A carambola (Avehrroa carambola L.) é uma rica fonte de vitaminas, sais minerais e antioxidantes. Seu formato de estrela, quando seccionada transversalmente, torna essa fruta muito valorizada na culinária. Contudo, nos últimos anos têm sido relatados alguns casos de intoxicação após ingestão desta fruta, relacionados, principalmente, a pacientes nefropatas. Sintomas como soluços intratáveis, agitação, confusão mental, vômito, convulsão e morte, decorrentes do status epilepticus (SE), foram descritos na maioria dos casos de intoxicação. Este quadro pode estar associado a presença de uma neurotoxina, caramboxina (CBX), que tem a capacidade de inibir o sistema de condução GABAérgico, além de atuar sobre os principais receptores glutamatérgicos, levando a ativação do mecanismo de excitotoxicidade neuronal. Há diversos modelos experimentais que buscam estudar os mecanismos ligados ao aparecimento do SE. Uma vez que a caramboxina pode estar relacionada com a indução do SE, estudos para melhor compreender seu metabolismo podem contribuir para sua possível aplicação em modelos experimentais de epilepsia. Portanto, este trabalho teve como objetivo estudar o metabolismo in vitro da caramboxina, utilizando microssomas hepáticos e modelo de oxidação biomimética. Um extrato metanólico foi preparado na proporção de 1:1 (m/v) e em seguida fracionado em coluna contendo sephadex LH-20. A fração contendo CBX foi submetida a cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC) para seu isolamento. Essa metodologia permitiu um rendimento superior ao descrito na literatura, permitindo que esta neurotoxina possa ser futuramente avaliada em modelos experimentais in vivo de epilepsia. Parte da CBX isolada foi avaliada em ensaios de metabolismo in vitro com microssomas hepáticos de ratos, no entanto, não foi observado formação de produtos de oxidação nas condições empregadas, o que pode sugerir que não ocorra metabolismo de fase I da CBX, corroborando com a proposta de rápida eliminação pela urina por pessoas saudáveis que ingerem carambola. A avaliação da oxidação da CBX por modelo biomimético, utilizando catalizador de Jacobsen e oxidante e iodosilbenzeno (PhIO), apresentou a formação de um metabólito, o qual poderá ser posteriormente utilizado nos estudos de mecanismo de ação da CBX / The Star fruit (Averrhoa carambola L.) is a good source of vitamins, minerals and antioxidants. Its star shape, when cross-sectioned, makes this fruit highly prized in cooking. However, in the last years some cases of intoxication after ingestion of this fruit, mainly related to nephropathy patients, have been reported. Symptoms such as intractable hiccups, agitation, mental confusion, vomiting, convulsion, and death, due to status epilepticus (SE), have been described in most cases of intoxication. These clinical conditions may be associated with the presence of a neurotoxin, caramboxine (CBX), which has the capacity to inhibit the GABAergic conduction system, in addition to acting on the main glutamatergic receptors, leading to activation of the mechanism of neuronal excitotoxicity. Several experimental models aim to study the mechanisms related to the appearance of the SE. Since caramboxin may be related to the induction of ES, studies to better understand its metabolism may contribute to its possible application in experimental models of epilepsy. Therefore, this work aimed to study the in vitro metabolism of caramboxin, using hepatic microsomes and biomimetic oxidation model. A methanolic extract was prepared in the ratio of 1: 1 (m / v) and then fractionated on a column containing LH-20 sephadex. The fraction containing CBX was submitted to high performance liquid chromatography (HPLC) for its isolation. This methodology allowed a higher yield than described in the literature, allowing this neurotoxin to be evaluated in vivo in experimental models of epilepsy. Part of the isolated CBX was evaluated in in vitro metabolism assays with hepatic microsomes of rats, however, no oxidation product formation was observed under the conditions employed, which may suggest that CBX phase I metabolism does not occur, corroborating with a proposal for rapid urinary elimination by healthy people who eat carambola. The evaluation of CBX oxidation by biomimetic model, using Jacobsen\'s catalyst and oxidant and iodosilbenzene (PhIO), presented the formation of a metabolite, which could be used in future CBX action mechanism studies.

A piplartina (PPT) ou piperlongumine é um produto natural da classe dos alcaloides encontrada em espécies da família Pipereaceae. Devido a sua alta potência e seletividade na inibição de diversas linhagens de células tumorais, a PPT têm sido investigada como um potencial candidato à fármaco. Neste contexto, estudos relacionados à sua toxicidade e segurança devem ser realizados, incluindo a determinação do papel das enzimas do Citocromo P450 (CYP450) sobre o metabolismo da PPT. Esta família de enzimas é responsável pela biotransformação de cerca de 75% dos fármacos presentes no mercado. Os estudos pré-clínicos que visam avaliar o metabolismo podem ser realizados empregando modelos in vitro como uma ferramenta para predição de características farmacocinéticas in vivo. Assim, o presente estudo teve como objetivo a avaliação do perfil metabólico da PPT frente as enzimas do CYP450 empregando-se estudos in vitro com microssomas hepáticos humanos (HLM) e a posterior predição de parâmetros farmacocinéticos. Estes estudos incluíram a determinação de parâmetros enzimáticos, estudos de inibição da PPT sobre as principais isoformas do CYP450, elucidação estrutural de metabólitos gerados com a reação de metabolismo e, finalmente, estudos de fenotipagem enzimática. A metodologia geral de estudo de metabolismo in vitro envolveu o uso de técnicas cromatográficas acopladas a diversos detectores/analisadores, tais como arranjo de diodos, espectrometria de massa e ressonância magnética nuclear. O metabolismo foi avaliado pela medida da taxa de desaparecimento da PPT do meio microssomal. Após validação da metodologia para quantificação da PPT e determinação das condições de velocidade inicial de reação, um perfil sigmoidal foi obtido, indicando o metabolismo da PPT por enzimas contendo múltiplos sítios ativos e/ou catálise por diversas enzimas concomitantemente. Os parâmetros cinéticos calculados foram Vmax = 5,5 ± 0,5 nmol mg proteína-1 min-1, S50 = 127,70 ?mol L-1 e Coeficiente de Hill (h) = 3. O clearance intrínseco obtido foi de 22,68 ?L min -1 mg -1. A fração não ligada às proteínas plasmáticas e microssomais foi de 0,07 e 0,76, respectivamente. O clearance in vivo predito foi de 19,79 mL min -1 kg -1, o clearance hepático de 1,89 mL min -1 kg -1 e extração hepática de 0,09. Dentre quatro isoformas avaliadas, CYP3A, CYP2C9, CYP2D6 e CYP1A2, a PPT demonstrou um potencial em causar interação produto natural-medicamento apenas sobre a CYP1A2. A PPT é um inibidor competitivo dose-dependente da CYP1A2, apresentando um valor de Ki de 1,5 ?mol L-1. A razão [I]/Ki obtida de 9,1 prediz uma interação relevante in vivo. Além disso, a PPT apresentou uma inibição tempo-dependente sobre a CYP1A2 com valores de KI de 8 ?mol L-1 e kinact de 0,014 min-1. A inibição dose-, ii NADPH- e tempo-dependente confirmam uma inibição baseada no mecanismo em que o modo pelo qual a PPT liga-se à enzima é irreversível. Baseado nos dados obtidos pelas análises por espectrometria de massa e ressonância magnética nuclear, quatro metabólitos gerados após metabolismo da PPT com HLM tiveram suas estruturas propostas. Assim, foram caracterizados os metabólitos M1 (produto de uma desmetilação na posição meta do anel 3,4,5-trimetoxicinâmico), M2 (produzido por uma epoxidação entre o C3 e C4 do anel lactâmico), M3 (gerado através de uma oxidação no C5 do anel lactâmico) e, finalmente, M4 (produto de uma reação transdiidrodiol entre C3 e C4). O metabólito M4 é formado tardiamente (após 40 min de reação) e provavelmente é um metabólito secundário produzido a partir de M2 através de uma reação trans-diidrodiol. O estudo de fenotipagem demonstrou que as principais isoformas que contribuem para o metabolismo da PPT são a CYP1A2 (formação de M1) e a CYP3A4 (formação de M2 e M3). O emprego das isoformas recombinantes demonstrou a formação de M4 a partir da catálise por diversas isoformas, CYP2C19, CYP2C8, CYP2D6, CYP2B6 e CYP2E1. Portanto, o perfil metabólico do candidato a agente antitumoral PPT frente às enzimas do CYP450 foi demonstrado neste trabalho, proporcionando aspectos relacionados à segurança e eficácia desta substância. Os dados apresentados certamente servirão como guia em estudos clínicos futuros / Piplartine (PPT) or Piperlongumine is a naturally occurring alkaloid found in species of Pipereaceae family. Due its high potency and selectivity of inhibition of several cancer cell lines, PPT has been investigated as a potential drug candidate. In this context, studies related with toxicity and safety should be performed, including the role of the Cytochrome P450 (CYP450) enzymes in PPT metabolism. This family of enzymes is responsible for the biotransformation of 75% of the drugs in the market. The preclinical studies that aim to evaluate the drug metabolism can be performed by employing in vitro models as a tool for prediction of in vivo pharmacokinetic characteristics. Therefore, the aim of this work was to evaluate the metabolic profile of PPT after metabolism by CYP450 enzymes employing in vitro studies with human liver microsomes (HLM) and the ensuing prediction of pharmacokinetic parameters. These studies embraced the kinetic parameters determination, inhibition ability of PPT over the most important CYP450 isoforms, structural elucidation of the produced metabolites after metabolism reaction and, finally, the enzymatic phenotyping study. The general procedure for in vitro metabolism studies consisted of the use of chromatographic techniques coupled to different detectors/analyzers, such as diode array, mass spectrometry and nuclear magnetic resonance. The metabolism was evaluated measuring the rate of disappearance of the PPT from de microsomal medium. After method validation for PPT quantification and determination of initial velocity conditions, the enzymatic kinetics with a sigmoidal profile indicating a metabolism of PPT by enzymes with multiple active sites and/or metabolism by multiple CYP450 enzymes was observed. The following parameters were calculated: Vmax = 5.5 ± 0.5 nmol/mg protein/min, S50 = 127.7 ?mol/L, and Hill coefficient of 3.0. The intrinsic clearance was 22.68 ?L min -1 mg -1. The unbound fraction of PPT on plasmatic and microsomal proteins was 0.07 and 0.76, respectively. The predicted in vivo clearance was 19.79 mL min -1 kg -1, the hepatic clearance was 1.89 mL min -1 kg -1 and the hepatic extraction was 0.09. Among 4 isoforms evaluated, CYP3A, CYP2C9, CYP2D6 and CYP1A2, a potential natural product-drug interaction for only CYP1A2 isoenzyme by PPT was observed. PPT showed to be a competitive and dosedependent inhibitor of CYP1A2, showing a Ki value of 1.5 ?mol L-1. The ratio [I]/Ki of 9.1 predicts an important in vivo interaction. Furthermore, a time-dependent inhibition of CYP1A2 with a KI of 8 ?mol L-1 and a kinact of 0.014 min-1 by PPT was demonstrated. The dose-, time- and NADPH-dependent inhibition confirms an inhibition based on mechanism through an irreversible bond. Based on results obtained from the mass spectrometry analysis and from the nuclear magnetic resonance analysis, four metabolites were identified and characterized. The metabolites characterized were: M1 (product of a demethylation in the 3,4,5-trimethoxyphenyl portion, M2 (derived from an epoxidation between C3 and C4 on the lactone ring), M3 (product of a simple oxidation on C5 of lactone ring), and finally M4 (derived from a dihydrodiol reaction between C3 and C4). The metabolite M4 is produced later (after 40 min of reaction) and probably is a secondary metabolite produced from M2 through a dihydrodiol reaction. The phenotyping study demonstrated that the main isoforms involved in PPT metabolism are CYP1A2 (production of M1) and CYP3A4 (production of M2 and M3). The recombinant isoforms study demonstrated that several isoforms (CYP2C19, CYP2C8, CYP2D6, CYP2B6 and CYP2E1) catalyze the production of M4. In summary, a wide view about the metabolism of the promising drug candidate PPT by CYP450 enzymes was accomplished. These results, certainly, will be a useful guide for further clinical studies of PPT

A (-)- grandisina (GRA) é um produto natural da classe das lignanas e é encontrada em muitas espécies de plantas das regiões Norte e Nordeste do Brasil. Por apresentar diversas propriedades biológicas, como atividade tripanocida, anti-inflamatória, antinociceptiva, e principalmente atividade antileucêmica e antitumoral contra tumores de Ehrlich, a GRA pode ser considerada um potencial candidato a fármaco. Porém, para que a GRA se torne um fármaco são necessárias diversas etapas de estudos, incluindo estudos pré-clínicos de interações medicamentosas (DDI). As DDI ocorrem principalmente devido a inibições diretas e tempo-dependentes das enzimas do citocromo P450 (CYP450), uma superfamília de enzimas responsável por metabolizar cerca de 75% dos fármacos em uso. Os estudos pré-clínicos de DDI envolvem o conhecimento do potencial inibitório do candidato a fármaco sobre essas enzimas e esses estudos podem ser realizados empregando diversos modelos in vitro, como, por exemplo, microssomas hepáticos de humanos (HLM). Assim, nesse estudo foi avaliado o efeito inibitório da GRA sobre a atividade das principais isoformas do CYP450 e também foram determinadas as isoformas que contribuem para a formação dos metabólitos da GRA. Os resultados demonstraram que múltiplas isoformas participam da formação dos metabólitos da GRA, com destaque para a CYP2C9, que participa da formação de todos os metabólitos. Em relação aos estudos de inibição, foi possível concluir que a GRA é um inibidor fraco da CYP1A2 e CYP2D6, com valores de IC50 maiores do que 200 µM e 100 µM, respectivamente, e um inibidor moderado e competitivo da CYP2C9, com IC50 igual a 40,85 µM e Ki igual a 50,60 µM. Para a CYP3A4 o potencial inibitório da GRA foi avaliado utilizando dois substratos distintos. A GRA demonstrou ser tanto um inibidor dose-dependente moderado e competitivo dessa isoforma, quanto um inibidor tempo-dependente baseado em mecanismo com potencial de inativação equiparável ao do irinotecano, inibidor baseado em mecanismo clinicamente significativo. Utilizando a nifedipina como substrato os valores de IC50 e Ki foram 78,09 µM e 48,71 µM, respectivamente. Já os valores dos parâmetros cinéticos de inativação foram KI= 6,40 µM, kinact= 0,037 min-1 e Clinact= 5,78 mL min-1 µmol-1. Para os ensaios empregando o midazolam os valores de IC50 e Ki foram 48,87 µM e 31,25 µM, respectivamente, e os valores dos parâmetros cinéticos de inativação foram KI= 31,53 µM, kinact= 0,049 min-1 e Clinact= 1,55 mL min-1 µmol-1. Com relação a CYP2E1, por sua vez, foi possível observar que a GRA tem capacidade de aumentar a atividade dessa isoforma significativamente a partir da concentração de 4 µM. Portanto, conclui-se que não há risco da GRA apresentar interações medicamentosas com fármacos metabolizados pela CYP1A2 e CYP2D6, enquanto que para a CYP2C9, apesar da GRA ser um inibidor moderado dessa isoforma, o risco é baixo. Já para medicamentos metabolizados pela CYP2E1 e CYP3A4 o risco de DDI existe e isso deve ser cuidadosamente monitorado in vivo, principalmente porque a CYP3A4 é a isoforma responsável por catalisar o metabolismo da maioria dos fármacos. / (-)-grandisin (GRA) is a lignanic natural product found in many species of plants from North and Northeast of Brazil. This compound has several biological properties, such as trypanocide, anti-inflammatory, antinociceptive, antileukemia activity and antitumor activity against Ehrlich tumor. Because of these biological properties, GRA is considered a potential drug candidate, however, before becoming a new drug, GRA has to undergo various tests, including preclinical drug-drug interactions (DDI) studies. Most of the times, DDI occur because of direct and time-dependent inhibitions of cytochrome P450 (CYP450) enzymes, an enzyme superfamily responsible for metabolizing the vast majority of drugs administered. Preclinical drug-drug interactions studies involve the evaluation of the potential of a drug candidate to inhibit this superfamily of enzymes and these studies can be conducted using in vitro models, such as human liver microsomes (HLM). Therefore, in this project, the inhibitory effect of GRA on the activity of some CYP450 isoforms was evaluated and the isoforms that catalyze the formation of GRA\'s metabolites were also determined. Results showed that multiple CYP450 isoforms participate in the GRA\'s metabolites formation, highlighting CYP2C9, which catalyzes the formation of all metabolites. The inhibition studies showed that GRA is a weak inhibitor of CYP1A2 and CYP2D6, with IC50 values greater than 200 µM and 100 µM, respectively, and a moderate and competitive inhibitor of CYP2C9, with IC50 value equal to 40.85 µM and Ki value equal to 50.60 µM. The capability of GRA to inhibit CYP3A4 was evaluated using two different substrates. GRA showed to be a moderate and competitive dose- dependent inhibitor of this isoform and also a mechanism-based time-dependent inhibitor with potential of inactivation comparable to irinotecan, a clinically significant mechanism-based inhibitor. IC50 and Ki values obtained using nifedipine as substrate were 78.09 µM and 48.71 µM, respectively, and inactivation kinetics parameters were KI= 6.40 µM, kinact= 0,037 min-1 e Clinact= 5.78 mL min-1 µmol-1. On the other hand, IC50 and Ki values using midazolam as substrate were 48.87 µM and 31.25 µM, respectively, and the values of inactivation kinetics parameters were KI= 31.53 µM, kinact= 0,049 min-1 and Clinact= 1.55 mL min-1 µmol-1. With respect to CYP2E1, it was observed that GRA increases its activity significantly from a concentration of 4 µM. Therefore, it is possible to conclude that there is no risk of DDI between GRA and drugs metabolized by CYP1A2 and CYP2D6, while for CYP2C9, although GRA is a moderate inhibitor of this isoform, the risk is low. Finally, for drugs metabolized by CYP3A4 and CYP2E1 there is risk of DDI and this should be carefully monitored in humans, mainly because CYP3A4 is an isoform responsible for catalyzing the metabolism of most drugs in use.

O gênero Piper pertencente à família Piperaceae, encontra-se distribuído nas regiões tropicais e subtropicais do globo. Estudos químicos têm demonstrado diversidade de metabólitos secundários com atividade biológica. Os alcalóides são metabólitos característicos. A piplartina, (E)-1-(3-(3,4,5-trimetoxifenil)acriloil)-5,6- diidropiridin-2(1H)-ona, é um alcalóide encontrado em muitas espécies. Tem atividade citotóxica contra células de linhagem tumoral, ansiolítica, antidepressiva, antifúngica e antiagregação plaquetária, sendo dessa forma, uma molécula candidata a um novo fármaco. O conhecimento do metabolismo de um candidato a fármaco é um fator importante na avaliação da sua segurança e eficácia. Ensaios in vitro estão crescentemente sendo utilizados como screening e os microssomas hepáticos representam o sistema in vitro mais utilizado. Dessa forma, o presente trabalho tem como objetivo determinar os parâmetros cinéticos enzimáticos in vitro da piplartina utilizando microssomas de fígado de ratos, bem como a determinação dos possíveis metabólitos formados. Para tanto, foi desenvolvido um método de quantificação da piplartina utilizando cromatografia líquida de alta eficiência. Como condição de análise, empregou-se uma coluna C18, fase móvel acetonitrila:água (40:60, v/v) e vazão de 1 mL min-1. Para extração da piplartina dos microssomas hepático de ratos foi empregado a extração líquido-líquido utilizando 4,0 mL de hexano como solvente extrator. Após otimização da extração, o método foi validado, mostrando-se linear na faixa de 2,4-157,7 ?M, obtendo-se uma equação da reta y= 0,0934x + 0,0027, (r= 0,99) e limite de quantificação de 2,4 ?M. A recuperação média foi de 85%. A precisão e exatidão apresentaram resultados dentro do recomendável pela ANVISA. A piplartina manteve-se estável até 50 minutos em condições de incubação, e até 6h sob a bancada. Após validação da metodologia, estabeleceram-se as condições lineares para a quantidade de proteínas microssomais: 0,28 mg mL-1 e para o tempo de incubação: 16 minutos no consumo da piplartina no meio microssomal, e então efetuou-se a determinação dos parâmetros cinéticos enzimáticos da piplartina empregando as condições de V0. Nesse estudo foi observado um Vmax= 4,74 ± 0,26 ?M/?g mL-1/min, h= 2,53 ± 0,37, S50= 44,69 ± 0,32 ?M e CLmax= 0,054 ?L/min/mg proteina, um perfil cinético indicativo de cooperatividade. Um estudo qualitativo para determinação dos possíveis metabólitos foi feito utilizando-se a espectrometria de massas, por meio da qual foi possível identificar a formação de dois produtos hidroxilados. Deste modo, os microssomas mostraram-se uma ferramenta útil, rápida e simples para determinação da cinética enzimática, e na condução dos estudos preliminares de metabolismo in vitro. / The genus Piper belongs to the Piperaceae family and includes species that are widely distributed throughout the tropical and subtropical regions of the world. Chemical studies have shown diversity of secondary metabolites with biological activity. The alkaloids are characteristic metabolites. The piplartine, (E)-1-(3-(3,4,5- trimethoxyphenyl)acryloyl)-5,6-diidropiridin-2(1H)-one is an alkaloid found in many species. It shows cytotoxic activity against tumor cell lines, anxiolytic, antidepressant, antifungal, and antiplatelet therapy, thus being a drug candidate. The knowledge regarding the oxidative metabolism is an important tool in assessing the safety and efficacy of a drug candidate. In vitro assays are increasingly being used as a screening tool and liver microsomes represent the most widely in vitro system used for that. This study aims to determine the in vitro enzymatic kinetic parameters for piplartine by cytochrome P450 enzymes (CYP) present in the rat liver microsomes, and the determination of possible metabolites. To accomplish, it was developed a method to quantify the piplartine using high performance liquid chromatography. The analysis was carried out employing a C18 column, mobile phase: acetonitrile: water (40:60, v/v) at a flow rate of 1 ml min-1. To extract piplartine from rat liver microsomes it was employed the liquid-liquid extraction (4.0 mL of hexane). The method was validated and proved to be linear in the range of 2.4 to 157.7 ?M, the equation for calibration curve was: y= 0.0934x + 0.0027 (r = 0.99), and a limit of quantification of 2.4 ?M. The mean recovery was 85%. The precision and accuracy were in agreement with ANVISA guidelines. The piplartine remained stable until 50 minutes of incubation conditions, and until 6 hours under the bench. Once validated, it was set the conditions for the linear amount of microsomal protein: 0.28 mg mL-1 and to the incubation time: 16 minutes, then it was performed the determination of enzymatic kinetic parameters, that revealed a sigmoidal profile with Vmax = 4.74 ± 0.26 ?M/mg mL-1/min, h = 2.53 ± 0.37, S50 = 44.69 ± 0.32 ?M, and CLmax = 0.054 ?L/min/mg protein, indicating a cooperativity behavior. A qualitative study to determine possible metabolites carried out using mass spectrometry, through which it was possible to identify the formation of two hydroxylated products. To conclude, the microsomes showed to be a useful, fast and simple tool to determination of enzymatic kinetics and in vitro metabolism studies.

O Artepelin C (ART C) é um produto natural presente na própolis verde brasileira que apresenta diversas atividades biológicas. Dentre essas, destacam-se as atividades anticancerígenas, o que o torna um promissor candidato à fármaco para o tratamento de diversos tipos de câncer (pulmão, rins, cólon, testículos, próstata e leucemia). A determinação do metabolismo de um candidato a fármaco é uma das etapas primordiais no desenvolvimento do mesmo. Atualmente, modelos in vitro para a determinação do metabolismo do candidato frente às enzimas da citocromo P450 (CYP450) vem sendo largamente utilizados. Esses modelos apresentam como principais vantagens a simplicidade, o baixo custo e a ausência ou uso reduzido de animais. No presente trabalho, avaliou-se o metabolismo in vitro do ART C empregando microssomas hepáticos de ratos e de humanos, com o objetivo de caracterizar os parâmetros cinéticos enzimáticos e identificar os possíveis metabólitos formados durante o metabolismo. Para tanto, foi desenvolvido e validado um método analítico para análise do ART C em meio microssomal. A análise do ART C foi realizada por cromatografia líquida de alta eficiência, empregando coluna C18 e fase móvel composta por metanol : solução aquosa de ácido fórmico 0,1% (70:30, v/v). A vazão utilizada foi de 1,2 mL min-1 e a detecção foi realizada em 315 nm. A metodologia analítica foi validada de acordo com o guia para validação de métodos bioanalíticos da Agência Nacional de Vigilância Sanitária, avaliando-se os parâmetros seletividade, linearidade, efeito residual, limite inferior de quantificação, precisão, exatidão e estabilidade, sendo que os resultados obtidos corroboraram com as exigências do guia. A seguir, foram determinadas as condições de velocidade inicial da reação enzimática (V0), necessárias para a determinação dos parâmetros cinéticos enzimáticos do metabolismo do ART C em microssomas hepáticos de ratos e humanos. As condições de V0 determinadas foram tempo de incubação de 30 minutos e concentração proteica microssomal de 0,5 mg mL-1 para os microssomas de ratos e tempo de incubação de 40 minutos e concentração proteica microssomal de 0,5 mg mL-1 para os microssomas de humanos. O modelo microssomal de rato demonstrou um possível perfil cinético sigmoidal, adequando-se ao modelo cinético de Hill. Os parâmetros cinéticos determinados foram: Vmáx = 0,7567 ± 0,0212 µmol mg-1 min-1, coeficiente de Hill = 10,90 ± 2,80 e S50 = 33,35 ± 0,55 µM. A partir desses parâmetros obteve-se o clearance intrínseco para o ART C de 16,63 ± 1,52 µL min-1 mg-1. Para o modelo microssomal de humanos, os resultados do metabolismo do ART C não se adequaram a nenhum dos modelos cinéticos enzimáticos já descritos. Em ambos os modelos microssomais, foi possível a identificação de dois metabólitos do ART C. Para tanto, foi empregado a cromatografia liquida acoplada a espectrometria de massa de alta resolução ou acoplada a espectrometria de massa de múltiplos estágios. Os resultados revelaram que ambos os metabólitos formados são produtos de hidroxilação do ART C. / Artepillin C (ART C) is a natural product present in Brazilian green propolis, which has several biological properties. Among these ones, the anticancer properties have been highlighted, making ART C a promising drug candidate for treatment of several types of cancer (lungs, kidneys, colon, testicles, prostate and leukemia). The knowledge of a drug metabolism is one of the key stages in early drug development. Nowadays, in vitro models have been used to determine the metabolic route by the cytochrome P450 (CYP450) enzymes for a drug candidate. The main advantages of using these models are the simplicity, the relative low cost and the absence or reduced use of animals. In this project, we determined the in vitro metabolism of ART C by employing rat and human liver microsomes, in order to characterize the enzymatic kinetics parameters and to identify possible produced metabolites during the metabolism. To accomplish that, an analytical method was developed and validated for ART C analysis in microsomal medium. The ART C analysis was carried out by high performance liquid chromatography, using a C18 column and methanol : formic acid aqueous solution 0.1% (70:30, v/v) as mobile phase. The flow rate used was 1.0 mL min-1 and detection was set at 315 nm. The analytical methodology was validated according to ANVISA guideline for bioanalytical method validation. The following parameters were evaluated: selectivity, linearity, carryover, lower limit of quantification, precision, accuracy and stability, wherein the obtained results corroborate to the guides requirement. Hereafter, the initial velocity conditions for the enzymatic reaction (V0) of ART C metabolism in rat and human liver microsomes was determined. The V0 conditions were incubation time 30 minutes and microsomal protein concentration 0.5 mg mL-1 for rat microsomes and incubation time 40 minutes and microsomal protein concentration 0.5 mg mL-1 for human microsomes. The metabolism by rat liver microsomes suggested a sigmoidal profile, adapting to the Hills kinetics model. The enzymatic kinetics parameters determined were: Vmax = 0.7567 ± 0.0212 µmol mg-1 min-1, Hill coefficient = 10.90 ± 2.80 and S50 = 33.35 ± 0.55 µM. Based on these parameters, the calculated intrinsic clearance for ART C was 16.63 ± 1.52 µL min-1 mg-1. The in vitro metabolism assay employing human microsomes did not fit any enzymatic kinetics models. In both microsomal models, two ART C metabolites were determined. The identification of the metabolites was performed by liquid chromatography coupled to a high resolution mass spectrometry or coupled to a multiple-stage mass spectrometry. The results revealed that both ART C metabolites were produced after a hydroxylation reaction.

The central role played by the Endoplasmic Reticulum (ER) in the correct folding and assembly of secretary and membrane proteins cannot be overstated. As the first compartment in the secretary pathway, it is responsible for the synthesis, modification and targeting of proteins to their proper destinations within the secretary pathway and the extracellular space. Protein folding in this specialized compartment is dynamic and involves a host of molecular chaperones and folding catalysts. Once inside the ER lumen, proteins fold into their native conformation and undergo a multitude of post-translational modifications, including N-linked glycosylation and disulfide oxidation. The proper conformational maturation of nascent proteins that traverse the secretary pathway is both aided and monitored by a complex process termed ER quality control. A variety of quality control mechanisms that rely on the chaperone systems operate in the ER. These act in close concert with the molecular machinery involved in degradation of non-native proteins to maintain homeostasis. The common goal of these mechanisms is to prevent expression and secretion of misfolded proteins. As a general rule, only those proteins that have successfully completed their folding and passed a stringent selection process are allowed to exit the ER on their way to their final destinations. The importance of the normal functioning of the ER is underlined by the fact that disruption in protein folding, resulting in ER stress, has now been identified as the biochemical basis of many ER storage diseases including Diabetes mellitus, Endocrinopathies and Hemophilia A. Processing events occurring inside the ER lumen are known to influence the efficiency of protein secretion. Vastly different rates of exocytose observed among secretary proteins have been found to correlate with the rate of exit from the ER. One such example is the interesting secretion property exhibited by Retinol Binding Protein (RBP) The principal carrier of retinol (Vitamin A) in plasma. RBP is a single domain protein consisting of three intramolecular disulfide bonds and helps transport retinol from the liver stores to the various target tissues in the body. Availability of its ligand, retinol, while not affecting its synthesis, is known to be the major factor in regulating RBP secretion from the liver. In the absence of retinol, apo-RBP has been shown to be retained in the ER by a hitherto unclear mechanism. Like most other secretary proteins, RBP is co-translationally targeted to the ER lumen, where it undergoes disulfide oxidation as the only modification. It has been shown to form a complex with another secretary protein, Transthyretin (TTR) in the ER and this complex formation is thought to prevent premature glomerular filtration of the otherwise small RBP with its bound retinol. Despite attaining a mature conformation, apo-RBP is not secreted and awaits conversion to its ligand-bound, holo form in order to exit the ER. It is widely believed that ligand binding may relieve this retention of RBP from the ER quality control machinery. However the precise mechanisms that mediate and regulate RBP folding, ligand binding, TTR assembly and secretion are not clearly understood. Though the folding and secretion properties of RBP have been described in HepG2 cells, its interactions with the ER resident chaperones have not been addressed. Apart from being an important cell biological question, the study of RBP assumes a lot of significance with its recent emergence as a key player in the pathogenesis of type 2 diabetes mellitus. It has been proposed that lowering of serum RBP levels could be a new strategy for treating type 2 diabetes mellitus. The present study was undertaken with the intention of analyzing the oxidative folding of RBP in the ER more closely. A systematic approach aimed at understanding the early events associated with folding and maturation of RBP, with particular emphasis on the role of ER-resident chaperones and the quality control machinery, is likely to provide interesting insights into the mechanisms involved in its ligand dependent secretion. Reconstitution of RBP biogenesis in a cell free system. The folding of RBP in cells is extremely quick with rapid oxidation kinetics. This makes it difficult to systematically analyze the early folding events in cultured cells. It was necessary to make use of a simplified system that would faithfully recapitulate the folding process in the ER. Therefore, a cell free translation system consisting of rabbit reticulocyte lysate and canine pancreatic microcosms as a source of ER-derived membranes was developed. This system affords the advantage of easy manipulation while still preserving the overall environment that prevails in the ER of intact cells. Extensive biochemical and functional characterization of the isolated microcosms was carried out and in vitro translation and microsomal translocation of RBP was established. Though initially confined to studies on membrane insertion and core glycosylate, the cell free system supplemented with microcosms has subsequently been used to analyze folding and assembly of a number of secretary and membrane proteins. A similar strategy has been adopted in the present study of RBP folding and maturation. Oxidative folding of RBP in isolated microcosms: Delineation of its disulfide oxidation pathway Using glutathione (GSSG) as the oxidant, co- and posttranslational disulfide oxidation of RBP was carried out in isolated microcosms. The ability to manipulate the redox status of this cell free system has helped to considerably slow down the oxidative folding of RBP so that a more careful analysis of the folding process could be performed. RBP was found to undergo oxidative folding with a t1/2 of 30 minutes and folding proceeded through at least one disulfide-bonded intermediate. Non-reducing SDS PAGE was used to resolve the folding intermediates. The pattern of oxidation was in good agreement with that reported earlier in HepG2 cells. No significant effect of retinol was observed on either the folding kinetics or the pattern of disulfide oxidation of RBP in isolated microsomes.A DTT sensitivity assay, used to probe the conformational maturity of folding RBP, revealed that RBP was capable of maturing into a DTT-resistant conformation in isolated microsomes. With the aid of disulfide mutants, the probable disulfide oxidation pathway of RBP in the ER has been determined. Single and double disulfide mutants of RBP were generated by site-directed mutagenesis and their posttranslational oxidation patterns were analyzed and compared with that of the wild type protein. Based on the results obtained, it was clear that the folding intermediate was made up of one of the two big disulfide loops and that the presence of both these loops was essential for RBP to fold into a fully oxidized, compact form. It has not been possible to determine the contribution of the third, smallest disulfide loop to the oxidative folding of RBP. Molecular events associated with the early oxidative folding of RBP To gain insights into the possible role of ER chaperones in the oxidative folding of RBP, the oligomeric state of folding RBP was analyzed by velocity sedimentation and chemical crosslinking assays. Velocity sedimentation analysis revealed that the reduced form of RBP was present in a large complex of size >100 S20,W. Upon disulfide oxidation, it readily dissociated from the complex and assumed a monomeric state. This was evident even during co-translational oxidation which suggested that RBP transiently associated with the large complex during its oxidative folding. Dynamic nature of this complex indicated that this could be a folding complex containing the chaperone machinery of the ER. These results were also supported by crosslinking analysis performed in unbroken microsomes using the homo-bifunctional crosslinker, DSP. The early folding forms of RBP could be crosslinked to a large complex while upon disulfide oxidation, RBP matured to its monomeric form and was no longer crosslinkable. Sedimentation and crosslinking analyses of the RBP disulfide mutants revealed that while the double disulfide mutant remained irreversibly associated with the large complex, the single mutants were released upon acquiring one of the two big disulfide loops. This suggested that despite the lack of one of the two major disulfides, these mutants were considered ‘folded’ by the quality control machinery in the ER while the double mutant probably resembled a molten globule state and was therefore considered ‘unfolded’ and irreversibly retained. Results from crosslinking analysis in microsomes not engaged in active translation suggested that chaperones of the ER were organized in a complex constitutively thereby lending support to the concept of ER-matrix, a large network of luminal proteins consisting of ER chaperones and accessory factors. Given this scenario, it is not unlikely that newly synthesized protein substrates transiently associate with this large pre-existing complex of chaperones and dissociate during late stages of their maturation. Conclusion In all, this study provides significant insights into some of the early events associated with the oxidative folding of RBP in the ER. The delineation of the disulfide oxidation pathway of RBP has been possible. The results obtained from this study suggest that RBP probably dissociates from the quality control quite early during its folding process and this step in its maturation might not be influenced by retinol. The stimulus for its ligant dependent secretion is likely to operate at a later stage of its sojourn in the ER, possibly consequent to positive cues from accessory binding factors such as TTR. Lastly, Perservation of the ER microenvironment in isolated microsomes, as evidenced from this study, augurs well for the use of this system to analyze mechanisms underlying folding, maturation, secretion and/or retention of secretory proteins.

Diss. (sammanfattning) Linköping : Linköpings universitet, 2010. / Härtill 5 uppsatser.

Verificou-se que microssomos de fígado apresentam uma atividade azo-redutásica completamente dependente de NADPH, usando DAB como substrato. Ao contrário de outros sistemas já descritos, a atividade azo-redutásica não pode ser identificada com a NADPH-citocromo c redutase, embora nossos resultados indiquem que esta enzima participa da reação. Não se pode excluir definitivamente a participação do citocromo b5 apesar de uma série de observações afastando essa possibilidade. Verificou-se que a atividade azo-redutásica pode ser induzida por tratamento com 3-MC, paralelamente à indução do citocromo P-450 tipo II. Isto sugere fortemente a participação desse citocromo na reação apesar desta não ser inibida por CO. O citocromo P-450 induzido por tratamento com 3-MC era funcionalmente ativo. A atividade azo-redutásica foi inibida especificamente pelo tratamento oral comoDAB, possibilitando a formulação de uma hipótese sobre a ação carcinogênica deste composto. Uma série de resultados mostra que a azo-redutase estudada é altamente específica podendo ser inibida por KCN e por mersalil. Face aos fatos expostos acima, as perspectivas do sistema parecem muito interessantes. A possibilidade do uso de novos métodos de fracionamento dos microssomos pode levar à resolução do sistema da azo-redutase. As semelhanças com a dessaturação de ácidos graxos, aliadas às indicações da existência de um novo tipo de citocromo P-450 que se combina com KCN, permitem descortinar maior amplitude para os limites do sistema da azo-redutase. Enfim, trata-se de uma reação de redução de um composto exógeno, com características até agora não relatadas, envolvendo processos biológicos de importância e cujo estudo terá prosseguimento. / Not available

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Afterward dried extracts of stem bark of Stryphnodendron adstringens and Lafoensia pacari, Copaifera langsdorffii oleoresin, Pterodon emarginatus essential oil and herbal medicines were incubated for one hour with rats liver microsomes to evaluate CYP3A inhibition (2.23 mg protein / mL liver microsome). All samples were dissolved in DMSO 5% and evaluated in three concentrations (high, medium, low). The analytical methods for quantification of biomarkers was appropriate after the validation for being linear, it did not show residual effect, it showed post-processing stability, and matrix effect within the ranges specified in the brazilian regulations. The method used to prepare the microsomal incubation and the method were suitable to assess the in vitro inhibition of CYP 3A. After analyzing the dried extracts and oil and oleoresin, was observed that they did not inhibit CYP3A. The absence of inhibitory activity of the extracts in oil and oleoresin isoenzyme CYP3A, although in vitro, adds relevant information about possible interference from non-traditional use of these plants on the metabolism of a large amount of drugs biotransformed by it. Among the tested herbal medicines, which showed greater inhibition of CYP3A was Monaless (O. sativa fermented by M. purpureus), which in higher concentration inhibited 31.94%, indicating that this product may lead to a possible interference when co-administered with drugs metabolized by CYP3A and may lead to drug interactions and adverse reactions. / O objetivo deste trabalho foi avaliar os efeitos inibitórios de derivados de plantas medicinais sobre a atividade de CYP450 em microssomas de fígado de rato por HPLC-PDA (cromatografia líquida de alta eficiência acoplada a detector de arranjo de diodos). Foram escolhidas quatro plantas do Cerrado para realizar o teste de inibição, pela ampla utilização popular e tradicional: Stryphnodendron adstringens Mart (barbatimão), Copaifera langsdorffii Desf (copaíba), Lafoensia pacari A.St.-Hil. (pacari) e Pterodon emarginatus Vogel (sucupira), além de outros dez fitoterápicos bastante comercializados em drogarias brasileiras. Para avaliar a inibição de CYP3A, CYP2D6, CYP2C9, CYP1A2 foram desenvolvidos e validados quatro métodos analíticos por HPLC-PDA para quantificar os substratos (marcador) e seus metabólitos. Posteriormente, extratos secos de cascas dos caules de Stryphnodendron adstringens e Lafoensia pacari, oleorresina de Copaifera langsdorfii, óleo essencial de Pterodon emarginatus e os fitoterápicos foram incubados por uma hora com microssomas hepáticos de ratos para avaliação da inibição de CYP3A (2,23 mg de proteína/mL de lisado). Todas as amostras foram dissolvidas em DMSO 5% e avaliadas em três concentrações (alta, média e baixa). Os métodos analíticos para os biomarcadores de metabolismo se mostraram adequados após a validação por serem lineares, não demonstrarem efeito residual, apresentarem estabilidade pós-processamento e efeito matriz dentro dos limites especificados em regulamentação brasileira. O método utilizado para preparar os microssomas e o método de incubação se mostraram adequados para avaliar a inibição in vitro de CYP3A. Após analisar os extratos secos, oleorresina e o óleo, observou-se que eles não inibiram significativamente a atividade da CYP3A nessas condições. A ausência de atividade inibidora dos extratos, óleo e oleorresina na isoenzima CYP3A, apesar de ser in vitro, acrescenta uma informação relevante acerca de possível não interferência do uso tradicional dessas plantas sobre o metabolismo de uma quantidade elevada de fármacos biotransformados pela mesma. Dos dez fitoterápicos testados, o que apresentou maior percentual inibitório de CYP3A foi um produto denominado Monaless® (O. sativa fermentado por M. purpureus), que na maior concentração inibiu 31,94%, indicando que que esse produto pode levar a uma possível interferência quando co-administrado com fármacos metabolizados por CYP3A, podendo levar a interações medicamentosas e reações adversas.

O Artepelin C (ART C) é um produto natural presente na própolis verde brasileira que apresenta diversas atividades biológicas. Dentre essas, destacam-se as atividades anticancerígenas, o que o torna um promissor candidato à fármaco para o tratamento de diversos tipos de câncer (pulmão, rins, cólon, testículos, próstata e leucemia). A determinação do metabolismo de um candidato a fármaco é uma das etapas primordiais no desenvolvimento do mesmo. Atualmente, modelos in vitro para a determinação do metabolismo do candidato frente às enzimas da citocromo P450 (CYP450) vem sendo largamente utilizados. Esses modelos apresentam como principais vantagens a simplicidade, o baixo custo e a ausência ou uso reduzido de animais. No presente trabalho, avaliou-se o metabolismo in vitro do ART C empregando microssomas hepáticos de ratos e de humanos, com o objetivo de caracterizar os parâmetros cinéticos enzimáticos e identificar os possíveis metabólitos formados durante o metabolismo. Para tanto, foi desenvolvido e validado um método analítico para análise do ART C em meio microssomal. A análise do ART C foi realizada por cromatografia líquida de alta eficiência, empregando coluna C18 e fase móvel composta por metanol : solução aquosa de ácido fórmico 0,1% (70:30, v/v). A vazão utilizada foi de 1,2 mL min-1 e a detecção foi realizada em 315 nm. A metodologia analítica foi validada de acordo com o guia para validação de métodos bioanalíticos da Agência Nacional de Vigilância Sanitária, avaliando-se os parâmetros seletividade, linearidade, efeito residual, limite inferior de quantificação, precisão, exatidão e estabilidade, sendo que os resultados obtidos corroboraram com as exigências do guia. A seguir, foram determinadas as condições de velocidade inicial da reação enzimática (V0), necessárias para a determinação dos parâmetros cinéticos enzimáticos do metabolismo do ART C em microssomas hepáticos de ratos e humanos. As condições de V0 determinadas foram tempo de incubação de 30 minutos e concentração proteica microssomal de 0,5 mg mL-1 para os microssomas de ratos e tempo de incubação de 40 minutos e concentração proteica microssomal de 0,5 mg mL-1 para os microssomas de humanos. O modelo microssomal de rato demonstrou um possível perfil cinético sigmoidal, adequando-se ao modelo cinético de Hill. Os parâmetros cinéticos determinados foram: Vmáx = 0,7567 ± 0,0212 µmol mg-1 min-1, coeficiente de Hill = 10,90 ± 2,80 e S50 = 33,35 ± 0,55 µM. A partir desses parâmetros obteve-se o clearance intrínseco para o ART C de 16,63 ± 1,52 µL min-1 mg-1. Para o modelo microssomal de humanos, os resultados do metabolismo do ART C não se adequaram a nenhum dos modelos cinéticos enzimáticos já descritos. Em ambos os modelos microssomais, foi possível a identificação de dois metabólitos do ART C. Para tanto, foi empregado a cromatografia liquida acoplada a espectrometria de massa de alta resolução ou acoplada a espectrometria de massa de múltiplos estágios. Os resultados revelaram que ambos os metabólitos formados são produtos de hidroxilação do ART C. / Artepillin C (ART C) is a natural product present in Brazilian green propolis, which has several biological properties. Among these ones, the anticancer properties have been highlighted, making ART C a promising drug candidate for treatment of several types of cancer (lungs, kidneys, colon, testicles, prostate and leukemia). The knowledge of a drug metabolism is one of the key stages in early drug development. Nowadays, in vitro models have been used to determine the metabolic route by the cytochrome P450 (CYP450) enzymes for a drug candidate. The main advantages of using these models are the simplicity, the relative low cost and the absence or reduced use of animals. In this project, we determined the in vitro metabolism of ART C by employing rat and human liver microsomes, in order to characterize the enzymatic kinetics parameters and to identify possible produced metabolites during the metabolism. To accomplish that, an analytical method was developed and validated for ART C analysis in microsomal medium. The ART C analysis was carried out by high performance liquid chromatography, using a C18 column and methanol : formic acid aqueous solution 0.1% (70:30, v/v) as mobile phase. The flow rate used was 1.0 mL min-1 and detection was set at 315 nm. The analytical methodology was validated according to ANVISA guideline for bioanalytical method validation. The following parameters were evaluated: selectivity, linearity, carryover, lower limit of quantification, precision, accuracy and stability, wherein the obtained results corroborate to the guides requirement. Hereafter, the initial velocity conditions for the enzymatic reaction (V0) of ART C metabolism in rat and human liver microsomes was determined. The V0 conditions were incubation time 30 minutes and microsomal protein concentration 0.5 mg mL-1 for rat microsomes and incubation time 40 minutes and microsomal protein concentration 0.5 mg mL-1 for human microsomes. The metabolism by rat liver microsomes suggested a sigmoidal profile, adapting to the Hills kinetics model. The enzymatic kinetics parameters determined were: Vmax = 0.7567 ± 0.0212 µmol mg-1 min-1, Hill coefficient = 10.90 ± 2.80 and S50 = 33.35 ± 0.55 µM. Based on these parameters, the calculated intrinsic clearance for ART C was 16.63 ± 1.52 µL min-1 mg-1. The in vitro metabolism assay employing human microsomes did not fit any enzymatic kinetics models. In both microsomal models, two ART C metabolites were determined. The identification of the metabolites was performed by liquid chromatography coupled to a high resolution mass spectrometry or coupled to a multiple-stage mass spectrometry. The results revealed that both ART C metabolites were produced after a hydroxylation reaction.