O manganês (Mn) é um elemento químico abundante na natureza, principalmente em minérios e presente também em alimentos e na água. É o cofator de enzimas importantes, como a superóxido dismutase mitocondrial. Entretanto, mineradores e outras pessoas expostas a produtos manufaturados de Mn podem apresentar uma concentração excessiva desse metal no cérebro, adquirindo uma desordem neurológica similar ao mal de Parkinson conhecida por manganismo. Basicamente a neurotoxicidade do Mn pode estar associada com os vários estados de oxidação que ele pode alcançar, gerando espécies reativas de oxigênio durante a interconversão dessas espécies. Dessa forma, neste trabalho sintetizamos e avaliamos as propriedades pró-oxidantes e neurotóxicas de complexos de Mn(III) com desferrioxamina, [Mn(dfb)]; acetohidroxamato, [Mn(aha)3]; citrato, [Mn(cit)]; cloro-salen, EUK 8; e aceto-salen, EUK 108. Tais compostos são propostos como miméticos da SOD e/ou catalase, entretanto podem apresentar atividade pró-oxidante. Estes complexos foram caracterizados espectrofotometricamente (UV/Vis e IV) e por voltametria cíclica. Foram determinadas as absortividades molares dos complexos [Mn(aha)3], EUK 8 e EUK 108. Os EUK\'s apresentaram dois processos redutivos, sendo apenas um reversível, enquanto o [Mn(cit)] apresentou apenas um processo redutivo reversível e os hidroxamatos [Mn(dfb)] e [Mn(aha)3] não apresentaram processos redox na faixa de potenciais utilizada. Em teste de lipofilicidade todos os complexos apresentaram maior afinidade pela fase aquosa, sendo muito pouco particionados para a fase orgânica. Através do ensaio de supressão de fluorescência de calceína foi possível estabelecer que os EUK\'s são relativamente mais estáveis do que os outros complexos, sendo o [Mn(aha)3] o menos estável dos compostos estudados. Nas análises de atividade pró-oxidante, o [Mn(dfb)] oxidou fortemente a sonda mesmo na ausência de outros cofatores, mas este processo é dependente da concentração de O2 no meio. Os EUK\'s atuaram como pró-oxidantes em função da concentração de peróxido no meio. A atividade pró-oxidante foi suprimida por ascorbato, glutationa e Trolox®, que agiram como antioxidantes, sugerindo implicações para a terapia do manganismo. O teste de toxicidade aguda em paulistinhas (Danio rerio) adultos resultou na mortalidade de alguns animais quando expostos a [Mn(dfb)] e [Mn(aha)3]. Comparando o telencéfalo de peixes expostos ao [Mn(dfb)] com um controle em microscópio, não se visualizou nenhuma alteração morfológica na região do núcleo dorsal, indicando que o complexo não causou nenhum dano visível nessa região. / Manganese (Mn) is an abundant element which is present also in food and water. It is the cofactor of important enzymes such as mitochondrial superoxide dismutase. However, miners and other occupationally exposed individuals may present an excessive load of Mn in brain and develop manganism, a neurological disorder akin to Parkinson Disease. Basically, Mn neurotoxicity may stem from its wide redox cycle, generating reactive oxygen species in the process of converting from one oxidation state to another. Thus, in this work we synthesized and evaluated the pro-oxidant and neurotoxic characteristics of Mn(III) complexes with desferrioxamine, [Mn(dfb)]; acetohydroxamate, [Mn(aha)3]; citrate, [Mn(cit)]; chlorosalen, EUK 8; and aceto-salen, EUK 108. Such compounds are proposed as mimetics of superoxide dismutase and/or catalase, however they may also be prooxidant. These complexes were characterized spectrophotometrically (UV/Vis and IR) and by cyclic voltammetry. Molar absorptivities were determined for [Mn(aha)3], EUK 8 and EUK 108. EUK\'s displayed two reductive processes, only one of which was reversible, while [Mn(cit)] displayed only one (reversible) reductive process and hydroxamates [Mn(dfb)] and [Mn(aha)3] did not display redox processes in the working range of potentials. Lipophilicity tests showed that all complexes have very low partition to the organic phase. Calcein fluorescence quenching studies showed that both EUK complexes are relatively more stable than the others, while [Mn(aha)3] is the least stable. In the pro-oxidant activity studies, [Mn(dfb)] strongly oxidized the fluorescent probe even in the absence of ancillary substances such as peroxide. However, this effect was dependant on O2 saturation in the solution. Both EUK acted as pro-oxidants with a linear dependence on peroxide concentration. Pro-oxidant activity was eliminated by the treatment with antioxidants such as ascorbate, glutathione and Trolox®, which is of interest for the therapy of manganism. In the acute toxicity tests induced some mortality in adult Danio rerio exposed to [Mn(dfb)] or [Mn(aha)3]. Comparison of the telencephalus of [Mn(dfb)]-exposed individuals with controls failed to indicate morphological alterations in the dorsal nucleus area, indicating that the complex did not affect visibly this brain region.

En France, le tritium est principalement rejeté sous forme d’eau tritiée (HTO) par les centres de production d’électricité et les centres de traitement des combustibles en fonctionnement normal. Les effets développementaux et reprotoxiques du tritium ont été étudiés. Cependant, peu d’études portent sur les effets moléculaires. Dans ce contexte, l’objectif de cette thèse est d’évaluer les effets de l’HTO sur les stades embryo-larvaire du poisson zèbre (Danio rerio). Deux débits de dose, 0,4 et 4 mGy/h, ont été testés. Un protocole pour la mesure de l’activité dans les organismes a été mis au point. Il a permis (i) de confirmer que l’internalisation de l’HTO est rapide, (ii) la discrimination des formes de tritium libre dans les tissues et lié à la matière organique, et (iii) le calcul de la dose permettant de relier les effets observés à une dose reçue. Les effets de l’HTO ont été évalués à différents niveaux d’organisation biologique. A l’échelle moléculaire, une analyse transcriptomique (mRNAseq) a montré la modulation de gènes impliqués dans la contraction musculaire et le développement de l’œil à 24hpf ainsi que dans le cycle circadien et la réponse au stress oxydant à 96hpf. Une modulation de gènes impliqués dans la réparation des dommages à l’ADN a été montrée. A des niveaux d’organisation supérieurs, quelques altérations des fibres musculaires ont été observées pour les deux débits de dose. Une diminution de la vitesse de nage a été montrée à 96 hpf après exposition à 0,4 mGy/h. Ces travaux ont permis de mieux appréhender l’internalisation du tritium, de caractériser la dose absorbée dans les organismes et de mieux comprendre les effets du tritium / In France, tritium is mainly released as tritiated water (HTO) by nuclear power plants and nuclear reprocessing plants. The developmental and reprotoxic effects of tritium have already been studied. However, few studies focus on molecular effects. In this context, the aim of this thesis is to evaluate the effects of HTO on the embryo-larvae stages of the zebrafish (Danio rerio). Two dose rates, 0.4 and 4 mGy/h, were tested. A protocol for the measurement of activity in organisms was developed. It has (i) confirmed that the internalization of HTO is rapid, (ii) allowed the discrimination of the tissue-free-water-tritum and organically bound tritium forms, and (iii) allowed the calculation of the dose permitting to link the observed effects to a received dose. The effects of HTO were evaluated at different biological levels. At the molecular level, a transcriptomic analysis (mRNAseq) showed the modulation of genes involved in muscle contraction and eye development at 24hpf, as well as in the circadian rythm and the response to oxidative stress at 96hpf. Modulation of genes involved in the DNA damage repair was shown. At higher levels of organization, some alterations of muscle fibers were observed for both dose rates. A decrease in swimming velocity was shown at 96 hpf after exposure to 0.4 mGy/h. This work allowed a better understanding of the tritium internalization, to characterize the absorbed dose in organisms and to better understand the effects of tritium

Tendo em vista a multiplicidade das ações causada pela interação dos agentes químicos com possíveis danos a biota pelos efluentes, a estratégia mais eficiente é o uso integrado de análises físicas, químicas e ecotóxicológicas para avaliação e previsão do risco ambiental. Nesse sentido, ensaios ecotoxicológicos são importantes meios de monitoramento ambiental a fim de se preservar o meio aquático. Um dos objetivos principais do trabalho foi implementar o método de ensaio com Daphnia similis de acordo com a ABNT NBR 12713: 2009. Além disso, objetivou-se avaliar a sensibilidade relativa de dois organismos-testes (Daphnia similis e Danio rerio) a efluentes de diversas indústrias tais como: alimentícia, bebidas, farmacêutica, papel, petroquímica, efluente proveniente de decapagem de metais, e chorume proveniente de três aterros diferentes (São Paulo, Rio de Janeiro e Rio Grande do Sul) avaliando os resultados físico-químicos e os limites das legislações vigentes no Rio de Janeiro (NT 213, NT 202 e DZ 205). Dessa forma, pretende-se observar se os limites estabelecidos são suficientes para não conferir ecotoxicidade aguda ao corpo hídrico. Os efluentes tratados da indústria alimentícia, de bebidas, de papel e farmacêutica não apresentaram ecotoxicidade aguda nem a Daphnia similis nem ao Danio rerio. Já o ensaio com o efluente proveniente da decapagem de metais, apresentou-se muito tóxico aos dois organismos, sendo CL(I)50;48h igual 39,99% e CE(I)50;48h igual a 11,87%, respectivamente. Com relação aos efluentes da indústria petroquímica A, foi detectada ecotoxicidade mesmo estando todos os seus parâmetros analisados de acordo com as legislações vigentes. Já os efluentes provenientes de aterro sanitário, o chorume oriundo de aterro da região metropolitana de São Paulo, em geral, apresentou-se como sendo o mais tóxico dos três aterros sanitários. E o chorume tratado oriundo do aterro do Rio Grande do Sul, demonstrou-se ser o menos tóxico dos três, principalmente com relação à Daphnia similis. De modo geral, todos os efluentes que se encontraram dentro dos limites da legislação (DZ 205 e NT 202), não apresentaram ecotoxicidade aos organismos em estudo. / Given the multiplicity of actions caused by the interaction of chemical agents with possible damage to biota by effluent, the most effective strategy is the integrated use of physical, chemical and ecotóxicological assessment and forecast of environmental risk. In this sense, ecotóxicological tests are important means of environmental monitoring in order to preserve the aquatic environment. The main objective of this study was to implement the test method with Daphnia similis according to ABNT NBR 12713: 2009. Moreover, the objective was to evaluate the relative sensitivity of two organisms-tests (Daphnia similis and Danio rerio) effluents from various industries such as industry of food, beverage, pharmaceutical, paper, petrochemical, effluent from the pickling of metals, and slurry from three different landfills (Sao Paulo, Rio de Janeiro and Rio Grande do Sul) evaluating the results and physical-chemical limits of the in Rio de Janeiro (NT 213, NT 202 and 205 DZ). Thus, we intend to see if the limits are not sufficient to confer acute ecotoxicity to water body. Treated effluent from industry of food, beverage, pharmaceutical and paper, showed no acute ecotoxicity neither Daphnia similis nor the Danio rerio. The test with the effluent from the pickling of metals performed very toxic to both organisms, with LC (I) 50; 48h equals 39.99% and EC (I) 50; 48h equal to 11.87%. The effluent from the petrochemical industry A showed ecotoxicity, even when all its parameters analyzed were in accordance with existing laws. The landfill leachate coming from the metropolitan region of Sao Paulo, in general, presented as being the most toxic of the three landfills. And the treated leachate from the landfill that came from Rio Grande do Sul, proved to be the least toxic of the three, particularly when it came to Daphnia similis. In general, all effluent were within the limits of the law (DZ 205 and NT 202), showed no ecotoxicity to organisms under study.

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Currently, the zebrafish (Danio rerio) is widely used in research related to anxiolytic properties and pharmacological mechanisms of alcoholism. Previous research has shown its effects on several behavioral parameters, similar to that already observed in exposure to anxiolytic drugs, as well as attenuation of fear responses against the predator. The detection of the presence of predator can occur in a visual way, and threatened fish has the ability to communicate about risk to other individuals through the release of a chemical called disturbance substance. The predatory threat causes physiological adjustments as a result of the stress response, which aims to maintain the homeostasis of the animal, and the secretion of the hormone cortisol, the main endocrine indicator of this response. As ethanol can affect the reactions of fear, we evaluated its possible effects on cortisol levels in zebrafish as a result of exposure to the visual perception of predator and disturbance substance. Finally, our study demonstrated for the first time the interference of low doses of ethanol (0.25%, 0.50%, and 1%) for acute exposure on the stress response triggered by the presence of the predator, blocking cortisol secretion in both fish: donors and receivers. In the absence of ethanol, we detected stress response with an increase in cortisol levels in fish tissue disturbance substance of donor fish due to the presence of predators, as well as in fish receptors due to the perception of chemical information. Therefore, we postulate that ethanol may interfere with the visual perception of both predator and/or secretion of disturbance substance, as well as the ability to detect this substance. / Recentemente o peixe zebra (Danio rerio) tem sido amplamente utilizado em pesquisas ligadas as propriedades ansiolíticas e mecanismos farmacológicos do alcoolismo. Pesquisas anteriores tem demonstrado seus efeitos em diversos parâmetros comportamentais, similares aos já verificados na exposição a drogas ansiolíticas. Atenuação das reações de medo, ocasionadas pela presença do predador também tem sido demonstradas, em decorrência da exposição ao etanol. A detecção da presença do predador pode ocorrer de maneira visual, onde o peixe ameaçado tem a capacidade de comunicar demais indivíduos sobre o risco, através da liberação de substância química, denominada substância distúrbio. A ameaça predatória ocasiona ajustes fisiológicos em consequência da resposta de estresse, que tem por objetivo manter a homeostase do animal, sendo a secreção do hormônio cortisol o principal indicador desta resposta. Uma vez que o etanol pode afetar as reações de medo, avaliamos seus possíveis efeitos no aumento dos níveis de cortisol de peixes zebra, em consequência da exposição visual ao predador e percepção da substância distúrbio. Finalmente, nosso trabalho demonstrou por primeira vez a interferência de baixas doses de etanol (0,25%, 0,50% e 1%) em exposição aguda, na resposta de estresse desencadeada pela presença do predador, bloqueando a secreção de cortisol tanto em peixes zebra doadores como peixes zebra receptores da substância distúrbio. Na ausência de etanol, detectamos resposta de estresse com aumento dos níveis de cortisol tecidual em peixes doadores de substância distúrbio devido a presença do predador, assim como em peixes receptores devido a percepção da informação química. Tendo isto em conta, postulamos que o etanol pode interferir na percepção visual do predador e/ou a secreção de substância distúrbio, assim como na capacidade de detecção desta substância por peixes receptores.

Tendo em vista a multiplicidade das ações causada pela interação dos agentes químicos com possíveis danos a biota pelos efluentes, a estratégia mais eficiente é o uso integrado de análises físicas, químicas e ecotóxicológicas para avaliação e previsão do risco ambiental. Nesse sentido, ensaios ecotoxicológicos são importantes meios de monitoramento ambiental a fim de se preservar o meio aquático. Um dos objetivos principais do trabalho foi implementar o método de ensaio com Daphnia similis de acordo com a ABNT NBR 12713: 2009. Além disso, objetivou-se avaliar a sensibilidade relativa de dois organismos-testes (Daphnia similis e Danio rerio) a efluentes de diversas indústrias tais como: alimentícia, bebidas, farmacêutica, papel, petroquímica, efluente proveniente de decapagem de metais, e chorume proveniente de três aterros diferentes (São Paulo, Rio de Janeiro e Rio Grande do Sul) avaliando os resultados físico-químicos e os limites das legislações vigentes no Rio de Janeiro (NT 213, NT 202 e DZ 205). Dessa forma, pretende-se observar se os limites estabelecidos são suficientes para não conferir ecotoxicidade aguda ao corpo hídrico. Os efluentes tratados da indústria alimentícia, de bebidas, de papel e farmacêutica não apresentaram ecotoxicidade aguda nem a Daphnia similis nem ao Danio rerio. Já o ensaio com o efluente proveniente da decapagem de metais, apresentou-se muito tóxico aos dois organismos, sendo CL(I)50;48h igual 39,99% e CE(I)50;48h igual a 11,87%, respectivamente. Com relação aos efluentes da indústria petroquímica A, foi detectada ecotoxicidade mesmo estando todos os seus parâmetros analisados de acordo com as legislações vigentes. Já os efluentes provenientes de aterro sanitário, o chorume oriundo de aterro da região metropolitana de São Paulo, em geral, apresentou-se como sendo o mais tóxico dos três aterros sanitários. E o chorume tratado oriundo do aterro do Rio Grande do Sul, demonstrou-se ser o menos tóxico dos três, principalmente com relação à Daphnia similis. De modo geral, todos os efluentes que se encontraram dentro dos limites da legislação (DZ 205 e NT 202), não apresentaram ecotoxicidade aos organismos em estudo. / Given the multiplicity of actions caused by the interaction of chemical agents with possible damage to biota by effluent, the most effective strategy is the integrated use of physical, chemical and ecotóxicological assessment and forecast of environmental risk. In this sense, ecotóxicological tests are important means of environmental monitoring in order to preserve the aquatic environment. The main objective of this study was to implement the test method with Daphnia similis according to ABNT NBR 12713: 2009. Moreover, the objective was to evaluate the relative sensitivity of two organisms-tests (Daphnia similis and Danio rerio) effluents from various industries such as industry of food, beverage, pharmaceutical, paper, petrochemical, effluent from the pickling of metals, and slurry from three different landfills (Sao Paulo, Rio de Janeiro and Rio Grande do Sul) evaluating the results and physical-chemical limits of the in Rio de Janeiro (NT 213, NT 202 and 205 DZ). Thus, we intend to see if the limits are not sufficient to confer acute ecotoxicity to water body. Treated effluent from industry of food, beverage, pharmaceutical and paper, showed no acute ecotoxicity neither Daphnia similis nor the Danio rerio. The test with the effluent from the pickling of metals performed very toxic to both organisms, with LC (I) 50; 48h equals 39.99% and EC (I) 50; 48h equal to 11.87%. The effluent from the petrochemical industry A showed ecotoxicity, even when all its parameters analyzed were in accordance with existing laws. The landfill leachate coming from the metropolitan region of Sao Paulo, in general, presented as being the most toxic of the three landfills. And the treated leachate from the landfill that came from Rio Grande do Sul, proved to be the least toxic of the three, particularly when it came to Daphnia similis. In general, all effluent were within the limits of the law (DZ 205 and NT 202), showed no ecotoxicity to organisms under study.

Submitted by Luciana Ferreira (lucgeral@gmail.com) on 2018-10-10T14:58:05Z No. of bitstreams: 2 Dissertação - Fabiana Dias Lopes - 2018.PDF: 5144650 bytes, checksum: e26937e82c98a8ad97b968f19bfaccef (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) / Approved for entry into archive by Luciana Ferreira (lucgeral@gmail.com) on 2018-10-10T15:00:23Z (GMT) No. of bitstreams: 2 Dissertação - Fabiana Dias Lopes - 2018.PDF: 5144650 bytes, checksum: e26937e82c98a8ad97b968f19bfaccef (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) / Made available in DSpace on 2018-10-10T15:00:23Z (GMT). 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H is able to inhibit the enzyme 5-enolpyruvoylshikimate-3-phosphate synthase (EPSPS), an enzyme present in plants, but absent in animals. 5-enolpyruvyl-xykimate-3-phosphate synthase (Gly) and RTR are quite toxic to animals, but some studies suggest that the toxicity is related to the surfactants, as well as the POEA-polyoxyethyleneamine present in the commercial formulation of RTR In this study we evaluated the toxic effect of the herbicide Gly, the POEA adjuvant and the RTR, through the acute exposure on D. rerio embryos. The embryos were exposed and evaluated in a 24-well plate for up to 96 hours observing their vital and developmental parameters through the Leica AZ microscope. The embryotoxic activity on D. rerio of the compounds (RTR, Gly and POEA) is of the concentration-time dependent type. The RTR was the most embryotoxic, presenting LC50 / 24h were 44.6 times higher than Gly and 6 times higher than POEA. All compounds led to changes in eye formation and presence of pericardial edema at concentrations chosen as sub-lethal; 3.75, 30 and 25 μg / mL, respectively, for RTR, Gly and POEA for up to 96 hours. Heart rate analysis (beats per minute - bpm) showed embryotoxicity for the compounds tested. Exposure to RTR showed a decrease of bpm at the 24 and 48 h times for the concentrations of 7.5 and 3.75 μg / mL. At 96 h the concentrations of 3.75 and 1.875 μg / mL were equally significant. Gly had an effect on bpms with difference only at 24 and 48h times, most evident at concentrations of 120 and 60 μg / mL. The POEA, unlike Gly, presented a change in bpm at 48 and 72 h for the concentrations of 50, 25 and 12.5 μg / mL. The morphological changes observed were pericardial edema, spinal curvature, which, with advancing exposure, especially in sub-lethal concentrations, intensified; and associations such as hatching delay and death arose. Finally, the results showed high toxicity of RTR compared to Gly and POEA and a great concern for human health, using the experimental model D. rerio. / O Brasil vem ocupando uma posição de destaque no agronegócio desde 2008, considerado um dos maiores consumidores de agrotóxicos do mundo. Dentre estes, os herbicidas a base de Gly (HGLY) tem sido os herbicidas mais utilizados. O HGLY é capaz de inibir a enzima 5-enolpiruvoil-xikimato-3-fosfato sintase (EPSPS), enzima presente nas plantas, porém ausente nos animais. O HGLY Roundup Transorb® (RTR) vem apresentando grandes efeitos tóxicos e sua ação sobre diferentes organismos apontam para a inibição da enzima acetilcolinesterase em animais. Estudos sugerem que o Gly (Gly) e RTR são bastante tóxicos para os animais, porém alguns estudos sugerem que a toxidade esteja relacionada com os surfactantes, tal como o POEA – poli-oxietilenoamina, presentes na formulação comercial de RTR. Neste estudo avaliamos o efeito tóxico do herbicida Gly, do surfactante POEA e de RTR, através do teste de embriotoxidade com o Zebrafish, Danio rerio. Os embriões foram expostos e avaliados em placa de 24 poços por um período de até 96 horas observando seus parâmetros vitais e de desenvolvimento através do microscópio Leica AZ. A atividade embriotóxica observada sobre D. rerio dos compostos (RTR, Gly e POEA) demonstrou ser concentração e tempo dependente. O RTR foi o mais embriotóxico apresentando CL50 24h 44,6 vezes maior que o Gly e 6 vezes maior que POEA. Todos os compostos levaram a alterações na formação dos olhos e presença de edema de pericárdio, nas concentrações eleitas como sub-letais; 3,75, 30 e 25 µg/mL, para respectivamente RTR, Gly e POEA, em período de até 96h. A análise da taxa de batimentos cardíacos (batimentos por minuto - bpm) evidenciou embriotoxidade para os compostos expostos. A exposição ao RTR apresentou diminuição dos bpm nos tempos de 24 e 48 h para as concentrações de 7,5 e 3,75 µg/mL. No tempo de 96h as concentrações de 3,75 e 1,87 µg/mL, foram igualmente significativas. O Gly apresentou efeito sobre os bpms com diferença somente nos tempos de 24 e 48h, de modo mais evidente nas concentrações de 120 e 60 µg/mL. O POEA, diferentemente do Gly, apresentou alteração no bpm nos tempos de 48 e 72 h para as concentrações de 50, 25 e 12,5 µg/mL. As alterações morfológicas observadas foram edemas de pericárdio, curvatura espinhal, que com o avançar da exposição, em especial em concentrações sub-letais, se intensificaram; com o surgimento de associações como retardo de eclosão e morte. É possível que os resultados obtidos quanto a taxa de batimentos cardíacos e mortalidade de embriões e larvas de D. rerio com RTR sejam o resultado sinérgico de Gly e POEA, demonstrando grande preocupação para a saúde humana e ambiental, utilizando o modelo experimental D. rerio.

O manganês (Mn) é um elemento químico abundante na natureza, principalmente em minérios e presente também em alimentos e na água. É o cofator de enzimas importantes, como a superóxido dismutase mitocondrial. Entretanto, mineradores e outras pessoas expostas a produtos manufaturados de Mn podem apresentar uma concentração excessiva desse metal no cérebro, adquirindo uma desordem neurológica similar ao mal de Parkinson conhecida por manganismo. Basicamente a neurotoxicidade do Mn pode estar associada com os vários estados de oxidação que ele pode alcançar, gerando espécies reativas de oxigênio durante a interconversão dessas espécies. Dessa forma, neste trabalho sintetizamos e avaliamos as propriedades pró-oxidantes e neurotóxicas de complexos de Mn(III) com desferrioxamina, [Mn(dfb)]; acetohidroxamato, [Mn(aha)3]; citrato, [Mn(cit)]; cloro-salen, EUK 8; e aceto-salen, EUK 108. Tais compostos são propostos como miméticos da SOD e/ou catalase, entretanto podem apresentar atividade pró-oxidante. Estes complexos foram caracterizados espectrofotometricamente (UV/Vis e IV) e por voltametria cíclica. Foram determinadas as absortividades molares dos complexos [Mn(aha)3], EUK 8 e EUK 108. Os EUK\'s apresentaram dois processos redutivos, sendo apenas um reversível, enquanto o [Mn(cit)] apresentou apenas um processo redutivo reversível e os hidroxamatos [Mn(dfb)] e [Mn(aha)3] não apresentaram processos redox na faixa de potenciais utilizada. Em teste de lipofilicidade todos os complexos apresentaram maior afinidade pela fase aquosa, sendo muito pouco particionados para a fase orgânica. Através do ensaio de supressão de fluorescência de calceína foi possível estabelecer que os EUK\'s são relativamente mais estáveis do que os outros complexos, sendo o [Mn(aha)3] o menos estável dos compostos estudados. Nas análises de atividade pró-oxidante, o [Mn(dfb)] oxidou fortemente a sonda mesmo na ausência de outros cofatores, mas este processo é dependente da concentração de O2 no meio. Os EUK\'s atuaram como pró-oxidantes em função da concentração de peróxido no meio. A atividade pró-oxidante foi suprimida por ascorbato, glutationa e Trolox®, que agiram como antioxidantes, sugerindo implicações para a terapia do manganismo. O teste de toxicidade aguda em paulistinhas (Danio rerio) adultos resultou na mortalidade de alguns animais quando expostos a [Mn(dfb)] e [Mn(aha)3]. Comparando o telencéfalo de peixes expostos ao [Mn(dfb)] com um controle em microscópio, não se visualizou nenhuma alteração morfológica na região do núcleo dorsal, indicando que o complexo não causou nenhum dano visível nessa região. / Manganese (Mn) is an abundant element which is present also in food and water. It is the cofactor of important enzymes such as mitochondrial superoxide dismutase. However, miners and other occupationally exposed individuals may present an excessive load of Mn in brain and develop manganism, a neurological disorder akin to Parkinson Disease. Basically, Mn neurotoxicity may stem from its wide redox cycle, generating reactive oxygen species in the process of converting from one oxidation state to another. Thus, in this work we synthesized and evaluated the pro-oxidant and neurotoxic characteristics of Mn(III) complexes with desferrioxamine, [Mn(dfb)]; acetohydroxamate, [Mn(aha)3]; citrate, [Mn(cit)]; chlorosalen, EUK 8; and aceto-salen, EUK 108. Such compounds are proposed as mimetics of superoxide dismutase and/or catalase, however they may also be prooxidant. These complexes were characterized spectrophotometrically (UV/Vis and IR) and by cyclic voltammetry. Molar absorptivities were determined for [Mn(aha)3], EUK 8 and EUK 108. EUK\'s displayed two reductive processes, only one of which was reversible, while [Mn(cit)] displayed only one (reversible) reductive process and hydroxamates [Mn(dfb)] and [Mn(aha)3] did not display redox processes in the working range of potentials. Lipophilicity tests showed that all complexes have very low partition to the organic phase. Calcein fluorescence quenching studies showed that both EUK complexes are relatively more stable than the others, while [Mn(aha)3] is the least stable. In the pro-oxidant activity studies, [Mn(dfb)] strongly oxidized the fluorescent probe even in the absence of ancillary substances such as peroxide. However, this effect was dependant on O2 saturation in the solution. Both EUK acted as pro-oxidants with a linear dependence on peroxide concentration. Pro-oxidant activity was eliminated by the treatment with antioxidants such as ascorbate, glutathione and Trolox®, which is of interest for the therapy of manganism. In the acute toxicity tests induced some mortality in adult Danio rerio exposed to [Mn(dfb)] or [Mn(aha)3]. Comparison of the telencephalus of [Mn(dfb)]-exposed individuals with controls failed to indicate morphological alterations in the dorsal nucleus area, indicating that the complex did not affect visibly this brain region.

O estudo da expressão circadiana de genes de relógio tem sugerido hormônios como potenciais agentes sincronizadores. A regulação da ritmicidade de relógios periféricos é, aparentemente, mais um dentre os diferentes efeitos fisiológicos atribuídos aos glicocorticoides (GCs), que se constituem como candidatos a zeitgeber dado ao fato de que seus níveis circulantes apresentam padrões diários robustos e são uma das principais eferências do relógio central em mamíferos. Entretanto, em outros vertebrados, o papel dessa classe hormonal em relação a este aspecto ainda é pouco explorado e se a regulação é direta ou indireta, quais suas consequências e de que maneira ela ocorre são indagações a serem respondidas. Empregando a técnica do PCR quantitativo, avaliamos o perfil de expressão dos genes da alça negativa do núcleo da maquinaria molecular do relógio, per1b e cry1b, em células ZEM-2S do teleósteo Danio rerio expostas ao regime fotoperiódico 12:12 CE ou mantidas em escuro constante (EE) e mantidas em EE, mas condicionadas a trocas diárias de meio de cultura ou a pulsos diários de dexametasona a 10-7 M (DEXA), agonista sintético de glicocorticoide. Em 12:12 CE, ambos os genes apresentaram variação temporal, com picos de expressão observados na fase clara do ciclo. Em EE, per1b mostrou um perfil oscilatório de amplitude atenuada, enquanto para cry1b, não foi detectada oscilação ao longo das 24 h. Trocas de meio em EE alteraram significativamente o padrão de expressão de per1b e cry1b, no entanto, os pulsos diários de DEXA promoveram uma oscilação temporal muito mais pronunciada para per1b, modulando positiva ou negativamente sua expressão nos diferentes pontos temporais. O emprego do antagonista RU 486 na concentração de 10-5 M aboliu o pico de expressão detectado no ZT 16, porém, na concentração de 10-6 M, a expressão gênica foi aumentada em cerca de 3 vezes comparado ao tratamento apenas com DEXA. O gene cry1b, por sua vez, não se apresentou suscetível aos pulsos diários de DEXA. Estes resultados permitem confirmar as células ZEM-2S como modelo de relógios periféricos em cultura dada a fotossensibilidade intrínseca das mesmas, reafirmando o papel do ciclo CE como principal agente sincronizador. Os glicocorticoides certamente exercem modulação de per1b por meio da via genômica direta, sem, no entanto excluir uma possível ação via receptor de membrana, tendo em vista a atividade agonista de RU 486, podendo se constituir em um dos fatores que regulam o complexo funcionamento da maquinaria molecular do relógio biológico de zebrafish / Studies on the circadian expression of clock genes have suggested hormones as potential synchronizing agents. Regulation of rhythmicity of peripheral clocks is among the various physiological effects of glucocorticoids (GCs), which are candidate to zeitgeber, since their circulating levels present robust daily patterns and are one of the major outputs of the mammalian central pacemaker. However, in other vertebrates, such a feature has yet to be clarified as well as if the hormonal regulation is direct or indirect, what are its mechanisms and consequences. Applying qPCR technique, we evaluated the gene expression profile of per1b and cry1b, negative feedback loop members of the molecular machinery of biological clock, in ZEM-2S cells of the teleost Danio rerio. The cells were exposed to photoperiod regimen of 12:12 LD; kept in constant darkness (DD); kept in DD but subject to medium changes or treated with daily pulses of 10-7 M dexamethasone (10-7 M DEXA), a glucocorticoid synthetic analogue. In 12:12 LD, both genes presented temporal variation, with peaks of expression in the light phase. In DD, per1b showed an oscillatory profile with attenuated amplitude, whereas cry1b did not oscillate throughout 24 h. DEXA-free medium changes in constant DD conditions altered significantly per1b and cry1b expression profiles. Nevertheless, DEXA daily pulses promoted a temporal oscillation much more pronounced for per1b, modulating positively or negatively its expression at different time points, whereas cry1b was not susceptible to the hormone. RU 486 at 10-5 M abolished the peak of expression of per1b previously observed at ZT 16. On the other hand, RU 486 at 10-6 M increased the gene expression around 3-fold in comparison to just DEXA treatment. These results confirm ZEM-2S cells as a model of peripheral clocks in culture due to their intrinsec photosensitivity, emphasizing the light/dark cycle as a major synchronizing agent. The glucocorticoid modulates per1b expression, probably through a direct genomic pathway, without excluding however its possible action through membrane receptors, since RU 486 exerted agonistic activity. Glucocorticoids could, therefore, be one of the factors that regulate the complex molecular machinery of zebrafish biological clock

Relógios biológicos são marcapassos endógenos presentes tanto em eucariotos quanto em procariotos. Relógios diferentes possuem períodos distintos, e aqueles que se aproximam de 24h de oscilação são chamados circadianos. Em mamíferos, o primeiro relógio circadiano identificado situa-se no núcleo supraquiasmático, localizado no hipotálamo. O funcionamento do relógio circadiano envolve mecanismos de retroalimentação positiva e negativa, em geral tendo início com a ativação dos genes Per e Cry por CLOCK e BMAL1. Atualmente sabe-se que os relógios estão presentes em áreas do cérebro fora do núcleo supraquiasmático e em muitos tecidos periféricos. Em Drosophila e Danio rerio, os osciladores periféricos podem ser sincronizados diretamente por luz, enquanto em mamíferos o reinício de fase dos mesmos parece ser controlado por sinais regulados pelo marcapasso do núcleo supraquiasmático. Uma nova opsina, denominada melanopsina, foi recentemente descoberta na retina de todos os vertebrados estudados, em uma subpopulação de células ganglionares intrinsecamente fotossensíveis. Ela é responsável pela captura de luz e envio dessa informação para o núcleo supraquiasmático. A endotelina (ET) é um peptídeo vasoconstritor composto por 21 resíduos de aminoácidos. Existem três isoformas endógenas de ETs, designadas ET-1, ET-2 e ET-3. Três tipos de receptores para endotelinas já foram clonados, sendo eles designados ETA, ETB e ETC. Todos pertencem à família dos receptores acoplados à proteína G. Órgãos, tecidos e células de Danio rerio constituem um excelente modelo para o estudo dos genes de relógio e de ritmos in vitro. Em células embrionárias ZEM 2S deste teleósteo, constatamos a presença de melanopsina, do receptor ETA para endotelina, e dos seis genes Cry através de PCR. A presença de melanopsina também foi confirmada por imunocitoquímica. Foram realizadas curvas de crescimento em células ZEM 2S previamente mantidas por cinco dias em regime de 14C:10E (luz acesa às 9:00h). No 6º. dia, as células foram transferidas para as seguintes condições: escuro constante; 14C:10E; 10C:14E e luz constante. Houve inibição da proliferação celular por luz. O padrão de expressão temporal dos genes Per1, Cry1b, Clock e da melanopsina foi estudado, assim como sua modulação por ET-1. Células ZEM 2S foram mantidas em fotoperíodo 12C:12E (luz acesa às 9:00h) durante cinco dias, após o que foram tratadas com ET-1 nas concentrações 10-11M, 10-10M, 10-9M e 10-8M, durante 24h. O RNA extraído a cada 3h foi submetido a RT-PCR para posterior análise por PCR quantitativo. RNA ribossômico 18S foi utilizado como normalizador do experimento. Melanopsina não apresentou ritmicidade de expressão em fotoperíodo 12C:12E. ET-1 exerceu efeito bifásico, aumentando a expressão nas menores concentrações de hormônio utilizadas e diminuindo nas maiores. Na concentração 10-10M, ET-1 aparentemente estabeleceu uma oscilação ao longo das 24 horas, com crescente expressão na fase de escuro, atingindo um pico em ZT21 e decrescente durante o período de luz, com o mínimo em ZTs 6 e 9. A expressão do gene Clock é rítmica em regime fotoperíodo 12C:12E, com valores significativamente maiores em ZT12 a ZT21 do que em ZT0, ZT3 e ZT9, indicando um aumento de expressão coincidente com o período de escuro. Foi observado um pico de expressão em ZT6, durante a fase de luz. ET-1 nas concentrações de 10-11 e 10-10M aboliu o ritmo de expressão de Clock, e inibiu o pico de expressão em ZT6. Expressão de Clock permaneceu elevada somente em ZT18. Nas maiores concentrações (10-9M e 10-8M), a inibição ocorreu em todos os ZTs, abolindo completamente o ritmo e atenuando qualquer variação previamente observada entre os ZTs. A expressão do gene Per1 é rítmica em regime fotoperíodo 12C:12E, com valores significativamente maiores nos ZTs 21, 0, 3, 6 e 9 do que nos ZTs 12, 15 e 18, indicando um aumento de expressão na fase de claro. Vale mencionar que já em ZT21, há um aumento significativo antecipatório da fase de luz. Nas concentrações de 10-11 e 10-10M, ET-1 não alterou o período ou a amplitude desse ritmo. A ação evidente de ET-1 foi a inibição da expressão de Per1 na fase de luz (ZT0, ZT3, ZT6 e ZT9), e também em ZT21 (fase de escuro) nas maiores concentrações (10-9M e 10-8M) não afetando o período da oscilação, mas diminuindo marcadamente sua amplitude. A expressão de Cry1b foi rítmica durante o ciclo claro:escuro, com aumento na fase de claro e diminuição na fase de escuro. Novamente a ET-1 apresentou um efeito bifásico sobre a expressão deste gene, aumentando a mesma durante a fase de luz na concentração de 10-11M, e em ZT6 e ZT9 na concentração 10-10M. No entanto, não alterou o período ou a amplitude do ritmo. Por outro lado, durante toda a fase de luz houve inibição deste gene na presença de ET-1 10-9 e 10-8M, diminuindo a amplitude observada nas células controle. / Biological clocks are endogenous timekeepers that are present both in eukaryotic as in prokaryotic organisms. Different clocks have different periods, and those that have about 24h of oscillation are called circadian clocks. In mammals, the first identified circadian clock is located in the suprachiasmatic nucleus, in the hipothalamus. It is now well known that clocks are present in brain regions other than the suprachiasmatic nucleus and in many peripheral tissues. In Drosophila and Danio rerio, peripheral oscillators can be synchronized directly by light, while in mammals the reset of the phase seems to be controlled by signals regulated by the suprachiasmatic timekeepers. The maintenance of the circadian clock is governed by positive and negative feedback loops, in general starting with the activation of Per and Cry genes by CLOCK and BMAL1. A new opsin called melanopsin, was recently discovered in the retina of all studied vertebrates, in a subset of intrinsically photosensitive ganglion cells. This photopigment is responsible for capturing light and sending this information to the suprachiasmatic nucleus. Endothelin (ET) is a 21-amino acid residue vasoconstrictor peptide. There are three endogenous isoforms of ETs, ET1, ET2 and ET3. Three subtypes of endothelin receptors have already been cloned: ETA, ETB and ETC, all members of the family of G protein -coupled receptors. Organs, tissues and cells of Danio rerio constitute an excellent model for the study of clock genes and rhythms in vitro. In ZEM 2S embryonic cells of this teleost, we demonstrated the presence of melanopsin, the endothelin receptor ETA, and the six Cry genes by PCR. The presence of melanopsin was also confirmed by immunohistochemistry. ZEM 2S cells previously kept for five days in 14L:10D (lights on 9:00am) were transferred in the sixth day to the following conditions: constant darkness, 14L:10D, 10L:14D and constant light, and growth curves were determined. ZEM 2S showed inhibition of proliferation by light. The temporal expression pattern of the genes Per1, Cry1b, Clock and of melanopsin and their modulation by ET-1 were studied. ZEM 2S cells were kept in 12D:12L photoperiod (lights on 9:00am) for five days, and then treated with 10-11M, 10-10M, 10-9M and 10-8M ET-1, for 24h. RNA extracted every 3 hours was submitted to RT-PCR for subsequent analysis by Real Time-PCR. 18S ribosomal RNA was used to normalize the results. Melanopsin did not show rhythmicity of expression in 12D:12L photoperiod. ET-1 exhibited a biphasic effect, increasing the expression in the lower concentrations, and reducing at the higher concentrations. At 10-10M, ET-1 apparently established an oscillation along the 24h-period, with increasing expression in the dark phase, reaching a peak at ZT2, and decreasing during the light phase, with the minimum at ZT6 and 9. The expression of Clock gene was rhythmic in 12D:12L photoperiod, with significant higher values in ZT12 to ZT21 than ZT0, ZT3 e ZT9, indicating an increase of expression coincident with the dark period. A peak of expression was observed at ZT6, during the light phase. At 10-11 and 10-10M, ET-1 abolished the rhythm of expression of Clock, and inhibited the peak of expression at ZT6. Expression of Clock remained high only at ZT18. At the higher concentrations (10-9M e 10-8M), the inhibition occurred at all ZTs, completely abolishing the rhythm and attenuating any variation previously observed among ZTs. The expression of Per1 gene was rhythmic in 12D:12L photoperiod, with significant higher values at ZTs 21, 0, 3, 6 and 9 than at ZTs 12, 15 and 18, indicating an increase of expression in the light phase. It is important to mention that at ZT21 there was already a significant increase, anticipatory of the light phase. At 10-11 e 10-10M, ET-1 did not alter neither the period nor the amplitude of this rhythm. The evident action of ET-1 was the inhibition of Per1 expression in the light phase (ZT0, ZT3, ZT6 e ZT9), and also at ZT21 (dark phase), at the higher concentrations (10-9M e 10-8M), with no change in the oscillation period, but markedly reducing its amplitude. The expression of Cry1b was rhythimic during the light:dark cycle, with increase in the light phase and reduction in the dark phase. Again, ET-1 showed a biphasic effect on this gene expression, increasing it during the light phase at the concentration of 10-11M, and at ZT6 and 9 at 10-10M. However, the hormone did not affect either the period or the amplitude of the rhythm. On the other hand, along the light phase, there was inhibition of Cry1b in the presence of ET-1 10-9 and 10-8M, reducing the amplitude observed in the control cells.

La résistance aux antibiotiques est un problème majeur en santé publique qui mène à développer de nouvelles stratégies thérapeutiques, notamment en ciblant des facteurs de virulence bactériens. MgtC est un facteur de virulence impliqué dans la survie intra-macrophagique chez plusieurs pathogènes intracellulaires. La protéine MgtC est également présente chez le pathogène extracellulaire Pseudomonas aeruginosa. De plus, un peptide MgtR a été identifié comme étant un antagoniste naturel potentiel de MgtC. Pour étudier le rôle de MgtC dans la virulence des mycobactéries, j'ai analysé un mutant mgtC de Mycobacterium marinum dans les modèles d'infection d'embryons de danio et de macrophages en culture. Cela a permis de mettre en évidence un nouveau rôle de MgtC au niveau de l'étape de phagocytose qui est augmentée avec le mutant mgtC. Chez P. aeruginosa, nous avons montré qu'un mutant mgtC est atténué dans l'embryon de danio et présente une sensibilité accrue à l'action bactéricide du macrophage. Par ailleurs, j'ai montré que les gènes mgtC de M. marinum et de P. aeruginosa sont régulés par le magnésium. De plus, l'expression de mgtC de P. aeruginosa est fortement induite dans les macrophages. Enfin, concernant les propriétés antagonistes de MgtR, des souches de Mycobacterium bovis BCG ou de P. aeruginosa exprimants mgtR semblent se comporter de la même manière que les mutants mgtC, suggérant des propriétés anti-virulence prometteuses pour MgtR et confirmant le choix de MgtC en tant que cible dans le cadre d'une stratégie anti-virulence. / Antibiotic resistance is a major problem in public health, which leads to develop new therapeutics strategies, including strategies targeting bacterial virulence factors. MgtC is a virulence factor involved in intramacrophage survival in several intracellular pathogens. MgtC protein is also present in extracellular pathogen Pseudomonas aeruginosa. Moreover, a peptide MgtR has been identified as a potential and natural antagonist of MgtC.To study the role of MgtC in mycobacterial virulence, I have analysed a Mycobacterium marinum mgtC mutant in zebrafish embryo and macrophage infection models. This approach allowed us to uncover a new role of MgtC in phagocytosis, which is increased with mgtC mutant. In P. aeruginosa, we have shown that a mgtC mutant is attenuated in zebrafish embryos. In ex vivo experiments, mgtC mutant is more sensitive to macrophage killing. In parallel, I have shown that M. marinum and P. aeruginosa mgtC genes are regulated by magnesium. In addition, expression of P. aeruginosa mgtC is highly induced in macrophages.Finally, regarding MgtR antagonistic properties, Mycobacterium bovis BCG or P. aeruginosa strains expressing mgtR appear to mimic the behaviour of mgtC mutants, suggesting promising anti-virulence properties for MgtR and supporting the choice of MgtC as a suitable target of an anti-virulence strategy.