The aim of this work was to characterise the influence of adenosine on imaginal disc cell line Cl8+ of Drosophila. I prepared stable cell lines with the overexpression or RNA interference of genes coding adenosine receptor AdoR (CG9753) and adenosine transporter DmENT2 (CG11045) in D. melanogaster. These cell lines were subsequently used to test their response to extracellular adenosine signal by the measurement of cell viability and level of second messengers cAMP and Ca2+ in Cl8+ cells.

In this study, I utilized the defined (target) sequence for transcription factor NHR-25 and GFP as a marker to visualize where nhr-25 is active during the development in vivo. After obtaining worm strains carrying these constructs, the expression pattern was analyzed and the specificity of the expression was tested by means of RNAi.

Aim of this thesis was to shed light on the function(s) of Iba57 and Ssc1 proteins in both life cycle stages of T. brucei using RNA interference. Depletion of Ssc1 resulted in severe grow phenotype, decrease in activities of iron-sulphur cluster-containing enzyme aconitase but no increase in oxidative stress sensitivity or accumulation of ROS in mitochondrion. Down regulation of Iba57, specialized maturation factor of aconitase and homoaconitase, lead to depletion of aconitase, destabilization of Isa1 and increased sensitivity to oxidative stress and accumulation of ROS in both stages.

Muitas espécies de Leishmania são responsáveis por sérias doenças cutâneas e viscerais, que exibem alta incidência em regiões tropicais e subtropicais. Os medicamentos disponíveis são potencialmente carcinogênicos, requerem múltiplas administrações e a hospitalização do paciente. Um programa efetivo de desenvolvimento de novos fármacos requer a validação genética e bioquímica dos alvos. Neste contexto, uma das diferenças metabólicas mais marcantes entre os protozoários parasitas e o hospedeiro mamífero encontra-se na cadeia de síntese de purino-nucleotídeos. A enzima adenilosuccinato liase (ADSL), no hospedeiro mamífero, atua em duas etapas no metabolismo de purino-nucleotídeos: uma na via de síntese de novo e outra na via de recuperação. Esta característica particular da ADSL nos motivou a investigar como esta enzima poderia nos fornecer evidências sobre a evolução desta via metabólica em Kinetoplastida. Assim, os objetivos do presente trabalho foram validar a ADSL como potencial alvo terapêutico, através da técnica de RNA de interferência (RNAi), usando Trypanosoma brucei como modelo, bem como, caracterizar molecularmente o gene adsl-Lm e caracterizar bioquímica e estruturalmente a enzima recombinante de Leishmania major Friedlin (ADSL-Lm). Os resultados de RNAi demonstraram que a ADSL pode ser considerada um potencial alvo, uma vez que ela se apresentou essencial a viabilidade do parasita. Em relação à caracterização molecular do gene adsl-Lm suas regiões não traduzidas 5\'UTR e 3\'UTR foram definidas por RT-PCR, indicando que o RNA mensageiro maduro possui 2060 nucleotídeos. Análises com enzimas de restrição e eletroforese em campo pulsado (PFGE), seguidas de \"Southern blot\" revelaram que adsl-Lm trata-se de um gene de cópia simples e está localizado no cromossomo 4 deste parasita. O gene adsl-Lm foi clonado em um vetor de expressão e um protocolo de purificação da enzima recombinante foi estabelecido. A forma tetramérica da ADSL-Lm foi confirmada por eletroforese em gel nativo e por espalhamento dinâmico de luz (DLS). ADSL-Lm apresentou um pI experimental de 6,07 e exibiu atividade máxima no pH 8,5. Os parâmetros cinéticos de Km, Vmax , Kcat e eficiência catalítica (Kcat/Vm) foram determinados para o substrato adenilosuccinato. Experimentos de complementação funcional evidenciaram que ADSL-Lm foi capaz de complementar de maneira eficiente o genoma deficiente em ADSL da linhagem de E. coli JK268 (mutação purB58). Entretanto, esta complementação deve ocorrer na via de recuperação, uma vez que ensaios enzimáticos com o SAICAR (substrato da via de novo) mostraram que a enzima não retém atividade sobre este composto. Estes resultados indicam que provavelmente os tripanosomatídeos não representam um caso de perda da via de síntese de novo. Adicionalmente, ADSL-Lm foi cristalizada no grupo espacial tetragonal I4122, com parâmetros de cela unitária a= b= 130,023 \'angstron\', c= 316,826 \'angstron\', = = =90°. A estrutura cristalográfica da ADSL-Lm foi resolvida por SIRAS (substituição isomórfica simples com dispersão anômala) usando um cristal nativo (2.2 \'angstron\') e um derivado de Gadolínio. O monômero é composto por três domínios em um enovelamento típico das enzimas da superfamília de -eliminação e é constituído quase exclusivamente por hélices- . Para o sitio ativo, três subunidades são requeridas e os resíduos envolvidos são His 153 (ácido geral), His 231 (base geral), Gln 308, Asn 364 and Glu 369. Entretanto, sem um ligante (substrato ou inibidor) no sítio ativo torna-se difícil estudar detalhadamente as interações entre a enzima e seus dois substratos. Desta forma, experimentos de co-cristalização e modelagem molecular podem auxiliar nesta questão. / Many species of Leishmania are responsible for serious visceral or skin diseases that exhibit high incidence in tropical and subtropical regions. The drugs currently employed in the treatment of parasitic diseases are potentially carcinogenic, often require prolonged treatment and patient hospitalization. An effective program of drug design requires the validation of the potential target. In this context, one of the most striking metabolic discrepancies between Trypanosomatidae and their human hosts is the purine nucleotide biosynthesis pathway. Adenylosuccinate lyase (ADSL) is a bifunctional enzyme that catalyses two non-sequential steps in this cycle (one in the de novo purine pathway and another in the salvage pathway). This particular ADSL feature motivated us to investigate if ADSL could give us information about purine biosynthesis evolution in Kinetoplastida. Hence, the present work is aimed to validate ADSL as a potential target using the RNAi (RNAi) technique, as well as to characterize the adsl gene and the recombinant enzyme from Leishmania major Friedlin (ADSL-Lm). The RNAi results proved that ADSL can be considered a potential target, because it is shown to be essential for parasite viability. Regarding the molecular characterization of the adsl-Lm gene, the mature mRNA transcript containing 2060 nucleotides was defined by 5\' and 3\'RT-PCR. Restriction analysis and Pulse Field Gel Electrophoresis (PFGE) followed by Southern Blot hybridizations showed that adsl-Lm is a single copy gene and is located in chromosome 4 of this parasite. The adsl-Lm gene was cloned into an expression vector and a purification protocol of the recombinant enzyme was established. The tetrameric form of the recombinant ADSL-Lm enzyme was confirmed by native gel electrophoresis and Dynamic Light Scattering. ADSL-Lm has an experimental pI of 6.07 and exhibited maximum enzymatic activity at pH 8.5. The kinetic parameters of Km, Vmax , Kcat and kinetic efficiency (Kcat/Vm) were obtained for adenylosuccinate substrate. Functional complementation experiments showed that the adsl-Lm gene can effectively complement the E. coli JK268 purB58 mutation. However, this complementation must be in the salvage pathway, because enzymatic assays were performed using SAICAR (de novo pathway substrate) and ADSL-Lm did not convert this compound into product. This result indicates that probably Trypanosomatidae is not an example of de novo purine nucleotide cycle lost. In addition, ADSL-Lm was crystallized in the tetragonal I4122 space group, with unit cell parameters a= b= 130,023 \'angstron\', c= 316,826 \'angstron\', = = =90° and diffracted beyond 2.2\'angstron\'. ADSL-Lm crystal structure has been determined by SIRAS (Single Isomorphous Replacement with Anomalous Dispersion), using both native and Gadolinium derivative crystals. The ADSL-Lm monomer is composed of three domains arranged in the elongated manner typical of enzymes in the p-elimination superfamily, and is constituted almost exclusively by helices. Three subunits are necessary to form the active site cleft and the residues His 153, His 231 (general bases), Gln 308, Asn 364 and Glu 369 are involved. Without a bound inhibitor or substrate, the specific contacts made by the enzyme to its two substrates cannot be analyzed in detail. Hence, co-crystallization and docking can help in this question.

A expressão do PIF/DCD em tumores tem sido relacionada ao crescimento e resistência à morte celular e à indução de caquexia em camundongos. O objetivo deste estudo foi investigar o papel do PIF/DCD nestes processos. Foram construídos três PIF/DCD-RNAi chamados de IBC-I, II, III e pKLO (controle), compreendendo diferentes áreas do mRNA, geramos clones celulares PIF/DCD-RNAi e comparamos a expressão do mRNA por RT-PCR em tempo real. Depois, foi avaliado o crescimento e formação de colônias dos clones RNAi in vitro e a progressão tumoral in vivo em camundongo Nude. Os RNAi IBC-I, II e III reduziram a expressão em 93,25% dos transcritos do PIF/DCD, alem de reduzir em 61,7% a capacidade de formação de colônias em comparação ao controle (p<0.001). Nos experimentos in vivo, os camundongos 2 meses do grupo pKLO tiveram um retardo no desenvolvimento muscular. O grupo pKLO de 8 meses apresentou uma redução de 35% do seu peso. Ambos mostraram diminuição da massa muscular (p<0,05). Estes resultados confirmam o papel do PIF/DCD na progressão tumoral. / The PIF/DCD expression in tumors has been related to the growth and resistance to cellular death and induction of cachexia in mice. The aim of this study was to investigate the role of PIF/DCD in these processes. It was designed three PIF/DCD-RNAi named IBC-I, II and III and one control pKLO, comprising different areas of the mRNA. Next, it was generated PIF/DCD-RNAi cell clones and compared mRNA expression by RT-PCR real time. After that, we evaluated the growth and colony formation ability of RNAi clones in vitro and in vivo tumorogenicity in Nude mice. The IBC-I, II and III RNAi reduced in 93,25% the expression of transcripts for PIF/DCD. There was also a significant reduction (61,7%) in the colony formation compared to the control (p<0.001). In the in vivo experiments, the 2-month-old mice in the pKLO group had muscular development retardation. The 8-month-old pKLO group presented a 35% reduction on its weight. Both groups had shown muscular mass reduction (p<0,05). These results confirm the role of PIF/DCD in the tumoral progression.

Orientadores: Iscia Teresinha Lopes-Cendes, Ivan de Godoy Maia / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-04T19:04:59Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Pereira_TiagoCampos_D.pdf: 3895694 bytes, checksum: d999bfc92e9a2e2c757db34bbfc7d7fa (MD5) Previous issue date: 2005 / Doutorado / Genetica Animal e Evolução / Doutor em Genetica e Biologia Molecular

Orientador: Fernando Ferreira Costa / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciencias Medicas / Made available in DSpace on 2018-08-09T01:16:45Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Pinho_FlaviaOliveira_M.pdf: 5027751 bytes, checksum: 898c2b8148658647ee62a31bdfe03263 (MD5) Previous issue date: 2007 / Resumo: A AHSP é uma proteína que se liga à aHb, prevenindo a precipitação e a atividade pró-oxidante da mesma. Na presença de ßHb, o complexo protéico aHb-AHSP é desmembrado e a ßHb desloca a AHSP para formar a estrutura quartenária da hemoglobina. Em estudo com camundongos portadores de ß-talassemia com deleção do gene AHSP, foi demonstrado que estes camundongos apresentaram maior precipitação de aHb em seus eritrócitos e níveis acentuados de anemia. Adicionalmente, estudos in vitro, utilizando proteína recombinante, mostraram que quando as aHbs encontram-se estabilizadas pela AHSP, há menor produção de ROS em solução fisiológica. Desta forma, têm sido proposto que a AHSP talvez desempenhe um importante papel como modulador da gravidade clínica nas síndromes ß-talassêmicas. A relação entre a formação da hemoglobina e alterações na expressão do gene AHSP ainda é desconhecida em humanos. O estudo de tal relação molecular seria fundamental para que o papel da AHSP na eritropoese humana fosse melhor entendido, bem como embasaria futuros estudos sobre a gravidade clínica nas síndromes ß-talassêmicas em humanos. Diante disso, a relação entre a formação da hemoglobina e a diminuição da expressão do gene AHSP foi investigada neste estudo. Este trabalho teve como objetivos: induzir o silenciamento estável do gene AHSP em células humanas de linhagem eritróide, identificar possível precipitação de aHbs em células com redução na expressão do gene AHSP e investigar implicações no metabolismo celular decorrentes da diminuição significativa da expressão deste gene. Desta forma, células K562 foram transfectadas sem vetor, com vetor de expressão de short hairpin RNAs (shRNAs) para o gene AHSP e com vetor de expressão de shRNAs para uma seqüência de DNA controle não homóloga ao genoma humano através de eletroporação e de um reagente lipídico não lipossômico (Effectene®). Após a transfecção, as células passaram por um período de seleção com Neomicina. Terminado este período, o substrato Hemina foi acrescentado ao meio de cultura das células transfectadas e controle, para que a expressão de genes da linhagem eritróide fosse ativada. Amostras das culturas com Hemina foram coletadas e a expressão dos genes AHSP, a-globina, ?-globina e GATA-1 foi quantificada por real-time PCR. O silenciamento do gene AHSP, em ambos os processos de transfecção, foi significativo e acima de 70%, propiciando considerável precipitação de aHb evidenciada por imunofluorescência, bem como acentuada diminuição na produção de hemoglobina identificada através de citometria de fluxo. Além disso, por meio desta última metodologia, evidenciou-se que as células silenciadas para AHSP tiveram maior produção de ROS e maior porcentagem de marcação celular para Anexina e PI. Adicionalmente, a análise dos dados obtidos por real-time PCR demonstrou que não houve alteração significativa na expressão dos genes a-globina e ?-globina, e apenas GATA-1 apresentou expressão tardia significativa nas células silenciadas para AHSP. Finalmente, estes dados indicam que a expressão do AHSP está fortemente relacionada com a formação da hemoglobina e sugerem, pela primeira vez, que este gene codifica uma proteína de função crucial durante a eritropoese humana. Ainda, estes resultados reforçam a função da AHSP descrita previamente em modelos animais / Abstract: Alpha hemoglobin stabilizing protein (AHSP) is a chaperone protein that binds alpha hemoglobin chain (aHb), avoiding its precipitation and its pro-oxidant activity. In the presence of beta hemoglobin chain (ßHb), the aHb-AHSP complex is dismembered, ßHb displaces AHSP to generate the quaternary structure of hemoglobin. A study demonstrated that loss of AHSP exacerbates aHb precipitation and anemia in ß-thalassemic mice. Additionally, studies in vitro showed that recombinant AHSP inhibits the production of reactive oxygen species caused by aHb precipitation. Hence, it has been proposed that AHSP may perform an important role as a genetic modifier in ß-talassemia disease. The relationship between hemoglobin formation and alterations in AHSP expression has not yet been described in human cells. Studying this relationship would be strongly important for a better understanding of the AHSP role performed in human erythropoiesis, as well as would support future studies about the possibility of AHSP acts as a genetic modifier in human ß-thalassemia syndromes. Faced with the situation described above, we investigated the relationship between hemoglobin formation and reduction in AHSP expression. Our study aimed to induce the stable AHSP knockdown in erythroid human cells, identify possible aHb precipitation in cells with reduction of AHSP expression and analyze the cellular and molecular aspects resulted from AHSP knockdown in erythroid human cells. Hence, to address this goals short hairpin RNA (shRNA) expression vectors aimed at AHSP mRNA target sequence and at no-human mRNA target sequence were cloned and transfected into K562 cells using eletroporation and a non-liposomal lipid reagent. After transfection, K562 cells were cultured with neomycin which was added to select a population of cells that stably express the AHSP-shRNA. Then, K562 cells were induced to express erythroid genes by hemin addition in cell culture medium. Hemin-induced K562 cell samples were collected and AHSP, alpha-globin, gamma-globin and GATA-1 expressions were quantified by real-time PCR. The RNAi-mediated knockdown of AHSP expression was statistically significant above of 70% in both used ways for cell transfection. Further, AHSP knockdown resulted in a considerable alpha hemoglobin chain precipitation observed through immunofluorescence, as well as in a significant decrease of hemoglobin production identified through flow cytometry. Besides this, AHSP knockdown cells demonstrated an increased reactive oxygen species (ROS) production and were more positive for Annexin and Propidium Iodide (PI) than control cells in flow cytometry assays. Alpha-globin and gamma-globin expressions did not differ in control, negative and AHSP-shRNA cells. However, GATA-1 had late expression evaluated in hemin- induced AHSP-shRNA cells in relation to control and negative control cells. Finally, these data indicate that AHSP is strongly significant in hemoglobin formation and suggest that AHSP is a key chaperone protein during the human erythropoiesis. Moreover, these data strengthen the fact that AHSP stabilizes the alpha hemoglobin chain to avoid its precipitation and its ability to generate ROS which implicates in cell death as was previously described in a murine model and in vitro approaches / Mestrado / Medicina Experimental / Mestre em Fisiopatologia Médica

Orientador: Kleber Gomes Franchini / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciencias Medicas / Made available in DSpace on 2018-08-11T13:44:01Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Oliveira_MichelVazde_M.pdf: 1365391 bytes, checksum: a8c1dd22f85ed3c7df93982f678f95f7 (MD5) Previous issue date: 2008 / Resumo: Os mioblastos que formam o músculo esquelético são derivados de regiões do miótomo dos somitos. No processo de miogênese ocorre transição de estado proliferativo para um estado de diferenciação que se caracteriza por interrupção do ciclo celular, expressão de genes músculo-específico, reconhecimento célula-célula e formação de miotubos multinucleados. Para o estudo de diferenciação miogênica in vitro a linhagem celular C2C12 é um modelo bem estabelecido. Quando os mitógenos são retirados do meio de cultura (privação de soro fetal bovino), fatores de transcrição específicos são ativados, levando à diferenciação em miotubos. Na progressão do estado proliferativo para o de diferenciação participam diversas proteínas sinalizadoras. Em estudos anteriores demonstramos que a modulação da atividade da FAK tem papel crítico no processo de miogênese de células C2C12. Níveis relativamente elevados de atividade da FAK determinam a manutenção do estado proliferativo (indiferenciado) através de ativação de ciclinas. Também demonstramos que redução transitória da atividade da FAK é essencial para que as mioblastos C2C12 iniciem o processo de diferenciação terminal em miotubos. No presente estudo foi avaliada a hipótese de que a ação da tirosino-fosfatase SHP-2 determina a redução transitória da quinase de adesão focal (FAK) na transição do estado proliferativo para o estado de diferenciação no modelo de miogênese em células C2C12. A privação do soro fetal bovino induziu uma redução transiente (cerca de 80 % por ~2 horas) da fosforilação da FAK no resíduo de Tyr-397, detectada através de anticorpo fosfoespecífico anti-FAK-pY397. Não foi observada mudança na expressão da proteína FAK durante o período experimental. Experimentos de co-imunoprecipitação foram realizados para avaliar se a redução do nível de fosforilação da FAK é acompanhada de sua associação com SHP-2. Observou-se aumento de cerca de 2 vezes na associação entre FAK e SHP-2 no período coincidente com os nível baixos de fosforilação da FAK. Para avaliar o efeito da SHP-2 na redução transitória da pFAK padronizou-se o silenciamento de SHP-2 em células C2C12 nos estados de proliferação e diferenciação. Após a transfecção com siRNASHP2 nas células C2C12 foi feita a extração total de proteínas em diferentes tempos para avaliar o nível de expressão da SHP-2 no estado de proliferação. Foi observada menor expressão desta proteína após 12 horas ao período de transfecção. Depois da transfecção em meio de cultivo com o silenciamento de SHP-2 padronizados em 12 horas as células foram induzidas a se diferenciarem através da privação de soro fetal bovino. A depleção de SHP-2 aboliu a redução transiente da fosforilação da FAK. Observou-se que a depleção de SHP-2 também impediu a diferenciação terminal dos mioblastos privados de soro fetal bovino em miotubos. Esses dados sugerem que a SHP-2 modula o nível de fosforilação da FAK exercendo papel inibitório na ativação da FAK na transição das células C2C12 no estado de proliferação para diferenciação, influenciando a entrada destas células na diferenciação / Abstract: The myoblasts that form the skeletal muscle are derived from regions of the myotome of somites. In the process of myogenesis occurs transition of proliferative status to a state of differentiation which is characterised by disruption of the cell cycle, expression of muscle-specific genes, cell-cell recognition and training of myotubes multinucleate. For the study of the in vitro differentiation myogenic cell line C2C12 is a model well established. Where mitogens are moved from the culture medium (deprivation of fetal bovine serum), specific transcription factors are activated, leading to the differentiation in myotubes. The progression to the proliferative status of differentiation are involves several signaling proteins. In previous studies we showed that the modulation of the activity of FAK plays a critical role in the process of myogenesis of C2C12 cells. Relatively high levels of activity of FAK determine the maintenance of the state proliferative (indistinct) through activation of cyclin. It also demonstrated that transient reduction of the activity of FAK is essential for the myoblasts C2C12 begin the process of terminal differentiation in myotubes. In the present study was evaluated the hypothesis that the action of tirosino-phosphatase SHP-2 determines the reduction of transient focal membership of kinase (FAK) in the transition of proliferative state to the state of differentiation in the model of miogênese in C2C12 cells. The deprivation of fetal bovine serum produces a transient reduction (about 80% by ~ 2 hours) of the phosphorylation of FAK in the residue of Tyr-397, detected by antibody phsphoespecific anti-FAK-pY397. No change was observed in the expression of FAK protein during the trial period. Coimmunoprecitation experiments were performed to evaluate whether the reduction in the level of phosphorylation of FAK is accompanied by its association with SHP-2. There was an increase of about 2 times in the association between FAK and SHP-2 in the period coinciding with the low level of phosphorylation of FAK. To evaluate the effect of SHP-2 on the reduction of transient pFAK standardized up the silencing of SHP-2 in C2C12 cells in the states of proliferation and differentiation. It was observed lower expression of this protein after 12 hours the period of transfection. After Transfection in the midst of cultivation with the silencing of SHP-2 standard in 12 hours the cells were induced to differentiate by deprivation of fetal bovine serum. The depletion of SHP-2 abolished the reduction of transient phosphorylation of FAK. It was observed that the depletion of SHP-2 also prevented the terminal differentiation of myoblasts deprived of fetal bovine serum in myotubes. These data suggest that SHP-2 modulates the level of phosphorylation of FAK acting inhibitory role in the activation of FAK in the transition of C2C12 cells in the state of proliferation to differentiation, influencing the entry of these cells in the differentiation / Mestrado / Ciencias Basicas / Mestre em Clinica Medica

O Brasil é o maior produtor de laranja doce no mundo. Entretanto, a cultura enfrenta grandes problemas, devido ao ataque de pragas e doenças, o que reduz a produtividade da cultura. Entre estas doenças, destaca-se o huanglongbing (HLB), doença associada a três espécies da bactéria Candidatus Liberibacter. No Brasil, o psilídeo Diaphorina citri é o inseto transmissor do HLB. A falta de cultivares de laranja doce resistentes ao HLB torna a transformação genética de plantas uma medida em potencial para o controle desta doença. Plantas transgênicas de laranja doce expressando um RNA de dupla fita (dsRNA) de um gene essencial à sobrevivência de D. citri podem resultar no controle do inseto por meio do mecanismo de RNA de interferência. Tal mecanismo resulta na degradação do RNAm homólogo ao dsRNA. Este trabalho teve por objetivo produzir plantas transgênicas de laranja doce, expressando um fragmento do gene DcV-ATPase-A de D. citri, em uma construção gênica tipo hairpin. Dessa forma, o silenciamento gênico por RNA de interferência seria ativado no psilídeo quando este for submetido à alimentação nas plantas transgênicas. O trabalho foi iniciado com a elaboração da construção gênica contendo uma sequência repetida e invertida do gene DcV-ATPase-A de D. citri, para formação de um hairpin. Segmentos de epicótilo, provenientes de sementes germinadas in vitro das laranjas \'Hamlin\', \'Pêra\' e \'Valência\' (Citrus sinensis L. Osbeck) foram utilizados como fontes de explantes para a transformação genética via Agrobacterium tumefaciens. Paralelamente aos experimentos de transformação genética, insetos adultos de D. citri foram submetidos a experimentos de alimentação artificial, contendo RNA de dupla fita (dsRNA) ou pequenos RNA interferentes (siRNA) da DcV-ATPase-A. Ao final do período de alimentação, foram avaliadas o número de insetos vivos e a expressão relativa do RNAm da DcV-ATPase-A. Através de PCR e Southern blot, a transgenia foi confirmada em 26 e 39 plantas de laranja \'Hamlin\' e \'Valência\', respectivamente. A transgenia não foi confirmada nas plantas regeneradas de laranja \'Pêra\'. O número de inserções no transgene variou de 1 a 4 cópias. A produção dos siRNAs foi confirmada em 10 plantas de laranja \'Valência\', através de siRNA blot. O uso de dietas artificiais contendo dsRNA ou siRNA do gene DcV-ATPase-A não resultou em diferenças significativas no número de insetos vivos, ou no nível de expressão relativa do RNAm do gene DcV-ATPase-A em insetos adultos de D. citri. / Brazil is the largest sweet orange producer in the world. However, this crop faces major problems due to the attack of pests and diseases that reduce its productivity. Among the diseases, stands out the huanglongbing (HLB), disease associated with three different species of the Candidatus Liberibacter bacteria. In Brazil, the psyllid Diaphorina citri is the insect vector of HLB. The absence of resistant sweet orange cultivars to HLB makes the genetic transformation of plants a potential methodology to control this disease. Sweet orange transgenic plants engineered to express double strand RNA (dsRNA) of an essential gene for D. citri survival could result in insect control by RNA interference. This mechanism results in degradation of homologous RNAm to dsRNA. The aim of this work was to produce transgenic sweet orange plants expressing a fragment of D. citri DcV-ATPase-A gene, in a hairpin construction aiming gene silencing by RNA interference in D. citri, when fed on sweet orange transgenic plants. The work started developing a gene construct containing an inverted and repeated sequence of DcV-ATPase-A gene, to form a hairpin. Epicotyl segments collected from in vitro germinated seedlings of \'Hamlin\', \'Pêra\' and \'Valência\' sweet oranges (Citrus sinensis L. Osbeck) were used as explants for the genetic transformation experiments via Agrobacterium tumefaciens. At the same time, adults of D. citri underwent artificial diet experiments containing dsRNA or siRNA of DcV-ATPase-A. At the end of feeding time, the survival of insects and the relative expression of DcV-ATPase-A RNAm were evaluated. Through PCR and Southern blot analysis, 26 \'Hamlin\' and 39 \'Valência\' sweet orange transgenic lines were confirmed. None of the regenerated \'Pêra\' plants were transgenic. The transgenic plants had 1 to 4 T-DNA insertions. The siRNA products were observed in 10 \'Valência\' plants, through siRNA blot. The artificial diets containing dsRNA or siRNA of DcV-ATPase-A resulted in no differences in the number of live insects and in the relative expression of DcV-ATPase-A RNAm in adult insects.

A cana-de-açúcar (Saccharum spp.) é uma importante cultura na produção de alimentos e energia. Várias espécies de insetos podem causar sérios prejuízos econômicos à cultura da cana-de-açúcar. A broca da cana-de-açúcar (Diatraea saccharalis) é a praga de maior relevância por estar amplamente distribuída nas regiões canavieiras. O silenciamento gênico por RNA de interferência (RNAi) se tornou uma técnica amplamente estudada e utilizada nos mais diversos aspectos da biologia. Uma de suas aplicações é no controle de insetos-praga como uma alternativa de alta eficiência, especificidade e reduzido impacto ambiental. A ingestão de moléculas de RNA dupla fita (dsRNA) com identidade a regiões de genes essenciais de insetos-praga pode resultar no silenciamento destes genes, levando a fenótipos deficientes. Neste contexto, o presente trabalho teve como objetivo buscar genes alvos para o silenciamento com potencial para impedir o desenvolvimento normal da D. saccharalis e estabelecer uma forma de entrega do dsRNA eficiente para o teste de genes, visando assim validar o uso da técnica para a espécie. Por meio da clonagem de regiões de genes ortólogos já utilizados como alvo de silencimento em outras espécies de insetos (V-ATPase A, Receptor de Ecdisona e Arginina Kinase), e de genes com função específica identificadas após a caracterização do transcritoma de D. saccharalis (Juvenile Hormone Epoxide Hydrolase, Neverland e Quitina Sintase) foram conduzidos ensaios de RNAi. Foram realizados ensaios de dose resposta para o gene V-ATPaseem lagartas neonatas, onde a concentração selecionada por causar melhor redução na expressão do gene alvo foi de 2,5 µg µL-1. Esta concentração foi então utilizada em ensaios de alimentação para os outros genes. Os genes V-ATPase A, receptor de Ecdisona, Arginina Kinase, Juvenile Hormone Epoxide Hydrolase e Quitina Sintase apresentaram redução significativa no número de transcritos em larvas, demonstrando a viabilidade do uso de RNAi em D. saccharalisneonatas. O gene Neverland não demonstrou redução no acúmulo de transcritos nas condições trabalhadas. O gene GFP inicialmente utilizado como controle negativo apresentou variação na expressão de genes alvo, sendo desconsiderado como bom controle para D. saccharalis. O silenciamento dos genes alvo requer quantidades elevadas de dsRNA, superiores aos obtidos por transcrição in vitro, o que limita a viabilidade de ensaios com maiores replicatas e para determinar efeitos biológico. Alternativas de produção de dsRNA devem ser avaliadas para viabilizar a seleção de genes alvo efetivos / Sugarcane (Saccharum spp.) is an important crop for the production of food and bioenergy. Many insect species can cause economic losses in sugarcane. The sugarcane borer (Diatraea saccharalis) is the most important sugarcane pest, because it occurs in all production regions. Gene silencing by RNA interference (RNAi) rapidly became a widely investigated approach, adopted in various aspects of biology. One of the potential applications of RNAi is agricultural pest control, as an alternative with high efficiency, specificity and reduced environmental impact. The ingestion of double-stranded RNA (dsRNA) molecules with identity to regions of essential genes of the insect-pest can result in the target gene knock-down and, consequently, to deficient phenotypes. In the present work, target genes with the potential to affect the normal development of D. saccharaliswere searched, together with an efficient dsRNA delivery approach to test the target-genes to validate the use of the RNAi in D. saccharalis. Based on degenerated primers, expressed orthologous genes previously tested in other insect species (V-ATPase A, Ecdisone Receptor, and Arginine Kinase) were cloned,whilegenes with specific function (Juvenile Hormone Epoxide Hydrolase, Neverland, and Chitin Synthase) were identified from an in-house assembled transcriptome of D. saccharalis and cloned. A dose-response assay was conducted using the V-ATPase gene region delivered by droplets to neonate larvae, and the 2.5 µg µL-1dsRNA concentration was selected for further tests. This concentration was then used to deliver the other genes. The dsRNA version from the genes V-ATPase A, Ecdisone Receptor, Arginine Kinase, Juvenile Hormone Epoxide Hydrolase and Chitin Synthaseexhibited a significant reduction in the accumulation of transcripts, indicating the viability of RNAi to D. saccharalis in 1st instar larvae. The Neverland gene was not silenced by RNAi in the used conditions. The dsRNA of the Green Fluorescent Protein gene, used as negative control appeared to affectother gene targets. Target gene silencing require large amounts of dsRNA, more than what is achievable by in vitro transcription, which limits the viability to conduct large assays with more replicates and to determine biological effects. Alternatives to produce dsRNA need to be evaluated to enable the selection of effective target genes