Tableau d'honneur de la Faculté des études supérieures et postdoctorales, 2011-2012 / Streptococcus thermophilus est une bactérie utilisée pour la fabrication industrielle de yogourts et de fromages et elle est sujette aux infections phagiques. Plusieurs mécanismes de défense contre les phages sont connus, dont le système CRISPR/Cas. Les loci CRISPR sont constitués de courtes séquences d'ADN répétées entrecoupées de séquences variables, les espaceurs. Des gènes cas et une région promotrice sont associés aux loci et la séquence homologue chez le phage est appelée le protoespaceur. Pour ce mémoire, l'effet du système CRISPRl/Cas de la souche S. thermophilus DGCC7710 sur l'ADN phagique a été étudié. Ainsi, il a été prouvé que l'ADN phagique est clivé dans les protoespaceurs par le système CRISPRl/Cas. Puis, l'analyse des différents espaceurs démontre que les motifs associés aux protoespaceurs sont plus permissifs qu'anticipé. Finalement, la méthylation de l'ADN phagique ne semble pas affecter l'immunité CRISPR/Cas ou l'acquisition d'espaceurs.

Streptococcus thermophilus is a low GC gram-positive bacterium massively used for the production of fermented products such as yogurt and cheeses. Every day, the dairy industry must face virulent bacteriophages and their consequences. Recently, a genetic structure called CRISPR (for Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats) was found to be present in many bacterial and archeabacterial genomes. This system, in association with Cas (CRISPR-associated) proteins, allows the bacteria to become resistant to foreign DNA, such as phage or plasmid DNA, by the acquisition of new sequence-specific spacers. During this M. Sc. project, the transcription profile of the CRISPRl-cas system of S. thermophilus was investigated. First, the phage-sensitive wild-type strain DGCC7710 and two phage-resistant CRISPR-mutants (DGCC7710<i>2972+S4 and DGCC7710*2972+S7) were infected with the virulent phage 2972. Northern blot experiments of infected cells samples taken at time intervals were performed using a series of single-stranded 5'-labeled-probes targeting the four cas genes, the CRISPR1 locus, as well as phage genes. Phage DNA replication assays of the same samples were also done. Finally, in vitro enzymatic assays were performed using Casl and Cas2 purified proteins. In the three S. thermophilus strains tested, the four cas genes and the CRISPR1 locus were constitutively transcribed. In the phage-resistant CRISPR-mutant DGCC7710<D2972+S4 , phage mRNA specific to the acquired new spacer was rapidly degraded, whereas phage mRNAs were increasingly and strongly detected in infected phage-sensitive cells (DGCC7710). Conversely, no DNA degradation was observed. The enzymatic assays revealed that Casl and Cas2 have ssRNase activity which, in the case of Casl, is specific to a A(U)C sequence. Taken altogether, the CRISPR-cos system in S. thermophilus leads to mRNA degradation of specific phage transcripts, thereby limiting phage replication. / Streptococcus thermophilus est une bactérie utilisée pour la fabrication de produits laitiers fermentes, mais elle doit constamment lutter contre les infections par de nouveaux bacteriophages virulents. Récemment, un tout nouveau mécanisme naturel de défense contre les phages a été découvert chez S. thermophilus. Les CRISPR (clustered regularly interspaced short palindromic repeats) sont des séquences d'ADN contenant plusieurs répétitions entrecoupées de régions appelées spacers qui proviennent d'ADN extrachromosomique. Les loci CRISPR sont habituellement situés à proximité de gènes cas (CRISPR-associated). L'acquisition d'un spacer est directement reliée à une immunité contre le phage duquel provient l'ADN de ce spacer. Au cours de ce projet de maîtrise, le mode de fonctionnement du système CRISPR-cas a été étudié par analyse transcriptionnelle des gènes cas, de régions impliquées dans le locus CRISPRl-cas ainsi que des gènes viraux chez trois souches isogéniques de S. thermophilus (DGCC7710, DGCC7710[phi]2972+S4 et DGCC7710[phi]2972+S7) en cours d'infection par le phage 2972. Des travaux ont également été faits sur la replication virale chez les trois souches. Finalement, des essais enzymatiques in vitro ont été réalisés avec deux des quatre protéines Cas dont les gènes précèdent un des loci CRISPR de la souche DGCC7710. Les résultats du projet indiquent, entre autres, que les quatre gènes cas présents chez la souche S. thermophilus DGCC7710 sont transcrits constitutivement et que l'ARNm viral est dégradé par les souches résistantes ayant acquis de nouveaux spacers, ce qui ne semble pas être observé au niveau de l'ADN. Les résultats des essais enzymatiques démontrent également que les protéines Casl et Cas2 possèdent une activité sbRNase, qui dans le cas de la protéine Casl, est spécifique à la séquence A(U)C. Les résultats démontrent que le système CRISPR-cas agit de façon à dégrader l'ARN étranger comprenant une séquence identique à un spacer acquis par une souche résistante, ce qui a pour effet direct de limiter la replication du phage.

HPr est une protéine du système phosphoénolpyruvate:sucre phosphotransférase impliquée dans le transport, la régulation d'enzymes et de transporteurs et la régulation de la transcription de certains gènes. La protéine HPr peut être retrouvée sous quatre formes différentes. Elle peut être phosphorylée sur un résidu histidyl par l'enzyme 1 pour former HPr(His"-'P). Sous cette forme, HPr peut, entre autres, contrôler par phosphorylation certains régulateurs transcriptionnels contenant des domaines PRD. Chez les bactéries à Gram positif, HPr peut être phosphorylée sur un résidu séryl par la HPr kinase/phosphorylase. Le produit formé, HPr(Ser-P), est impliqué dans la répression catabolique selon un mécanisme impliquant la formation d'un complexe entre HPr(Ser-P), la protéine CcpA et une séquence spécifique d'ADN située dans la région promotrice des opérons cibles, la séquence cre. HPr(Ser-P) est également impliquée dans le phénomène d'exclusion d'inducteur. Enfin, des taux importants de HPr(Ser-P)(His-P) ont été détectés chez Streptococcus salivarius, Streptococcus mutans et Streptococcus thermophilus. Afin de caractériser HPr(Ser-P)(His-P), nous avons vérifié si certaines bactéries de la classe des Bacilli pouvaient produire et maintenir des taux importants de HPr(Ser-P(His-P) et vérifié si HPr(Ser-P)(His-P) pouvait participer au transport des sucres. Les quantifications de HPr ont été effectuées par immunoélectrophorèse croisée et la capacité de HPr(Ser-P)(His-P) à phosphoryler les enzymes IIABMan et la glycérol kinase ont été étudiées. Des taux importants de HPr(Ser-P)(His-P) ont été détectés chez toutes les souches de streptocoquès et lactocoques testées mais pas chez Bacillus subtilis, Enterococcus faecalis et Staphylococcus aureus. HPr(Ser-P)(His-P) était en mesure de transférer son groupement phosphoryle aux enzymes IIABMan mais' pas à la glycérol kinase, suggérant que HPr(Ser-P)(His-P) participe au transport des sucres PTS mais ne serait pas impliquée dans le contrôle de l'activité de la glycérol kinase. Nous avons finalement étudié le rôle de HPr(His"-'P) dans la régulation de la transcription chez Streptococcus salivarius via une étude comparative des protéomes de la souche parentale ATCC 25975 et du mutant G71 , une souche Er, incapable de produire HPr(His-P). Les analyses protéomiques différentielles ont été réalisées à partir d' extraits provenant de cellules récoltées en phase exponentielle et stationnaire de croissance. Chez les cellules récoltées en phase stationnaire de croissance, l'analyse des profils protéiques a révélé que 1 % à 2% des protéines étaient exprimées différentiellement chez S. salivarius G71 suggérant que HPr(His-P) serait impliquée dans le contrôle de l'expression de gènes chez les streptocoques.

Les bactériophages sont des maîtres manipulateurs, prenant le contrôle complet d'une cellule bactérienne, contournant les systèmes de défense et détournant la machinerie de transcription et de traduction du génome bactérien pour la réplication virale. Les grandes étapes de la multiplication des phages sont connues, pourtant les mécanismes intrinsèques de cette prise de contrôle restent un mystère bien préservé. Malgré la petite taille et la simplicité relative des génomes de phages, seuls les gènes associés à la structure des virions sont amplement caractérisés. Toutefois, les protéines non structurales qui sont susceptibles d'être responsables de la prise de contrôle sont rarement étudiées. C'est effectivement le cas pour le phage modèle 2972, infectant la souche Streptococcus thermophilus DGCC7710 largement utilisée en industrie laitière. Son génome code pour 44 protéines putatives, dont 14 protéines sont classées comme étant non structurales et dont aucune fonction n'est encore associée. Lors de ce projet de maîtrise, le système CRISPR-Cas de type II-A, naturellement présent chez S. thermophilus, a été utilisé à des fins d'édition du génome de ce phage pour étudier le rôle des protéines non structurales. Ce système est idéal pour les manipulations génétiques des phages virulents généralement complexes à modifier. Ainsi, une connaissance approfondie des interactions entre le phage et son hôte sera un outil indispensable pour développer de meilleures méthodes de contrôle des phages en industrie laitière. / Bacterial viruses are master manipulators of bacterial cells. They are able to take complete control of a bacterium, bypassing bacterial immune systems, hijacking core transcription and translation machinery, and typically resulting in lysis of the host. Although the major steps of phage replication are well understood, very little is known about the mechanisms of the host-cell takeover. Despite phages having relatively small and 'simple' genomes, generally only the structural proteins have been well characterized. In contrast, non-structural proteins, which include those involved in host cell takeover, tend to be completely uncharacterized. This is certainly the case for the model of Streptococcus thermophilus phages, 2972, which infects the strain DGCC7710 widely used by the dairy industry. Its genome encodes for 44 putative proteins, 14 of which are non-structural and have no known function. In this master thesis, the type II-A CRISPR-Cas system naturally present in S. thermophilus was used for genome engineering purposes to investigate the role of non-structural proteins of phage 2972. This natural bacterial immune system provides an ideal means for genetic manipulation of virulent phages, which are otherwise intractable. This could lead to potentially valuable discoveries allowing us to further fine-tune the bacteria used in various biological processes.

Streptococcus thermophilus est la seconde bactérie lactique la plus utilisée en transformation laitière. Comme toutes les bactéries, elle peut être infectée par des virus appelés bactériophages ou phages. Les phages représentent un risque significatif en transformation laitière puisqu'ils sont ubiquitaires et peuvent mener à des produits fermentés de qualité inférieure. L'étude de la biologie des phages lactiques et de leurs mécanismes de réplication est nécessaire à la prévention et au contrôle de leur prolifération dans les procédés industriels. En général, les gènes viraux qui sont exprimés dès le début de l'infection sont les plus susceptibles d'encoder des protéines qui interagissent avec des composantes de la bactérie. Chez le phage 2972, plus de la moitié de ces gènes dits précoces n'ont pas de fonction connue. Le principal objectif de cette maîtrise était donc de débuter la caractérisation des protéines virales encodées par certains de ces gènes. Puisque la nature du ou des partenaires d'interaction d'une protéine est souvent directement liée à la fonction de cette dernière, nous avons travaillé au développement de méthodes servant à investiguer les interactions protéine-protéine entre le phage 2972 et sa souche hôte S. thermophilus DGCC7710. Les méthodes adaptées sont basées sur la purification d'affinité avec les étiquettes de type Strep-III® ou s'inspirent de la méthode du BioID. Pour la réalisation de certaines approches, le phage 2972 a dû être modifié génétiquement à l'aide du système CRISPR-Cas de type II-A naturellement présent chez sa bactérie hôte. La caractérisation de quelques-uns de ces phages modifiés génétiquement nous a permis de vérifier ou de formuler des hypothèses qui concernent les relations phage-hôte et la résistance aux phages chez S. thermophilus. L'extraction du protéome bactérien est une étape importante dans l'étude des interactions protéine-protéine. La lyse de notre bactérie modèle, soit DGCC7710, a représenté un défi inattendu dans le développement de notre méthode. En effet, cette bactérie à Gram positif s'est avérée résistante à plusieurs techniques standard de lyse. Toutefois, nous avons démontré que les endolysines, des enzymes utilisées par les phages pour lyser la bactérie en fin d'infection, peuvent être purifiées et utilisées pour la lyse de la souche DGCC7710. Finalement, nous avons travaillé à résoudre la structure de différentes protéines de fonction inconnue du phage 2972 par cristallographie à rayons X. Bien que la structure d'aucune des protéines à l'étude n'ait encore été résolue, nos essais laissent croire qu'une protéine précoce de 2972 interagit avec des acides nucléiques. / Streptococcus thermophilus is one of the most widely used bacterium in the dairy transformation industry. This bacterium is primarily used in the production of yogurt and speciality cheeses such as mozzarella. Like all bacteria, strains of S. thermophilus can be infected by bacterial viruses commonly known as bacteriophages or phages. Phages are ubiquitous and represent a significant risk for the dairy industry as they can greatly impact the quality of fermented dairy products. The study of phage biology is crucial for the development of efficient phage control methods in dairy factories. In general, early expressed phage genes encode viral proteins that are the most likely to interact with host molecules. More than half of such early expressed genes encode proteins of unknown function in lactic phage 2972. The main objective of this thesis was to investigate the function of some of these viral proteins. Because the nature of the binding partner of a given protein often reflects its function, we are developing methods based on affinity purification for the study of protein-protein interactions between the phage 2972 and its host S. thermophilus DGCC7710. Our methods are based on affinity purification with Strep-III® tags or inspired from BioID. In order to achieve some of our objectives, we genetically modified the genome of phage 2972 using the endogenous type II-A CRISPR-Cas system of DGCC7710. The characterization of some of these genetically modified phages gave us insights on phage-host relationships and phage resistance in S. thermophilus. In developing our methods, the proteome extraction of S. thermophilus cells were surprisingly challenging. Indeed, this Gram-positive bacterium was resistant to many standard lysis techniques. Here, we show that purified phage endolysins are very efficient in lysing the strain DGCC7710. Endolysins are phage enzymes that lyse their bacterial host at the end of the phage lytic cycle. Finally, we worked on solving the structure of different proteins of unknown function encoded in the genome of phage 2972 by X-ray crystallography. While we have yet to solve any structure, we observed that one of the early-expressed protein of phage 2972 interacts with nucleic acids.

CoordenaÃÃo de AperfeiÃoamento de Pessoal de NÃvel Superior / O gÃnero Guettarda (Rubiaceae) compreende plantas extensamente distribuÃdas em Ãreas tropicais. Com relaÃÃo à espÃcie Guettarda sericea, a literatura demonstra que existe uma ampla carÃncia acerca de estudos botÃnicos e fitoquÃmicos. Assim, o presente trabalho buscou avaliar o efeito antibacteriano do extrato etanÃlico das folhas de G. sericea (EEFGS) e suas fraÃÃes sobre o crescimento de Streptococcus oralis ATCC 10557 e S. salivarius ATCC 7073, nas formas planctÃnicas e de biofilmes. Diferentes metodologias foram empregadas para a verificaÃÃo do potencial antimicrobiano. Dentre estas estÃo a determinaÃÃo da concentraÃÃo inibitÃria mÃnima (MIC), a determinaÃÃo da curva de morte e a avaliaÃÃo da concentraÃÃo bactericida mÃnima (MBC). AlÃm disso, a quantificaÃÃo da biomassa e do nÃmero de cÃlulas viÃveis do biofilme foi realizada, respectivamente, atravÃs da coloraÃÃo pelo cristal violeta e contagem de unidades formadoras de colÃnia (UFC). Os controles, negativo e positivo utilizados em todos os ensaios foram, respectivamente, DMSO 4% e Gluconato de Clorexidina com concentraÃÃo ajustada de acordo com os dados da CIM de cada micro-organismo. Para a determinaÃÃo da toxicidade do EEFGS utilizou-se o ensaio de toxicidade sobre nÃuplios de Artemia. Os dados mostraram que o extrato e as subfraÃÃes 13 a 17 da fraÃÃo clorofÃrmio apresentaram um marcante efeito antimicrobiano, sendo capazes de inibir o crescimento planctÃnico, bem como o desenvolvimento de biofilmes da cepa de S. oralis atà a concentraÃÃo de 62,5 Âg.mL-1. Com relaÃÃo a S. salivarius, apenas a subfraÃÃo 12 interferiu sobre o crescimento bacteriano. No tocante à toxicidade, foi observado que a morte dos nÃuplios de Artemia ocorreu em concentraÃÃes mais elevadas do que aquelas que apresentaram efeito antibacteriano. A partir de tais resultados pode-se concluir que EEFGS e as subfraÃÃes 13 a 17 podem ser utilizados como insumos para o controle da formaÃÃo de biofilmes de S. oralis. Em adiÃÃo, metodologias complementares que busquem a purificaÃÃo dos compostos ativos e seus efeitos citotÃxicos sobre cÃlulas eucariÃticas necessitam ser realizadas, visando sua utilizaÃÃo como um agente fitoterÃpico. / The genus Guettarda (Rubiaceae) comprises plants widely distributed in tropical areas. Regarding the Guettarda sericea species, the literature shows that there is a lack of botanical and phytochemicals studies. Thus, the present study aimed to evaluate the antibacterial effect of ethanol extract of leaves of G. sericea (EEFGS) and its fractions on the growth of Streptococcus oralis ATCC 10557 and S. salivarius ATCC 7073 in both the planktonic and biofilms states. Different methods were employed to verify the antimicrobial potential. Among these are the determination of minimum inhibitory concentration (MIC) determination of the death curve and evaluation of minimum bactericidal concentration (MBC). Furthermore, quantification of biomass and the number of viable cells of the biofilm were performed, respectively, by staining with crystal violet and counting colony forming units (CFU). The negative and positive controls used in all assays were respectively 4% DMSO and chlorhexidine gluconate with concentration adjusted according to the data of the MIC of each microorganism. To determine the toxicity of EEFGS, it was used the toxicity test on Artemia nauplii. The data showed that the extract and subfractions 13 to 17 of the chloroform fraction show a remarkable antimicrobial effect, able to inhibit the growth of planktonic and development of biofilms of S. oralis strain until the concentration of 62.5 &#956;g.mL-1. With respect to S. salivarius, only subfraction 12 interfered on bacterial growth. Regarding the toxicity, it was observed that death of Artemia nauplii occurred at higher concentrations than those that exhibited antibacterial effect. From these results it can be concluded that EEFGS and subfractions 13-17 can be used as agents for the control of biofilm formation of S. oralis. In addition, complementary methodologies that seek purification of the active compounds and their cytotoxic effects on eukaryotic cells need to be held, aiming its use as an herbal agent.

Les bactéries commensales digestives jouent un rôle primordial dans l’homéostasie épithéliale et la santé de l’hôte, avec notamment un rôle modulateur du système immunitaire. Des effets bénéfiques dans le traitement des pathologies inflammatoires intestinales ont été caractérisés chez certaines souches de bactéries commensales. La compréhension de ces effets dans le maintien de l’homéostasie intestinale repose sur la connaissance des interactions entre les bactéries, l’épithélium intestinal et le système immunitaire muqueux. Streptococcus salivarius est l’un des premiers colonisateurs de la cavité buccale et du tractus digestif de l’homme. Cette bactérie a été utilisée comme modèle pour rechercher des mécanismes impliquée dans l’homéostasie.La recherche d’interactions entre des souches de l’espèce S. salivarius et les cellules humaines a été réalisée pour caractériser leurs éventuelles propriétés immunomodulatrices. Nous avons montré que les bactéries vivantes et les surnageants de cultures des souches de cette espèce modulent la réponse inflammatoire in vitro via un effet inhibiteur sur l’activation de la voie NF-B dans les cellules épithéliales intestinales (HT-29 et Caco-2) et les monocytes (THP-1). Cette modulation de l’inflammation a été confirmée par la capacité des surnageants bactériens à inhiber la sécrétion d’IL-8 par les cellules épithéliales. Ces surnageants agissent via une étape impliquant IB-, un inhibiteur du facteur NF-B. Ils inhibent la dégradation de la protéine IB- phosphorylée et diminuent ainsi la translocation nucléaire des composants NF-B. Nous avons également identifié et caractérisé un métabolite bactérien présent dans ces surnageants exerçant cette activité anti-inflammatoire. L’utilisation de ce métabolite et son isomère miment in vitro l’effet inhibiteur des surnageants sur l’activation de la voie NF-B dans les cellules épithéliales et les monocytes. Nous avons ainsi caractérisé un métabolite secrété par la bactérie commensale S. salivarius qui est capable d’inhiber une des voies centrales de signalisation impliquée dans la réponse inflammatoire intestinale. Enfin, une capacité anti-inflammatoire de S. salivarius a également été montrée dans un modèle murin d’inflammation digestive dans lequel les bactéries métaboliquement actives ont protégé les animaux de colites induites avec du TNBS. Ces travaux ouvrent la voie pour le développement d’applications thérapeutiques dans le traitement de pathologies inflammatoires de l’intestin basées sur ce composé actif ou l’utilisation de S. salivarius comme probiotique. / Commensal bacteria play a vital role in epithelial homeostasis and host health, including a modulatory role of the immune system. Their beneficial effects in the treatment of inflammatory bowel disease have been characterized in some strains of commensal bacteria. Understanding these effects in maintaining intestinal homeostasis is based on the knowledge of interactions among bacteria, the intestinal epithelium and the mucosal immune system. Streptococcus salivarius is one of the first colonizers of human oral cavity and digestive tract. This bacterium was used as a template to investigate mechanisms involved in homeostasis.The research for interactions between strains of S. salivarius species and human cells was performed to characterize their possible immunomodulatory properties. We have shown that living bacteria and culture supernatants of strains of this species modulate the inflammatory response in vitro via an inhibitory effect on the activation of NF-B in intestinal epithelial cells (HT-29 and Caco-2) and monocytes (THP-1). This modulation of inflammation was confirmed by the ability of bacterial supernatants to suppress the secretion of IL-8 by epithelial cells. These supernatants act via a step involving IκB-α, an inhibitor of NF-B. They inhibit the degradation of IκB-α phosphorylated protein and thus decrease the nuclear translocation of NF-B components. We also identified and characterized a bacterial metabolite present in these supernatants exercising this anti-inflammatory activity. Use of this metabolite and its isomer in vitro mimic the repressive effect of supernatants on activation of NF-B in epithelial cells and monocytes. We have characterized a metabolite secreted by commensal bacterium S. salivarius that is capable of inhibiting one of the central signaling pathways involved in the intestinal inflammatory response. Finally, an anti-inflammatory capacity of S. salivarius was also shown in a mouse model of gastrointestinal inflammation in which the metabolically active bacteria protected the animals from colitis induced with TNBS.This work paves way for the development of therapeutic applications in the treatment of inflammatory bowel disease based on the active compound or the use of S. salivarius as a probiotic.

Afin de caractériser les mécanismes moléculaires sous-jacents au processus d’adhésion des bactéries commensales, nous avons utilisé Streptococcus salivarius comme modèle. Streptococcus salivarius est une bactérie pionière dans la colonisation des surfaces orales chez le nouveau né, et devient par la suite un composant majoritaire du microbiote oral de l'adulte avec un rôle écologique majeur. Nous avons développé une méthode pour identifier, par des tests de criblage phénotypique, les gènes impliqués dans l’adhésion de S. salivarius aux surfaces bactériennes ou de l’hôte. Notre approche a permis d’identifier un ensemble de gènes codant pour des protéines de surfaces, des glycosyltransférases, des transporteurs qui sont impliqués dans les phénomènes d’auto-agréation et / ou de co-agrégation avec d’autres espèces et / ou l’adhésion aux protéines de l’hôte.En particulier, nous avons montré que le système SecA2Y2, qui comprend des gènes codant pour des protéines dédiées à la glycosylation et l'export de protéines de surface riche en sérine (SRRPs), participe aux processus d’agrégation, de formation de biofilms, à l'adhésion in vitro aux protéines de l’hôte et in vivo à la colonisation du tractus digestif de souris. Alors que toutes les bactéries contenant un système similaire possèdent un substrat unique au système, une SRRP, le locus génétique secA2Y2 comprend trois SRRPs qui présentent des rôles complémentaires dans les phénotypes précédement cités. SrpB est spécifiquement impliquée dans la liaison aux cellules epitheliales, tandis que SrpC participe à l’adhésion aux protéines de la matrice extracellulaire et le mucus. De manière atypique, nous avons démontré que le processus de maturation des SRRPs est supporté par glycosyltransférases extra-cluster. Cette étude est le premier rapport indiquant la présence dans une bactérie de trois SRRPs, qui présentent des rôles complémentaires dans l'interaction bactéries-hôte. Bien que le système SecA2Y2 soit principalement associé à la virulence des bactéries pathogènes, il semble être clairement impliqué dans les caractères de commensalité de S. salivarius, tels que la colonisation de ses niches écologiques orales et intestinales. Ce travail offre de nouvelles perspectives sur les mécanismes de colonisation des bactéries commensales. / To characterize molecular mechanisms underlying adhesion of commensal bacteria, we used Streptococcus salivarius (SSAL) as a model. SSAL is among the most important pioneer colonizers of neonatal oral mucosal surfaces, and later becomes a predominant component of the human adult oral microbiota with pre-eminent ecological role. We developed a method to identified, through phenotypic screening assays, genes involved in SSAL adhesion to host or bacterial surfaces. In particular, we showed that the SecA2Y2 system, which comprises genes devoted to glycosylation and export of surface Serine Rich Repeat Proteins (SRRPs), participates to bacterial aggregation, biofilm formation, in vitro adhesion and colonization of mice. While all bacteria containing a similar system possess only one SRRP, the SSAL secA2Y2 locus comprises three SRRPs with complementary role in line with the previous phenotypes. Interestingly, SrpB is specifically involved in the binding to epithelial cells, while SrpC to the extracellular matrix and mucus proteins. We showed that these interactions require glycosylation of both bacterial SRPs and host surfaces. Surprisingly, we demonstrated that this essential process is shared by glycosyltransferases located in other genomic regions. This work is the first report showing the presence in a bacterium of three SRPs, which display complementary roles in bacterial-host interaction. While the SecA2Y2 system is mostly associated to virulence in pathogenic bacteria, it appears to be involved in the expression of commensal traits in SSAL, such as its colonization and its resilience to oral and intestinal niches. This work may offer new insights into the mechanisms of niche establishment (host, microbial communities) of commensal bacteria.

Les éléments intégratifs conjugatifs (ICE) sont des éléments génétiques mobiles se transférant horizontalement d’une bactérie à une autre. Les ICE sont porteurs de gènes adaptatifs pouvant significativement améliorer le fitness de la bactérie hôte et permettre son adaptation à de nouvelles niches écologiques. Lors de ces travaux, des ICE apparentés à ICESt3 ont été retrouvés chez la bactérie commensale et pathogène opportuniste Streptococcus salivarius. Les analyses in silico réalisées ont démontré la diversité des ICE de cette famille, notamment au niveau de leurs modules de recombinaison, de régulation mais aussi de leurs gènes adaptatifs potentiellement mis à disposition de la communauté microbienne orale et digestive de l’Homme. La fonctionnalité de deux de ces ICE a été mise en évidence expérimentalement à travers l’évaluation de la capacité de ces éléments à se transférer intra- et inter-spécifiquement. Ces travaux ont également permis l’identification de facteurs d’hôte influençant la mobilité d’ICESt3, révélant ainsi l’importance, pour le transfert et l’acquisition de cet ICE, des molécules de surface telles que les lipoprotéines, les acides téichoïques et les exopolysaccharides. En conclusion, il a été démontré que les éléments de la famille ICESt3 participent à l’évolution du génome chez différentes espèces de streptocoques et aux échanges génétiques entre bactéries issues de l’alimentation et bactéries de la flore digestive humaine. Enfin, ces travaux ont contribué à une meilleure compréhension des mécanismes et des facteurs d’hôte influençant la mobilité de ces éléments génétiques mobiles / Integrative Conjugative Elements (ICEs) are mobile genetic elements that can be horizontally transferred from a bacterium to another, eventually regardless of the species or any other classification, allowing them to benefit from a broad host spectrum. ICEs can carry adaptive genes that can significantly improve the bacterial fitness and allow its adaptation to new ecological niches. In this work, ICEs related to ICESt3 were found in the commensal and opportunistic pathogen Streptococcus salivarius. In silico analysis highlighted the diversity of the ICESt3 family within this species, especially concerning their recombination and regulation modules, but also their adaptive genes likely available for the oral and digestive microbial community of the human host. The functionality of two ICEs found in S. salivarius was experimentally confirmed through their ability to transfer in intra- and interspecific manners. This work also allowed the identification of host factors affecting ICESt3 mobility, and revealed the importance, for the transfer and the acquisition of this ICE, of cell surface molecules such as lipoproteins, teichoic acids and exopolysaccharides. In conclusion, this thesis allowed expanding the knowledge regarding the mobile genetic elements of the ICESt3 family. This work demonstrated that these elements contribute to genome evolution of different streptococci species and gene exchanges between bacteria originated from food and the human gut flora. Finally, this study contributes to a better comprehension of the mechanisms and host factors influencing the mobility of these mobile genetic elements

Ce travail de thèse vise à mieux comprendre l'effet de l'environnement buccal sur le comportement d'une bactérie orale probiotique, Streptococcus salivarius K12. La croissance et la maintenance de S. salivarius K12 ont tout d'abord été caractérisées dans une salive artificielle complémentée (CAS) conçue pour l'étude. Dans ce milieu, cette bactérie démontre un taux de croissance élevé et un temps de latence court, mais elle ne produit pas de bactériocines actives. La survie de S. salivarius K12 en phase stationnaire est, en revanche, affectée dans le milieu CAS. Ce phénomène est expliqué par une synthèse moindre des protéines impliquées dans le métabolisme énergétique, dont celui du glycogène. Toutefois, malgré une sensibilité accrue en phase stationnaire, le milieu CAS permet la croissance et la maintenance de S. salivarius K12. Les effets de plusieurs facteurs environnementaux spécifiques de la bouche, sur S. salivarius K12, ont été déterminés en milieu CAS. Ainsi, l'apport de saccharose, conduit à une dégradation de la viabilité. Des enzymes, ajoutées à leur concentration physiologique, affectent également les cellules bactériennes. Le lysozyme accroît la mortalité de S. salivarius par son action sur la paroi bactérienne. La peroxidase améliore sa viabilité en diminuant le potentiel redox du milieu. Le rôle clé du potentiel redox sur S. salivarius K12 est confirmé par l'impact négatif de l'injection d'air enrichi à 5% de CO2, qui accroît le potentiel redox. Enfin, l'amylase a démontré un rôle à la fois positif (augmentation de la biomasse) et négatif (diminution du taux de croissance). En conséquence, les études impliquant des bactéries orales se doivent de prendre en compte ces facteurs environnementaux influant sur les l'état physiologique bactérien. La mise en place de cultures continues respectant les variations de flux salivaire et permettant l'apport périodique de nutriments, tout en combinant l'ensemble des conditions environnementales identifiées précédemment, a permis de simuler la dynamique des conditions buccales. Les résultats démontrent que S. salivarius K12 est bien adapté à ces conditions de culture. Les cellules sont capables de se maintenir à un niveau de cultivabilité constant, malgré la carence nutritionnelle et le lessivage auxquels elles sont soumises. Certains mécanismes moléculaires expliquant cette adaptation ont été caractérisés : activation des voies d'utilisation de sources de carbone alternatives, stockage de l'énergie, augmentation de la compétence génétique naturelle. Finalement, ces travaux ont permis d'identifier certains mécanismes permettant à Streptococcus salivarius K12 de s'adapter à l'environnement buccal, grâce à la mise en place de méthodes d'étude in vitro du comportement des bactéries orales. / This thesis aims to better understand the effect of oral environmental conditions on the behaviorof the probiotic bacteria Streptococcus salivarius K12. Growth and maintenance of S. salivarius K12 have been characterized in a complemented artificial saliva (CAS), designed for this study. In this medium, S. salivarius demonstrated highspecific growth rate and low lag time, but it did not produce active bacteriocins. However, the survival of S. salivarius K12 during stationary phase was affected during fermentation in CAS medium. This was mainly explained by a reduced synthesis of proteins involved in energy and glycogen metabolisms. Thus, despite an increased sensitivity in stationary phase, the "complemented artificial saliva" allowed the growth and maintenance of S. salivarius K12. The effects of several environmental oral factors on S. salivarius K12 were determined in complemented artificial saliva. Adding sucrose decreased cellular viability. Enzymes added to their physiological concentration also affected the bacteria. Lysozyme increased S. salivarius mortality by acting on cellular wall. Peroxidase enhanced viability, by reducing the redox potential. The key role of redox potential on S. salivarius K12 was confirmed by the negative impact of the injection of air containing 5% CO2, which increased redox potential. The amylase demonstrated both positive (biomass increase) and negative roles (reduced growth rate). Consequently, studies involving oral bacteria must integrate these environmental factors that affected the bacterial physiological state. Continuous cultures, taking into account the variations in salivary flow and the periodical supply of nutrients, and combining all environmental conditions previously identified, allowed simulating oral dynamic conditions. From our results, a good adaptation of S. salivarius K12 took place in these culture conditions. Cells were able maintaining a constant level of cultivability despite nutritional starvation and wash out. Some molecular mechanisms explaining this bacterial adaptation have been characterized: activation of alternative carbon sources pathways, energy storage, and increase of natural genetic competence. Finally, this work made it possible identifying some mechanisms used by Streptococcussalivarius K12 to adapt itself to the oral environment, through the establishment of in vitro methods for studying the behavior of oral bacteria.