung 38 3.1.3.2 Histologische Bearbeitung der Proben 40 3.1.3.2.1 Hämatoxylin-Eosin-Färbung 41 3.1.3.2.2 Warthin-Starry-Färbung 41 3.1.3.2.3 Immunhistochemie (IHC) 41 3.1.4 Mikroskopische Befundbeschreibung nach dem aktualisierten Sydney-System nach STOLTE et al. 1997 42 3.1.5 Nachweis von Helicobacter-like-Organismen 43 3.1.5.1 Histologischer Nachweis 43 3.1.5.2 Molekularbiologische Testmethoden 43 3.1.6 Humanmedizinische Befundbeschreibung der ätiologischen Diagnosen nach dem aktualisierten Sydney-System (STOLTE et al. 1997) 45 3.2 Ergebnisse 46 3.2.1 Makroskopische Befundbeschreibung nach MURRAY et al. 1989 und nach MACALLISTER et al. 1995 46 3.2.2 Makroskopische Befundbeschreibung nach STOLTE et al. 1993 48 3.2.3 Mikroskopische humanmedizinische Beurteilung nach STOLTE et al. 1997 51 3.2.3.1 Histologische Beurteilung nach dem humanmedizinischen aktualisierten Sydney-System (STOLTE et al. 1997) 51 3.2.3.2 Histologische Beurteilung anhand der Hämatoxylin-Eosin- Färbung (HE) nach dem aktualisierten Sydney-System aus der Humanmedizin (STOLTE et al. 1997) 53 3.2.3.3 Histologische Beurteilung anhand der Warthin-Starry-Färbung und der immunhistochemische-Reaktion nach dem aktualisierten Sydney-System aus der Humanmedizin (STOLTE et al. 1997) 65 3.2.4 Histologische Befunde in der Drüsenschleimhaut bei Pferden mit Nachweis von Helicobacter-like-Organismen 66 3.2.5 Ätiologische Diagnosen nach dem aktualisierten Sydney-System aus der Humanmedizin (STOLTE et al. 1997) 76 3.2.6 Zusammenhang der makroskopischen und mikroskopischen Befunde 77 3.3 Ergebnisse der PCR 78 4 Diskussion 79 4.1 Methodik und Durchführung 79 4.2 Makroskopische Befunde 82 4.3 Mikroskopische Befunde 85 4.4 Helicobacter-like-Organismen, Häufigkeit, Lokalisation und Kolonisationsdichte 88 4.5 Einfluss der Besiedlung mit Helicobacter-like-Organismen auf die Gastritis und deren Behandlung 92 4.6 Ätiologische und deskriptive Diagnosen nach humanmedizinischen Kriterien 92 4.7 Veterinärmedizinische makroskopische Bewertungssysteme 95 4.8 Das humanmedizinische aktualisierte Sydney-System nach STOLTE et al. 1997 96 5 Zusammenfassung 99 6 Summary 101 7 Literaturverzeichnis 103 8 Anhänge 121 8.1 Anamneseprotokoll 121 8.1.1 Lebensalter, Geschlecht und Rasse der 60 Pferde 123 8.1.2 Klinische Diagnosen der 60 Pferde 125 8.1.3 Anamnese der 60 Pferde 128 8.2 Makroskopische Befundbeschreibung des eröffneten Magens nach STOLTE et al. (1993) 134 8.3 Makroskopische Klassifikation nach MURRAY et al. (1989) 136 8.4 Makroskopische Klassifikation nach MACALLISTER et al. (1995) modifiziert nach LUNDBERG (1995) 137 8.5 Makroskopische Beurteilung (Grading) 139 8.6 Graduierung nach dem aktualisierten Sydney-System STOLTE et al. (1997), im Vergleich dazu die makroskopische Beurteilung der Pars glandularis nach MACALLISTER et al. (1995) 141 8.7 Ätiologische oder deskriptive Diagnosen der 60 Pferde in der Pars glandularis der großen Kurvatur und dem Pylorus 146 9 Danksagungen 147 / Stolte’s updated Sydney system is used in the field of human medicine for grading the gastric mucosa (STOLTE 1997). The goal of this study was to determine whether this system could also be applied for histological parameter grading in veterinary medicine, in order to gain new insights into medications for treating equine gastric mucosa. Post mortem biopsies of mucosa were taken from 60 equines along the greater curve and pylorus of the pars glandularis. The test animals were divided into four groups: 10 post-colic surgery equines, 36 with colic and an infaust prognosis, six with chronic EGUS (equine gastric ulcer syndrome), and eight equines not euthanized for reasons other than colic. Macroscopic grading of the 60 equine stomachs was performed in accordance with MURRAY et al. (1989) and MACALLISTER et al. (1995). In human medicine, histological scoring is based on the following five parameters: density of Helicobacter-like organisms, grade of the chronic inflammation, level of gastric activity, atrophy, and intestinal metaplasia. A total of 120 biopsies taken from the 60 equines were graded according to these parameters. Etiologic diagnoses for humans are the outcome of decades of research, but the etiology of equine gastritis lacks an equivalent foundation. Equines exhibit forms of gastritis similar to those in humans, but their morphology cannot be classified into any specific etiology. In this study, the etiological diagnoses were based on human diagnostics, but their validity for equines has yet to be substantiated. Of the 60 equine stomachs examined, 31 showed lesions in the gastric mucosa, while 20 of those with changes had lesions in the pars glandularis. Histological findings of 44 equines confirmed the macroscopic grading according to the updated Sydney system. Thirteen equines exhibited pathological findings based on the updated Sydney system histology, although no abnormalities were discovered in the macroscopic examination. The histological diagnosis did not confirm the macroscopic grading for only three of the 60 subjects. The following etiological findings were reached in terms of human medicine: 18 equines with type C gastritis (chemical gastritis) along the greater curve of the pars glandularis and/or pylorus, 11 equines with type B-like gastritis (bacterial gastritis without evidence of H-like organisms), three equines with type B gastritis (bacterial gastritis with evidence of H-like organisms), and nine with a special form of gastritis. Six of the equines could not be classified, while seven showed erosive gastritis or ulceration. A total of 24 equines exhibited no pathological findings along any of the above-mentioned mucosae. The histopathological findings of the equines with either type B-like gastritis or type B gastritis corresponded with H pylori gastritis seen in humans, as ligamental lymphocytes in the lamina propria mucosae and neutrophilic granulocytes associated with atrophy of the glandular corpus, intestinal metaplasia, and erosion. Warthin-Starry staining and the IHC reaction confirmed H-like organisms in three of the equines. The frequency of type B-like gastritis or type B gastritis was observed to be twice as high in the pylorus mucosa as along the glandular mucosa of the greater curve. This study has demonstrated that histological analysis of gastric mucosa biopsies graded according to the updated Sydney system for human medicine significantly complements veterinary gastroscopy, which should therefore always include a biopsy. The updated Sydney system can thus serve as a platform for future scientific research in the field of veterinary medicine.:Inhaltsverzeichnis Seite 1 Einleitung und Problemstellung 1 2 Literaturübersicht 2 2.1 Die makroskopische Anatomie des Pferdemagens 2 2.2 Histologie des Pferdemagens 4 2.2.1 Bau der Magenwand 4 2.2.2 Pars glandularis 4 2.2.2.1 Gemischte Kardia- und Pylorusdrüsenzone 5 2.2.2.2 Fundus- oder Eigendrüsenzone der großen Kurvatur 5 2.2.2.3 Pylorusdrüsenzone 5 2.2.3 Pars nonglandularis 6 2.2.4 Magendrüsen 6 2.2.5 Zelltypen der Magendrüsen 6 2.2.5.1 Schleimproduzierende Zellen 6 2.2.5.2 Belegzellen (Parietalzellen) 7 2.2.5.3 Hauptzellen 8 2.2.5.4 Weitere Zellen der Drüsenschleimhaut 9 2.3 Magenschleimhautbarriere und weitere Schutzmechanismen der Pars glandularis 10 2.3.1 Bicarbonat-Schleimsekret 10 2.3.2 Epitheliale Regeneration 10 2.3.3 Schleimhautdurchblutung 11 2.3.4 Prostaglandin E2 (PGE2) 11 2.3.5 Speichelproduktion und Duodenalreflux 11 2.3.6 Protein und Kalzium 12 2.3.7 Epidermaler Wachstumsfaktor (Epidermal Growth Factor, EGF) 12 2.4 Schutzmechanismen der Pars nonglandularis 13 2.5 Pathologische Veränderungen in der Schleimhaut des Pferdemagens 13 2.5.1 Makroskopische und mikroskopische Schleimhautveränderungen in der Pars glandularis und Pars nonglandularis 13 2.5.1.1 Erosionen und Ulzera (EGUS: equine gastric ulcer syndrome) 13 2.5.1.2 Desquamation und Verhornungsstörungen 14 2.5.1.3 Gastritis (Mensch und Pferd) 15 2.5.1.4 Helicobacter-like-Gastritis 16 2.5.1.4.1 Geschichte der Helicobacter-Forschung 16 2.5.1.4.2 Gastrale Helicobacterspezies 17 2.5.1.4.2.1 Helicobacter spp. beim Tier 17 2.5.1.4.2.2 Helicobacter pylori (H. pylori) 20 2.5.1.4.2.3 Infektion mit Helicobacter pylori 21 2.6 Methoden zum Nachweis von Helicobacter spp. 22 2.6.1 Histologischer Nachweis von Helicobacter pylori 22 2.6.2 Immunhistochemische Techniken (IHC) 22 2.6.3 Molekularbiologische Testmethoden 23 2.6.4 Mikrobiologischer Nachweis (Bakterienkultur) 23 2.6.5 Urease-Schnelltest 24 2.6.6 13C-Atemtest 24 2.6.7 15N-Urintest und 13C-Serumtest 24 2.6.8 Stuhl-Test 25 2.6.9 Serologie 25 2.7 Makroskopische veterinärmedizinische Klassifizierung der Magenschleimhautläsionen nach MURRAY et al. (1989) und MACALLISTER et al. (1995) 25 2.7.1 Bewertungssystem nach MURRAY et al. (1989): Grad 1-4 25 2.7.2 Bewertungssystem nach MACALLISTER et al. (1995), modifiziert nach LUNDBERG (1995): Werte I-IV 26 2.8 Histologische Gastritis-Klassifizierung nach dem aktualisierten Sydney-System aus der Humanmedizin nach STOLTE et al. 1997 26 2.8.1 Entstehung des Sydney-Systems nach STOLTE et al. 1990 (STOLTE 1997) 26 2.8.2 Das aktualisierte Sydney-System nach STOLTE et al. 1997 (STOLTE 1997) 27 2.8.2.1 Klassifikation 27 2.8.2.2 Graduierung der morphologischen Variablen im histologischen Bild 28 2.8.2.3 Zu graduierende Variable 29 2.8.2.3.1 Helicobacter pylori – Dichte 29 2.8.2.3.2 Grad der chronischen Entzündung 29 2.8.2.3.3 Graduierung der Aktivität der Gastritis 30 2.8.2.3.4 Atrophie des Drüsenkörpers 31 2.8.2.3.5 Intestinale Metaplasie 31 2.8.2.4 Andere, nicht zu graduierende Variable 33 2.8.2.4.1 Oberflächenepithel, Schleimdepletion und Erosion 33 2.8.2.4.2 Lymphfollikel 33 2.8.2.4.3 Foveoläre Hyperplasie 34 2.8.2.5 Gastritiden 34 3 Eigene Untersuchungen 37 3.1 Material und Methodik 37 3.1.1 Patientenmaterial und Anamnese 37 3.1.2 Makroskopische Befundbeschreibung des eröffneten Magens 38 3.1.3 Gewebeproben 38 3.1.3.1 Probenentnahme und Bearbeitung 38 3.1.3.2 Histologische Bearbeitung der Proben 40 3.1.3.2.1 Hämatoxylin-Eosin-Färbung 41 3.1.3.2.2 Warthin-Starry-Färbung 41 3.1.3.2.3 Immunhistochemie (IHC) 41 3.1.4 Mikroskopische Befundbeschreibung nach dem aktualisierten Sydney-System nach STOLTE et al. 1997 42 3.1.5 Nachweis von Helicobacter-like-Organismen 43 3.1.5.1 Histologischer Nachweis 43 3.1.5.2 Molekularbiologische Testmethoden 43 3.1.6 Humanmedizinische Befundbeschreibung der ätiologischen Diagnosen nach dem aktualisierten Sydney-System (STOLTE et al. 1997) 45 3.2 Ergebnisse 46 3.2.1 Makroskopische Befundbeschreibung nach MURRAY et al. 1989 und nach MACALLISTER et al. 1995 46 3.2.2 Makroskopische Befundbeschreibung nach STOLTE et al. 1993 48 3.2.3 Mikroskopische humanmedizinische Beurteilung nach STOLTE et al. 1997 51 3.2.3.1 Histologische Beurteilung nach dem humanmedizinischen aktualisierten Sydney-System (STOLTE et al. 1997) 51 3.2.3.2 Histologische Beurteilung anhand der Hämatoxylin-Eosin- Färbung (HE) nach dem aktualisierten Sydney-System aus der Humanmedizin (STOLTE et al. 1997) 53 3.2.3.3 Histologische Beurteilung anhand der Warthin-Starry-Färbung und der immunhistochemische-Reaktion nach dem aktualisierten Sydney-System aus der Humanmedizin (STOLTE et al. 1997) 65 3.2.4 Histologische Befunde in der Drüsenschleimhaut bei Pferden mit Nachweis von Helicobacter-like-Organismen 66 3.2.5 Ätiologische Diagnosen nach dem aktualisierten Sydney-System aus der Humanmedizin (STOLTE et al. 1997) 76 3.2.6 Zusammenhang der makroskopischen und mikroskopischen Befunde 77 3.3 Ergebnisse der PCR 78 4 Diskussion 79 4.1 Methodik und Durchführung 79 4.2 Makroskopische Befunde 82 4.3 Mikroskopische Befunde 85 4.4 Helicobacter-like-Organismen, Häufigkeit, Lokalisation und Kolonisationsdichte 88 4.5 Einfluss der Besiedlung mit Helicobacter-like-Organismen auf die Gastritis und deren Behandlung 92 4.6 Ätiologische und deskriptive Diagnosen nach humanmedizinischen Kriterien 92 4.7 Veterinärmedizinische makroskopische Bewertungssysteme 95 4.8 Das humanmedizinische aktualisierte Sydney-System nach STOLTE et al. 1997 96 5 Zusammenfassung 99 6 Summary 101 7 Literaturverzeichnis 103 8 Anhänge 121 8.1 Anamneseprotokoll 121 8.1.1 Lebensalter, Geschlecht und Rasse der 60 Pferde 123 8.1.2 Klinische Diagnosen der 60 Pferde 125 8.1.3 Anamnese der 60 Pferde 128 8.2 Makroskopische Befundbeschreibung des eröffneten Magens nach STOLTE et al. (1993) 134 8.3 Makroskopische Klassifikation nach MURRAY et al. (1989) 136 8.4 Makroskopische Klassifikation nach MACALLISTER et al. (1995) modifiziert nach LUNDBERG (1995) 137 8.5 Makroskopische Beurteilung (Grading) 139 8.6 Graduierung nach dem aktualisierten Sydney-System STOLTE et al. (1997), im Vergleich dazu die makroskopische Beurteilung der Pars glandularis nach MACALLISTER et al. (1995) 141 8.7 Ätiologische oder deskriptive Diagnosen der 60 Pferde in der Pars glandularis der großen Kurvatur und dem Pylorus 146 9 Danksagungen 147

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En esta Tesis se estudia el posible papel de las FLA como reservorio de H. pylori y otras bacterias patógenas en aguas y alimentos mediante técnicas moleculares. En primer lugar se realizó un ensayo de cocultivo entre la bacteria H. pylori y la ameba Acanthamoeba castellanii. Se comprobó, mediante técnicas moleculares específicas para la detección de células viables, PMA-qPCR y DVC-FISH, que la ameba es capaz de internalizar a la bacteria y que esta última permanece viable, demostrando que H. pylori se comporta como una bacteria ARB. Seguidamente, se analizaron un total de 120 muestras ambientales, 100 de agua y 20 de vegetales para comprobar la presencia, tanto de FLA como de H. pylori internalizado en estas FLA. En el caso de las muestras de agua, se analizaron 69 muestras de agua residual y 31 de agua potable. Un total de 55 (79,7%) muestras de agua residual y 12 (38,7%) de agua potable resultaron positivas para la presencia de FLA. Mediante la técnica PMA-qPCR se demostró la presencia de H. pylori internalizado en las FLA presentes en 28 (50,9%) y 11 (91,7%) de las muestras de agua residual y potable analizadas, respectivamente. Mediante DVC-FISH se demostró que las células de H. pylori internalizadas dentro de las FLA presentes en las muestras eran viables en 16 (29,5%) y 5 (41,7%) de las muestras de agua residual y potable analizadas, respectivamente. Además, se consiguió recuperar formas viables cultivables de H. pylori procedente del interior de FLA en 10 (18,2%) de las muestras de agua residual analizadas. Las FLA aisladas e identificadas en las aguas residuales pertenecieron a los géneros Acanthamoeba, Naegleria, Vanellidae y a la familia Vahlkampfiidae. En el caso del agua potable, las FLA aisladas e identificadas pertenecieron a los géneros Acanthamoeba, Echinamoeba y Vermamoeba. En el caso de las muestras de vegetales, concretamente lechugas, todas ellas resultaron positivas para el aislamiento de FLA (100%). Mediante la técnica PMA-qPCR se demostró la presencia de H. pylori internalizado en las FLA en 11 (55,0%) de las muestras y, mediante DVC-FISH, se demostró que las células de H. pylori internalizadas dentro de las FLA eran viables en 5 (25,0%) de las muestras. En este caso no se recuperaron formas viables cultivables de la bacteria. Finalmente, mediante metagenómica de secuenciación dirigida, se analizó el microbioma de las FLA presentes en 20 de las muestras analizadas en esta Tesis (11 de agua residual, 3 de agua potable y 6 de lechugas). Para ello, se eligieron los iniciadores, se evaluaron in silico e in vitro y, una vez comprobada su idoneidad, se emplearon para la secuenciación de las muestras. En los tres tipos de muestras, la clase bacteriana más abundante fue la Gammaproteobacteria. Para los tres tipos de muestras, los filos más abundantes de las bacterias del microbioma de las FLA fueron Proteobacteria y Bacteroidetes y, en el caso del agua residual, también lo fue el filo Planctomycetes. H. pylori se detectó mediante esta técnica en los tres tipos de muestra. Además, como parte del microbioma de FLA de muestras ambientales, se detectaron otras bacterias de interés para la salud pública, tales como Aeromonas, Legionella, Mycobaterium o Pseudomonas. Los resultados obtenidos en esta Tesis demuestran la presencia de FLA patógenas en las muestras ambientales, así como el hecho de que, en algunos casos, estas son transportadoras de bacterias patógenas. Este trabajo también confirma que H. pylori se comporta como una bacteria ARB y que se encuentra viable en el interior de FLA presentes, tanto en aguas residuales y potables como en vegetales. De esta forma, se postula que un modo de transmisión de esta bacteria podría ser a través de las FLA presentes en agua o vegetales. / In this Thesis, the possible role of FLA is studied as a reservoir of H. pylori and other pathogenic bacteria in waters and food by means of molecular techniques. Firstly, a coculture assay between the bacterium H. pylori and the amoeba Acanthamoeba castellanii was carried out. It was verified by means of molecular techniques specific for the detection of viable cells, PMA-qPCR and DVC-FISH, that the amoeba is capable of internalizing the bacterium and that the latter remains viable, demonstrating that H. pylori behaves as an ARB bacterium. Afterwards, a total of 120 environmental samples, 100 of water and 20 of vegetables, were analyzed to verify the presence FLA as well as internalized H. pylori into these FLA. In case of water samples, 69 samples of wastewater and 31 samples of drinking water were analyzed. A total of 55 (79,7 %) wastewater and 12 (38,7 %) of drinking water samples turned out to be positive for FLA's presence. By means of PMA-qPCR technique, the presence of FLA-internalized H. pylori was demonstrated in 28 (50,9 %) and 11 (91,7 %) of the wastewater and drinking water samples analyzed, respectively. By means of DVC-FISH it was demonstrated that the FLA-internalized H. pylori cells were viable in 16 (29,5 %) and 5 (41,7 %) of the wastewater and drinking water samples analyzed, respectively. In addition, viable cultivable forms of H. pylori coming from the inside of FLA were recovered from 10 (18,2 %) of the analyzed wastewater samples. The isolated and identified FLA from wastewater samples belonged to the genus Acanthamoeba, Naegleria, Vanellidae and to the family Vahlkampfiidae. In the case of drinking wáter, the isolated and identified FLA belonged to the genus Acanthamoeba, Echinamoeba and Vermamoeba. In the case of the vegetable samples, specifically lettuces, all of them turned out to be positive for FLA's isolation (100 %). By means of the PMA-qPCR technique, the presence of FLA-internalized H. pylori was demonstrated in 11 (55,0 %) of the samples and, by means of DVC-FISH, it was demonstrated that FLA-internalized H. pylori cells were viable in 5 (25,0 %) of the samples. In this case, viable cultivable forms of the bacterium could not be recovered. Finally, by means of amplicon-based metagenomics, the FLA microbiome of 20 previously analyzed samples in this Thesis (11 wastewater, 3 drinking water and 6 lettuce samples) was analyzed. To do so, a pair of primers were selected and evaluated in silco and in vitro and, once checked its suitability, they were used to perform the samples' sequencing. In the three types of samples, the most abundant bacterial class was the Gammaproteobacteria. For the three types of samples, the most abundant bacterial phylum of the FLA microbiome were Proteobacteria and Bacteroidetes and, in case of the wastewater, it was also the phylum Planctomycetes. H. pylori was detected by means of this technology in the three types of samples. In addition, as part of FLA's microbiome of environmental samples, other bacteria of public health interest were detected, such as Aeromonas, Legionella, Mycobacterium or Pseudomonas. The results obtained in this Thesis demonstrate the presence of pathogenic FLA in the environmental samples, as well as the fact that, in some cases, these they are carriers of pathogenic bacteria. This work also confirms that H. pylori behaves as an ARB bacterium and that it is viable inside the present FLA in wastewater as well as in drinking water and in vegetables. This way, it is postulated that a way of transmission of this bacterium might be through the FLA present in water or vegetables. / En esta Tesi s'estudia el possible paper de les FLA com a reservori de H. pylori i altres bacteris patògens en aigües i aliments per mitjà de tècniques moleculars. En primer lloc es va realitzar un assaig de cocultiu entre el bacteri H. pylori i l'ameba Acanthamoeba castellanii. Es va comprovar per mitjà de tècniques moleculars específiques per a la detecció de cèl¿lules viables, PMA-qPCR i DVC-FISH, que l'ameba és capaç d'internalizar al bacteri i que esta última roman viable, demostrant que H. pylori es comporta com un bacteri ARB. A continuació, es van analitzar un total de 120 mostres ambientals, 100 d'aigua i 20 de vegetals per a comprovar la presència tant de FLA com de H. pylori internalitzat en estes FLA. En el cas de les mostres d'aigua, es van analitzar 69 mostres d'aigua residual i 31 d'aigua potable. Un total de 55 (79,7%) mostres d'aigua residual i 12 (38,7%) d'aigua potable van resultar positives per a la presència de FLA. Per mitjà de la tècnica PMA-qPCR es va demostrar la presència d'H. pylori internalitzat en les FLA presents en 28 (50,9%) i 11 (91,7%) de les mostres d'aigua residual i potable analitzades, respectivament. Per mitjà de DVC-FISH es va demostrar que les cèl¿lules d'H. pylori internalitzades dins les FLA presents en les mostres eren viables en 16 (29,5%) i 5 (41,7%) de les mostres d'aigua residual i potable analitzades, respectivament. A més, es va aconseguir recuperar formes viables cultivables d'H. pylori procedent de l'interior de FLA en 10 (18,2%) de les mostres d'aigua residual analitzades. Les FLA aïllades i identificades en les aigües residuals van pertànyer als gèneres Acanthamoeba, Naegleria, Vanellidae i a la família Vahlkampfiidae. En el cas de l'aigua potable, les FLA aïllades i identificades van pertànyer als gèneres Acanthamoeba, Echinamoeba i Vermamoeba. En el cas de les mostres de vegetals, concretament encisams, totes elles van resultar positives per a l'aïllament de FLA (100%). Per mitjà de la tècnica PMA-qPCR es va demostrar la presència d'H. pylori internalitzat en les FLA en 11 (55,0%) de les mostres i, per mitjà de DVC-FISH, es va demostrar que les cèl¿lules d'H. pylori internalitzades dins les FLA eren viables en 5 (25,0%) de les mostres. En este cas no es van recuperar formes viables cultivables del bacteri. Finalment, per mitjà de metagenómica de seqüenciació dirigida, es va analitzar el microbioma de les FLA presents en 20 de les mostres analitzades en esta Tesi (11 d'aigua residual, 3 d'aigua potable i 6 d'encisams). Per tal de fer això, es van triar els iniciadors, es van avaluar in silico i in vitro i, una vegada comprovada la seua idoneïtat, es van emprar per a la seqüenciació de les mostres. En els tres tipus de mostres, la classe bacteriana més abundant va ser la Gammaproteobacteria. Per als tres tipus de mostres, els filos més abundants dels bacteris del microbioma de les FLA van ser Proteobacteria i Bacteroidetes i, en el cas de l'aigua residual, també ho va ser el filo Planctomycetes. H. pylori es va detectar per mitjà d'esta tècnica en els tres tipus de mostra. A més, com a part del microbioma de FLA de mostres ambientals, es van detectar altres bacteris d'interés per a la salut pública, com ara Aeromonas, Legionella, Mycobaterium o Pseudomonas. Els resultats obtinguts en esta Tesi demostren la presència de FLA patògenes en les mostres ambientals, així com el fet de que, en alguns casos, estes són transportadores de bacteris patògens. Este treball també confirma que H. pylori es comporta com un bacteri ARB i que es troba viable en l'interior de FLA presents, tant en aigües residuals i potables com en vegetals. D'esta manera, es postula que una manera de transmissió d'este bacteri podria ser a través de les FLA presents en aigua o vegetals. / Moreno Mesonero, L. (2018). Estudio del papel de las amebas de vida libre como reservorio de Helicobacter pylori y otras bacterias patógenas en aguas y alimentos mediante técnicas moleculares [Tesis doctoral]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/111952

Infectious diseases caused by bacteria, fungi, viruses and parasites have affected humans historically. Infectious diseases remain a major cause of premature death and a public health concern globally with increased mortality and significant economic burden. Unvaccinated individuals, people with suppressed and compromised immune systems are at higher risk of suffering from infectious diseases. In spite of significant advancements in infectious diseases research, the control or treatment process faces challenges. The mucosal immune system plays a crucial role in safeguarding the body from harmful pathogens, while being constantly exposed to the environment. To develop treatment options for infectious diseases, it is vital to understand the immune responses that occur during infection. The two infectious diseases presented here are: i) Helicobacter pylori infection and ii) human immunodeficiency (HIV) and human papillomavirus (HPV) co-infection. H pylori, is a bacterium that colonizes the stomach and causes gastric cancer in 1-2% but is beneficial for protection against allergies and gastroesophageal diseases. An estimated 85% of H pylori colonized individuals show no detrimental effects. HIV is a virus that causes AIDS, one of the deadliest and most persistent epidemics. HIV-infected patients are at an increased risk of co-infection with HPV, and report an increased incidence of oral cancer. The goal of this thesis is to elucidate the host immune responses in infectious diseases via the use of computational and mathematical models. First, the thesis reviews the need for computational and mathematical models to study the immune responses in the course of infectious diseases. Second, it presents a novel sensitivity analysis method that identifies important parameters in a hybrid (agent-based/equation-based) model of H. pylori infection. Third, it introduces a novel model representing the HIV/HPV coinfection and compares the simulation results with a clinical study. Fourth, it discusses the need of advanced modeling technologies to achieve a personalized systems wide approach and the challenges that can be encountered in the process. Taken together, the work in this dissertation presents modeling approaches that could lead to the identification of host immune factors in infectious diseases in a predictive and more resource-efficient manner. / Doctor of Philosophy / Infectious diseases caused by bacteria, fungi, viruses and parasites have affected humans historically. Infectious diseases remain a major cause of premature death and a public health concern globally with increased mortality and significant economic burden. These infections can occur either via air, travel to at-risk places, direct person-to-person contact with an infected individual or through water or fecal route. Unvaccinated individuals, individuals with suppressed and compromised immune system such as that in HIV carriers are at higher risk of getting infectious diseases. In spite of significant advancements in infectious diseases research, the control and treatment of these diseases faces numerous challenges. The mucosal immune system plays a crucial role in safeguarding the body from harmful pathogens, while being exposed to the environment, mainly food antigens. To develop treatment options for infectious diseases, it is vital to understand the immune responses that occur during infection. In this work, we focus on gut immune system that acts like an ecosystem comprising of trillions of interacting cells and molecules, including membars of the microbiome. The goal of this dissertation is to develop computational models that can simulate host immune responses in two infectious diseases- i) Helicobacter pylori infection and ii) human immunodeficiency virus (HIV)-human papilloma virus (HPV) co-infection. Firstly, it reviews the various mathematical techniques and systems biology based methods. Second, it introduces a "hybrid" model that combines different mathematical and statistical approaches to study H. pylori infection. Third, it highlights the development of a novel HIV/HPV coinfection model and compares the results from a clinical trial study. Fourth, it discusses the challenges that can be encountered in adapting machine learning based computational technologies. Taken together, the work in this dissertation presents modeling approaches that could lead to the identification of host immune factors in infectious diseases in a predictive and more resourceful way.

Les facteurs de transcription NikR et FUR sont impliqués dans l'homéostasie des métaux. Les propriétés de métallation et de liaison à l'ADN de NikR d'E.coli (Ec) et d'H.pylori (Hp) ont été comparées. EcNikR, protéine tétramérique, lie 8 nickels par sous unité dont un nickel dans un site dit de haute affinité ayant un Kd submicromolaire. Les autres sites métalliques, de plus basse affinité, sont impliqués dans le processus l'agrégation Ni- et pH-dépendant. HpNikR, partage des propriétés de métallation avec EcNikR, dont la liaison possible de différents métaux dans son site de haute affinité (Cu(II), Ni(II), Co(II)). Les 4 sites de haute affinité de cette protéine semblent égaux 2 à 2. La métallation des premiers sites faciliterait une « fermeture de la protéine » permettant la métallation des deux derniers sites. La métallation de ces 4 sites semble suffire pour qu'HpNikR puisse lier l'ADN.<br />Cependant cette liaison serait améliorée en présence d'un métal stabilisateur dans d'autres sites. Selon les séquences opératrices, le métal et la technique employée, l‘affinité d'HpNikR métallée pour l'ADN varie. En présence d'un excès de Ni(II), HpNikR se lie à pureA et à pnixA avec un Kd de 2,5 et 1,7 nM mais se lie faiblement à pnikR et pexbB. En présence d'un excès de Ni(II) puis de Mn(II), HpNikR se lie à pnikR et à pexbB avec un Kd de 38 et 24 nM. FUR d'H.pylori (HpFUR), un métallorégulateur Fe dépendant, a aussi été caractérisé dans le but d'étudier sa co-régulation avec HpNikR de la région intergénique nikR-exbB. HpFUR est dimérique et contient au moins deux sites métalliques : un site structural et un site de régulation permettant l'activation pour la liaison à l'ADN.