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Synthesis, Characterization and Biological Evaluation of Novel (S,E)-11-[2-(Arylmethylene) Hydrazono] Pyrrolo [2,1-c] [1,4] Benzodiazepine DerivativesMingle, David 01 August 2019 (has links)
Pyrrolo [2,1-c] [1,4] benzodiazepine (PBD) is a class of natural products obtained from various actinomycetes which have both anti-tumor and antibiotic activities and can bind to specific sequences of DNA. PBD-dilactam was initially produced using isatoic anhydride and (L)-proline which was then converted to the PBD-thiolactam using Lawesson's reagent. Reaction of thiolactam with hydrazine in ethanol afforded PBD-11-hydrazinyl. Condensation of 11-hydrazinyl PBD with aldehydes possessing various substitutions was performed to obtain (S,E)-11-[2-(arylmethylene) hydrazono] pyrrolo [2,1-c] [1,4] benzodiazepine derivatives. 1HNMR, 13C-NMR, DEPT, IR, GC-MS and X-ray crystallography were used for the characterization. Inhibition activity of the products were carried out using TEM-1, AmpC and P99 β-lactamases. A minimal inhibition growth of 25% was observed for one of the selected PBDs on cancer cell line. A promising result was observed on preliminary cannabinoid binding activity test on one of the compounds.
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Screening for carbapenemase-associated biomarkers in Klebsiella oxytoca using matrixassisted laser desorption/ionization time of flight mass spectromUppström, Hannah January 2022 (has links)
Antibiotic resistant bacteria are threatening human health, and the resistance is progressingfaster than the development of new antimicrobial compounds. Antibiotic resistant infections cost enormous sums of money and resources, but most importantly human lives. Therefore, early prediction and detection of antibiotic resistance in bacteria are research areas of high priority. The use of analytical instruments such as matrix-assisted laser desorption/ionization time of flight (MALDI-TOF) mass spectrometry (MS) is a powerful tool for research in antibiotic resistant bacteria, both as quick microbe identification and for other areas in the field.Due to its relatively easy interpretable spectra provided by the soft ionization technique, and ability to ionize macromolecules without compromising sample integrity, it has also been used for biomarker screening for detection of antimicrobial resistance. Although these studies have shown promising results, the area is still progressing and needs further method development and standardized protocols. This study aimed to use MALDI-TOF MS for carbapenemaseassociated screening in Klebsiella oxytoca. The presumed key spectral peaks would derive from presence of the enzyme Verona integron-encoded metallo-β-lactamase, type 1 (VIM-1), and would not be found if VIM-1 were absent. The isolates, carrying the enzyme, used in the study were isolated from wastewater and river water in Örebro, Sweden. Bacteria genus and species was determined by MALDI-TOF identification, whereupon the microbes were tested for antibiotic susceptibility using the disk diffusion method. Carbapenem hydrolysis assay was used to confirm the presence/absence of functional carbapenemase. A genotypic confirmation was performed by polymerase chain reaction and gel electrophoresis. Mass spectra from MALDI-TOF were compared for identification of possible biomarker peaks that could indicate carbapenem resistance. Nine key mass spectral peaks were found that could potentially be used as biomarkers in future studies. The peaks differentiated two groups of Klebsiella oxytocaisolates, one group producing functional carbapenemase and one group that did not, consistent with the aim of this study.
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Raman Crystallographic Studies of Inhibitor Reactions in Class A β-LactamasesKalp, Matthew Douglas January 2009 (has links)
No description available.
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Recombinant Therapeutic Protease Production By Bacillus Sp.Korkmaz, Nuriye 01 August 2007 (has links) (PDF)
The first aim of this study is the development of extracellular recombinant therapeutic protease streptokinase producing Bacillus sp., and the second aim is to determine fermentation characteristics for streptokinase production. In this context, the signal (pre-) DNA sequence of B.licheniformis (DSM1969) extracellular serine alkaline protease enzyme gene (subC: Acc. No. X03341) was ligated to 5&rsquo / end of the streptokinase gene (skc: Acc. No. S46536) by SOE (Gene Splicing by Overlap Extension) method through PCR. The resulting hybrid gene pre(subC)::skc was cloned into the pUC19 plasmid. Then, the hybrid gene was sub-cloned to pMK4 plasmid which is an E. coli-Bacillus shuttle vector with high copy number and high stability. Recombinant plasmid pMK4::pre(subC)::skc was finally transferred into B. subtilis (npr- apr-) and B. licheniformis 749/C (ATCC 25972) species. Streptokinase production capacities of these two recombinant Bacillus species were compared. The highest production was observed in recombinant B. lichenifomis 749/C (ATCC 25972) strain in a defined medium which was optimized in terms of carbon and nitrogen sources by a statistical approach, namely Response Surface Methodology (RSM). RSM evaluated the streptokinase concentration as the response and the medium components as the independent variables. The highest recombinant streptokinase concentration was found as 0.0237 kgm-3 at glucose and (NH4)2HPO4 concentrations of 4.530 and 4.838 kgm-3 respectively. The fermentation and oxygen transfer characteristics of the streptokinase production were investigated in a 3 dm3 pilot scale batch bioreactor (Braun CT2-2) equipped with temperature, pH, foam, air inlet and agitation rate controls having a working volume of VR=1.65 dm3 using the production medium optimized for the recombinant B. lichenifomis 749/C (ATCC 25972) strain. Streptokinase and & / #946 / -lactamase activities, cell, glucose and organic acid concentrations, dissolved oxygen, pH, oxygen uptake rate, overall liquid phase mass transfer coefficient for oxygen, maintenance coefficient for oxygen, specific cell growth rate and yield coefficients were determined through the bioprocess. The bioprocess of recombinant streptokinase production was performed at uncontrolled pH of these bioreactor operation conditions: air inlet rate of Q0/VR=0.5 vvm, and the agitation rate of N=400min-1. The resulting streptokinase volumetric activity reached its maximum as 1.16 PUml-1 (0.0026 g/l streptokinase) at t=20 h.
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Extended-Spectrum ß-Lactamase-Producing Enterobacteriaceae : Antibiotic consumption, Detection and Resistance EpidemiologyÖstholm Balkhed, Åse January 2014 (has links)
ESBL-producing Enterobacteriaceae are emerging worldwide and they are frequently multi-drug resistant, thus limiting treatment options for infections caused by these pathogens. The overall aim of the thesis was to investigate ESBL-producing Enterobacteriaceae in a Swedish county. First, we developed a molecular method, a multiplex PCR assay for identification of SHV, TEM and CTX-M genes in clinical isolates of Enterobacteriaceae with an ESBL phenotype. From 2002 until the end of 2007 all isolates of ESBL-producing Enterobacteriaceae in Östergötland, Sweden were further investigated. The prevalence of ESBL-producing Enterobacteriaceae was low, <1%, but increasing,while the antibiotic consumption remained unchanged. CTX-M enzymes, particularly CTX-M group 1, dominate in our region as well as in the rest of Europe. Furthermore, we have investigated antimicrobial susceptibility by performing MIC-testing in a large, well-characterized population of CTX-M-producing E. coli. Only three oral antimicrobial agents (fosfomycin, nitrofurantoin and mecillinam) demonstrated susceptibility above 90%. High susceptibility, >90%, was also demonstrated for carbapenems, colistin, tigecycline and amikacin. Sixty-eight per cent of ESBL-producing E. coli was multi-resistant, and the most common multi-resistance pattern was the ESBL phenotype with decreased susceptibility to trimethoprim, trimethoprim-sulfamethoxazole, ciprofloxacin, gentamicin and tobramycin. Isolates belonging to CTX-M group 9 are generally more susceptible to antibiotics than the CTX-M group 1-producing E. coli. Finally, a prospective multicentre case-control study examined the prevalence of ESBL-producing Enterobacteriaceae in faecal samples before and after travel abroad and the risk factors of acquisition. Sixty-eight of 226 travellers (30%) had ESBL-producing Enterobacteriaceae in the faecal flora. The geographical area visited had the highest impact on acquisition, with highest the risk for travellers visiting the Indian subcontinent, followed by Asia and Africa north of the equator. Also, acquisition of ESBL-producing Enterobacteriaceae during travel is associated with abdominal symptoms such as diarrhoea. Age also seemed to affect the risk of acquiring ESBL-producing Enterobacteriaceae, the highest risks were found among travellers ≥ 65 years. This thesis has contributed to increased understanding of the epidemiology of ESBL-producing Enterobacteriaceae and their susceptibility to both beta-lactam and non-beta-lactam agents.
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On bacterial formats in protein library technologyLöfdahl, Per-Åke January 2009 (has links)
Millions of years of evolution have resulted in an immense number of different proteins, which participate in virtually every process within cells and thus are of utmost importance for allknown forms of life. In addition, there are several examples of natural proteins which have found use in applications outside their natural environment, such as the use of enzymes infood industry and washing powders or the use of antibodies in diagnostic, bioseparation or therapeutic applications. To improve the performance of proteins in such applications, anumber of techniques, all collectively referred to as ‘protein engineering’, are performed in thelaboratory.Traditionally, methods involving ‘rational design’, where a few alterations are introduced atspecific protein locations to hopefully result in expected improvements have been applied.However, the use of more recent techniques involving a simultaneous construction of a large number of candidate variants (protein libraries) by various diversification principles, fromwhich rare clones showing enhanced properties can be isolated have contributed greatly to thefield of protein engineering.In the present thesis, different protein traits of biotechnological importance have beenaddressed for improvements by the use of such methods, in which there is a crucial need tomaintain a clonal link between the genotype and the phenotype to allow an identification of protein library members isolated by virtue of their functional properties. In all protein library investigations included in this thesis this coupling has been obtained by Escherichia coli bacterialcell-membrane compartmental confinement.In a first study, a combination of error prone PCR and gene-shuffling was applied to the Tobacco Etch Virus (TEV)-protease gene in order to produce collections from which genesencoding variants showing an enhanced soluble expression of the enzyme frequently used inbiotechnology to cleave fusion proteins were identified. Using Green Fluorescence Protein(GFP)-based cell fluorescence analysis, a clone with a five-fold increase in the yield of solubly produced protein was successfully isolated. In a second study, a novel and different GFPbased selection system, in addition also involving targeted in vivo protein degradation principles,was employed for investigations of the substrate sequence space of the same protease. In two additional studies, a selection system denoted Protein Fragment Complementation Assay(PCA), based on the affinity driven structural complementation of a genetically split β-lactamase enzyme was used to identify variants having desired target protein binding abilities,including both specificity and affinity. Using Darwinian principles concerning clonal growth advantages, affibody binding proteins showing sub-nanomolar dissociation constants to thehuman cytokine TNF-α were isolated. Taken together, these studies have shown that the bacterial format is very well suited for use in various aspects of protein library selection. / QC 20100729
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Pneumonia associada à ventilação mecânica (PAV) por Pseudomonas aeruginosa em Unidade de Terapia Intensiva (UTI): aspectos epidemiológicos e moleculares de amostras produtoras de metalo-β-lactamasesRodrigues, Dayane Otero 25 February 2010 (has links)
Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / The incidence of infections caused by multidrug-resistant Pseudomonas aeruginosa
producing metallo-β-lactamase is increasing, especially in critically ill patients. The
objective of this study was to evaluate the incidence of ventilator associated-pneumonia
(VAP) caused by P.aeruginosa producing metallo-β-lactamase (MBL-PA) or non-MBL-PA
in patients admitted at a adult intensive care unit (ICU) of a Uberlândia Federal University
Hospital Clinic, looking epidemiologic and molecular aspects. A cohort study was
performed including 93 patients with VAP caused by P.aeruginosa from January/2004 to
November/2006. The collection of the tract respiratory superior secretions was made by the
swab-rinse sampling method and of the endotracheal aspirate when for suspicion of VAP.
In total, 40 (43%) patients had VAP by MBL-PA and 53 (57%) by non-MBL-PA. The
study was approved by the Ethical Committee of the University. The results of univariate
analysis of risk factors for MBL-PA VAP showed that the ASIS score, clinical condition in
admission, prior hospitalization, prolonged stay in the ICU, prolonged time of mechanical
ventilation, exposure of carbapenems, fluorquinolones and use of three or more antibiotics
were risk factors for VAP by MBL-PA. After logistic regression the following risk factors
continued significant: prior hospitalization and prolonged time of mechanical ventilation.
Additionally, the mortality was also independently associated with MBL-PA VAP. During
the study period we identified 40 (43%) isolates of P.aeruginosa presumptive MBL
producers according to the disk approximation tests and of the 59% of the AmpC
phenotype. Resistance to β-lactam and non-β-lactam agents was significantly higher among
MBL-PA isolates with the 82,5% of this multidrug-resistant. Only 18,8% (3/16) of MBLproducing
strains were positive for the blaSPM-1 gene. To determine the genomic diversity of
P.aeruginosa multidrug-resistant 20 isolates were analysed by macrorestriction profile
analysis following PFGE. That showed of polyclonal Pseudomonas aeruginosa (16
genotypes). Altogether the detection of horizontal dissemination was observed in three
patients (Clone A), two (Genotype C) and more two patients (Genotype E). The two
epidemic MBL-PA isolates from the outbreak in 2003 presented macrorestriction profiles
different from the endemic MBL-PA. The presence of MBL-PA in our unit indicates
problems in nosocomial infection control practice, likely associated with low adherence to
hand hygiene and especially in the abusive use of antibiotics. / A incidência de infecções causadas por Pseudomonas aeruginosa multiresistente produtora
de metalo-β-lactamase está aumentando mundialmente, especialmente em pacientes
críticos. O objetivo deste estudo foi determinar a incidência de pneumonia associada à
ventilação mecânica (PAV) por Pseudomonas aeruginosa produtora ou não de metalo-β-
lactamases em pacientes internados na Unidade de Terapia Intensiva (UTI) de adultos do
Hospital de Clínicas da Universidade Federal de Uberlândia (HC-UFU), caracterizando
aspectos epidemiológicos, dentre os quais fatores de risco dos pacientes, e moleculares das
amostras. Foi realizado um estudo de coorte incluindo 93 pacientes com PAV por
Pseudomonas aeruginosa no período de janeiro/2004 a novembro/2006. Foram realizadas
coletas de secreção de orofaringe das primeiras 48 horas de internação, depois em quatro
dias, e a seguir semanalmente, e de aspirado endotraqueal quando da indicação clínica da
pneumonia. No estudo epidemiológico, 40 (43 %) pacientes tiveram PAV por
P.aeruginosa produtora de metalo-β-lactamase (PA-MBL) e 53 (57 %) PAV por não-PAMBL,
com os seguintes fatores de risco significativos (p≤0,05) associados com PAV por
PA-MBL: escore ASIS, diagnóstico clínico na admissão, hospitalização prévia, estada
prolongada na UTI, uso prolongado de ventilação mecânica (VM), uso de carbapenemas,
fluorquinolonas e de três ou mais antibióticos, na análise univariada; e, confirmados como
independentes por análise multivariada apenas hospitalização prévia e tempo mais longo
de VM. Adicionalmente, a taxa de mortalidade foi significantemente maior no grupo de
PAV por PA-MBL, tanto na análise univariada quanto na regressão logística. Quarenta (43
%) amostras de P.aeruginosa foram identificadas como produtoras de MBL pelo teste
fenotípico de sinergismo com duplo-disco e a maioria (59 %) comportou-se como do
fenótipo AmpC. A resistência aos agentes β-lactâmicos assim como aos demais
antibióticos foi significantemente maior entre as amostras de PA-MBL, detectando-se a
presença de multiresistência na maioria (82,5%) daquelas MBL positivas. O gene blaSPM-1
foi detectado em apenas três (18,8%) das 16 amostras do fenótipo MBL testadas. O estudo
de epidemiologia molecular através da técnica de PFGE revelou a ocorrência de uma
policlonalidade (16 genótipos em 20 amostras), com evidência de transmissão cruzada em
três pacientes (clone A), dois (genótipo C) e outros dois pacientes (genótipo E) e de
similaridade entre amostras recuperadas de dois pacientes colonizados e posteriormente
infectados. As duas amostras associadas ao surto responsável pela emergência das PAMBL
em nosso hospital, diferiram das amostras de PA-MBL recuperadas em condições
endêmicas no nosso estudo. A presença destas amostras representa uma grave ameaça aos
pacientes, exigindo uma revisão quanto a uma política do uso mais racional de antibióticos
e na implementação de programas de controle e prevenção de infecções hospitalares mais
efetivos. / Doutor em Imunologia e Parasitologia Aplicadas
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Diversity of β-Lactamase Genes in Gram-Negative Soil Bacteria from Northwest OhioAlbaaj, Mohammed 26 November 2019 (has links)
No description available.
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Entfernung von β-Lactam- und Makrolid-Antibiotika aus Wässern mit Hilfe von gentechnisch modifizierten Saccharomyces cerevisiae-ZellenSchuster, Linda 07 December 2020 (has links)
Antibiotika sind für die Behandlung von bakteriellen Infektionskrankheiten in der Human- und Veterinärmedizin von immenser Bedeutung. Angesichts der Korrelation zwischen Antibiotika-Einsatzmengen und der Häufigkeit resistenter Organismen ist eine unsachgemäße bzw. übermäßige Verwendung dieser antibakteriellen Wirkstoffe sowie deren Eintrag über die Kläranlagen in die Umwelt äußerst problematisch. Neben Vermeidungs- und Verminderungsstrategien besteht ein Ansatz zur Problemlösung in der Entwicklung innovativer Technologien zur Entfernung von Antibiotikarückständen aus Wässern, da konventionelle Kläranlagen dieser Anforderung nicht vollständig genügen.
Das im Rahmen dieser Arbeit entwickelte und charakterisierte biologische Verfahren basiert auf genetisch modifizierten Saccharomyces cerevisiae-Zellen, welche spezielle Enzyme sezernieren, die zur Umsetzung von Antibiotika herangezogen werden können. Als Modellsystem diente die enzymatische Hydrolyse des β-Lactam-Antibiotikums Ampicillin mit der β-Lactamase TEM-1. Unter Verwendung von enzymhaltigen Hefe-Kulturüberständen gelang es, die grundsätzliche Eignung des Systems zur Entfernung dieses Antibiotikums nachzuweisen. Untersuchungen mit weiteren β-Lactam-Antibiotika zeigten in Übereinstimmung mit der Literatur, dass TEM-1 Penicilline und Cephalosporine der 1. Generation hydrolysieren kann. Am Beispiel der TEM-8 wurde die Übertragbarkeit des Expressionssystems auf andere Lactamase-Varianten erfolgreich demonstriert. Das erweiterte Wirkspektrum dieses Enzyms, welches neben Penicillinen auch Monobactame und Cephalosporine bis zur 4. Generation umfasst, konnte bestätigt werden. Eine mittels Histidin-tag gereinigte TEM-1-His wurde eingesetzt, um systematisch den Einfluss verschiedener Faktoren, wie Temperatur, Substratkonzentration oder pH-Wert, unbeeinflusst von der Matrix der Hefe-Kulturüberstände untersuchen zu können. In diesem Zusammenhang wurde auch die Übertragbarkeit der Ergebnisse von Modell- auf Realwässer, wie Kläranlagenzu- und -ablauf, untersucht, mit dem Ergebnis, dass zumindest die TEM-1 temporär in allen getesteten Matrices aktiv ist. Mit dem Ziel, auch weitere Antibiotikaklassen transformieren zu können, wurden Esterase Ere-A-produzierende Zellen zur Umsetzung von Makrolid-Antibiotika, wie Erythromycin, herangezogen. Die Analyse der gebildeten Transformationsprodukte ergab, dass die antibakterielle Wirkung jeweils durch hydrolytische Spaltung des β-Lactam- bzw. des Makrolid-Ringes irreversibel verloren geht. Somit kann dieses biologische Verfahren prinzipiell zur gezielten Inaktivierung von Antibiotika eingesetzt werden, wobei der größte Vorteil in der erheblichen Beschleunigung der natürlicherweise ablaufenden Umsetzungsprozesse besteht. Diese Methode kann als ergänzende Technologie bei der Aufbereitung von Konzentraten und Wässern aus Spezialanwendungen angewendet werden.:Glossar
Abkürzungsverzeichnis
Symbolverzeichnis
Kurzfassung
Abstract
1 Einleitung
1.1 Motivation
1.2 Zielstellung
2 Theoretische Grundlagen
2.1 Antibiotika und Antibiotikaresistenzen
2.1.1 Antibiotika: Definition, Bedeutung, Einsatzmengen, Klassifikation
2.1.2 Wirkmechanismen: Antibiotika versus Antibiotikaresistenzen
2.1.3 Antibiotika und antibiotikaresistente Organismen in der Umwelt
2.1.4 β-Lactam-Antibiotika
2.1.5 Resistenzen gegenüber β-Lactam-Antibiotika
2.1.6 Makrolid-Antibiotika
2.1.7 Resistenzen gegenüber Makrolid-Antibiotika
2.2 Gentechnische Methoden zur gezielten Proteinbiosynthese
2.3 Der eukaryotische Modellorganismus Saccharomyces cerevisiae
2.4 Enzymkinetik
2.5 Spurenstoffanalytik mittels LC-MS/MS-Technik
2.5.1 Einleitung, Entwicklung und Bedeutung
2.5.2 Elektrospray-Ionisation
2.5.3 Der Quadrupol als Massenanalysator
2.5.4 Analysenmodi bei der Tandem-Massenspektrometrie
3 Material und Methoden
3.1 Verwendete Geräte und Chemikalien
3.2 Arbeiten mit gentechnisch veränderte S. cerevisiae-Zellen
3.2.1 Eingesetzte S. cerevisiae-Stämme
3.2.2 Nährmedien und Kultivierung
3.3 Gewinnung von rekombinanten, in S. cerevisiae exprimierten Enzymen
3.3.1 Gewinnung von β-Lactamase-haltigen Kulturüberständen und gereinigter MFα-TEM-1-His
3.3.2 Zellaufschluss zur Gewinnung der intrazellulären Enzyme
3.4 Einsatz der rekombinanten Enzyme zur Umsetzung von β-Lactam- und Makrolid-Antibiotika
3.4.1 Herstellung und Lagerung von Antibiotika-Stammlösungen, internen Standards und Pufferlösungen
3.4.1.1 Antibiotika-Stammlösungen
3.4.1.2 Interne Standards
3.4.1.3 Herstellung von Kaliumphosphatpuffer
3.4.2 Einsatz von enzymhaltigen Kulturüberstand
3.4.2.1 Nitrocefin-Assay
3.4.2.2 Allgemeine Vorgehensweise und Standardversuchsbedingungen
3.4.2.3 Variation der Antibiotika Konzentration
3.4.2.4 Untersuchungen mit TEM-8-haltigen Kulturüberständen
3.4.3 Einsatz von gereinigter TEM-1 β-Lactamase
3.4.3.1 Proteinbestimmung
3.4.3.2 Allgemeine Vorgehensweise und Standardversuchsbedingungen
3.4.3.3 Variation der Enzymkonzentration
3.4.3.4 Einfluss der Art des Puffers
3.4.3.5 Pufferkonzentration und Leitfähigkeit
3.4.3.6 Variation des pH Wertes
3.4.3.7 Einfluss der Temperatur
3.4.3.8 Variation des eingesetzten β-Lactam-Antibiotikums (Substrat)
3.4.3.9 Variation der AMP-Konzentration
3.4.3.10 Bestimmung der Michaelis-Menten-Konstante Km bei der AMP-Umsetzung mittels TEM-1-His
3.4.3.11 Aktivität und Stabilität der TEM-1-His in Realwässern
3.4.3.12 Bestimmung der spezifischen Enzymaktivität
3.4.4 Einsatz von zellfreien Rohextrakten
3.4.4.1 Allgemeine Versuchsbedingungen
3.4.4.2 Untersuchungen zur Esterase Ere-A
3.5 LC-MS/MS-Analytik
3.5.1 Probenvorbereitung und Herstellung von Kalibrierstandards
3.5.2 HPLC-Parameter
3.5.2.1 Zusammensetzung der Eluenten
3.5.2.2 HPLC-Methoden
3.5.3 Massenspektrometrische Parameter
3.5.4 Auswertung mittels Analyst
3.5.5 Leistungsgrenzen für die qualitative und quantitative AMP Bestimmung
3.5.6 Charakterisierung von Transformationsprodukten
4 Ergebnisse und Diskussion
4.1 Einsatz von TEM-1-haltigem Kulturüberstand zur Transformation von β-Lactam-Antibiotika
4.1.1 Entwicklung einer Versuchsvorschrift zum Nachweis der Enzymaktivität gegenüber β-Lactam-Antibiotika im Kulturüberstand
4.1.1.1 Nachweis der enzymatischen Aktivität mittels Nitrocefin-Assay
4.1.1.2 Versuche mit β-Lactam-Antibiotika
4.1.1.3 Probenvorbereitung
4.1.2 Optimierung einer HPLC-MS/MS-Methode zur Quantifizierung von β-Lactam-Antibiotika unter Berücksichtigung der Probenmatrix
4.1.3 Nachweis der Antibiotika Umsetzung mit TEM-1-haltigen Kulturüberständen
4.1.4 Wirksamkeit der TEM-1-haltigen Kulturüberstände in Abhängigkeit von ausgewählten Randbedingungen
4.1.4.1 Einfluss der Enzymkonzentration
4.1.4.2 Einfluss der Leadersequenz
4.1.4.3 Einfluss des pH-Wertes
4.1.4.4 Einflüsse auf die Enzymkonzentration im Kulturüberstand
4.1.4.5 Enzymatische Stabilität bei Lagerung
4.1.4.6 Variation der Substratkonzentration
4.1.4.7 Substratspezifität
4.1.5 Zwischenfazit
4.2 Einsatz von TEM-8-haltigem-Kulturüberstand zur Transformation von β-Lactam-Antibiotika
4.2.1 Nachweis der enzymatischen Aktivität von TEM-8
4.2.1.1 Auswahl der Modellsubstanzen AMP und CEF
4.2.1.2 Versuche zum Nachweis der TEM-8-Aktivität in nicht-gepuffertem Kulturüberstand
4.2.1.3 Nachweis der TEM-8-Aktivität unter Verwendung von MES-gepuffertem Kulturmedium
4.2.2 Wirksamkeit der TEM-8-haltigen Kulturüberständen in Abhängigkeit von ausgewählten Randbedingungen
4.2.2.1 Einfluss der Leadersequenz
4.2.2.2 Einfluss des Polyhistidin-tags
4.2.2.3 Substratspezifität
4.2.3 Vergleich TEM-1 und TEM-8
4.2.3.1 Prinzipielle Unterschiede in der Kultivierung zur Gewinnung von TEM-8
4.2.3.2 Versuche zur AMP-Umsetzung
4.2.3.3 Abnahme der AMP-Konzentration in den Kontrollproben
4.2.3.4 Versuche zur CEF-Umsetzung
4.2.4 Zwischenfazit
4.3 Einsatz von isolierter TEM-1-His zur Transformation von β-Lactam-Antibiotika
4.3.1 Nachweis der Enzymaktivität
4.3.2 Wirksamkeit des Enzyms TEM-1-His in Abhängigkeit von ausgewählten Randbedingungen
4.3.2.1 Variation der Enzymkonzentration
4.3.2.2 Variation der Pufferkonzentration und Pufferart
4.3.2.3 Variation des pH-Wertes
4.3.2.4 Variation der Temperatur
4.3.2.5 Variation des Substrates
4.3.2.6 Variation der Substratkonzentration
4.3.2.7 Kinetik der enzymatischen Reaktion mit TEM-1-His
4.3.2.8 Untersuchungen zur Umsetzung in Realwässern
4.3.2.9 Langzeitstabilität der isolierten TEM-1-His
4.3.3 Zwischenfazit: spezifische enzymatische Aktivität der TEM-1-His in Abhängigkeit von verschiedenen Versuchsparametern
4.4 Einsatz von Esterase Ere-A-haltigen Rohextrakten
4.4.1 Nachweis der Enzymaktivität im Rohextrakt
4.4.2 Wirksamkeit der Esterase Ere-A in Abhängigkeit von ausgewählten Randbedingungen
4.4.2.1 Einfluss verschiedener Puffer
4.4.2.2 Einfluss von C- und N-terminal angefügten Sequenzen
4.4.2.3 Substratspezifität
4.4.3 Zwischenfazit
4.5 Charakterisierung von Transformationsprodukten
4.5.1 Vorbemerkungen
4.5.2 Transformationsprodukte bei der Umsetzung von β-Lactam-Antibiotika
4.5.3 Einsatz der Esterase Ere A zur Transformation von Makrolid-Antibiotika
4.5.3.1 Transformationsprodukte von Erythromycin
4.5.3.2 Transformationsprodukte von Clarithromycin
4.5.3.3 Transformationsprodukte von Roxithromycin
4.5.4 Zwischenfazit
5 Zusammenfassung
6 Ausblick
Literaturverzeichnis
Abbildungsverzeichnis
Tabellenverzeichnis
Anhang
A-1 Weitere Analysenmodi bei der Tandem-Massenspektrometrie
A-2 Verwendete Geräte und Chemikalien
A-3 HPLC-Methoden
A-4 Massenspektrometrische Parameter
A-5 Erster Versuch zum Nachweis der enzymatischen Aktivität von TEM-1-haltigen Kulturüberstand
A-6 Nachweis der Inhibitorwirkung von Sulbactam in Kombination mit TEM-1-His
A-7 TEM-1: Variation der Substratkonzentration
A-8 TEM-8: Substratspezifität
A-9 Vergleich der AMP-Umsetzung mit TEM-1- und TEM-8-haltigen Kulturüberständen sowie den Rohextrakten
A-10 TEM-1-His: Variation des pH-Wertes
A-11 TEM-1-His: Substratspezifität
A-12 Ere-A: Variation der Puffer
A-13 Ere-A: Substratspezifität
Selbstständigkeitserklärung / Antibiotics play an important role in human and veterinary medicine for the treatment of bacterial infectious diseases. However, regarding the known correlation between the quantities of antibiotics applied and the frequency of resistant organisms, the improper and excessive use of these antibacterial agents leads to serious problems. Their presence in the environment is largely caused by sewage systems due to their incomplete removal in conventional wastewater treatment plants. Therefore, besides avoidance and reduction strategies, one approach to address this issue is to develop innovative technologies for the removal of antibiotic residues from water.
The biological method developed and characterized within this work is based on genetically modified Saccharomyces cerevisiae cells, which secrete special enzymes that can be used for the transformation of antibiotics. The enzymatic hydrolysis of the β-lactam-antibiotic ampicillin by the β-lactamase TEM-1 was employed as a model system. By using enzyme-containing yeast culture supernatants, it was possible to prove the suitability of the developed system for the removal of the mentioned antibiotic. The obtained results with other β-lactam-antibiotics showed in accordance with the literature, that TEM-1 was able to hydrolyse penicillins and the cephalosporins of the first-generation. Taking TEM-8 as an example, the transferability of this expression system to alternative lactamase was successfully demonstrated. The activity of this enzyme toward an extended substrate spectrum, which includes not only penicillins but also monobactams and cephalosporins up to the fourth-generation, could be confirmed. The histidine-tagged purified TEM-1-His was used to systematically investigate the influence of various factors, such as temperature, substrate concentration or pH value, independently from the matrix of the yeast culture supernatants. Furthermore, the transferability of the results from model to real water (e. g. influent and effluent from a sewage treatment plant) was investigated with the result that TEM-1 was at least temporarily active in all tested matrices. In order to be able to transform other classes of antibiotics, esterase Ere-A-producing cells were employed to transform macrolide antibiotics, such as erythromycin. The analysis of the formed transformation products revealed that the antibacterial activity is irreversibly lost by the hydrolytic cleavage of the β-lactam or macrolide ring. Therefore, the biological process can be generally used for the selective inactivation of antibiotics, affording a considerable acceleration of the naturally occurring transformation process as its greatest advantage. This method is considered to be a complementary technology for the treatment of concentrates and water from special applications.:Glossar
Abkürzungsverzeichnis
Symbolverzeichnis
Kurzfassung
Abstract
1 Einleitung
1.1 Motivation
1.2 Zielstellung
2 Theoretische Grundlagen
2.1 Antibiotika und Antibiotikaresistenzen
2.1.1 Antibiotika: Definition, Bedeutung, Einsatzmengen, Klassifikation
2.1.2 Wirkmechanismen: Antibiotika versus Antibiotikaresistenzen
2.1.3 Antibiotika und antibiotikaresistente Organismen in der Umwelt
2.1.4 β-Lactam-Antibiotika
2.1.5 Resistenzen gegenüber β-Lactam-Antibiotika
2.1.6 Makrolid-Antibiotika
2.1.7 Resistenzen gegenüber Makrolid-Antibiotika
2.2 Gentechnische Methoden zur gezielten Proteinbiosynthese
2.3 Der eukaryotische Modellorganismus Saccharomyces cerevisiae
2.4 Enzymkinetik
2.5 Spurenstoffanalytik mittels LC-MS/MS-Technik
2.5.1 Einleitung, Entwicklung und Bedeutung
2.5.2 Elektrospray-Ionisation
2.5.3 Der Quadrupol als Massenanalysator
2.5.4 Analysenmodi bei der Tandem-Massenspektrometrie
3 Material und Methoden
3.1 Verwendete Geräte und Chemikalien
3.2 Arbeiten mit gentechnisch veränderte S. cerevisiae-Zellen
3.2.1 Eingesetzte S. cerevisiae-Stämme
3.2.2 Nährmedien und Kultivierung
3.3 Gewinnung von rekombinanten, in S. cerevisiae exprimierten Enzymen
3.3.1 Gewinnung von β-Lactamase-haltigen Kulturüberständen und gereinigter MFα-TEM-1-His
3.3.2 Zellaufschluss zur Gewinnung der intrazellulären Enzyme
3.4 Einsatz der rekombinanten Enzyme zur Umsetzung von β-Lactam- und Makrolid-Antibiotika
3.4.1 Herstellung und Lagerung von Antibiotika-Stammlösungen, internen Standards und Pufferlösungen
3.4.1.1 Antibiotika-Stammlösungen
3.4.1.2 Interne Standards
3.4.1.3 Herstellung von Kaliumphosphatpuffer
3.4.2 Einsatz von enzymhaltigen Kulturüberstand
3.4.2.1 Nitrocefin-Assay
3.4.2.2 Allgemeine Vorgehensweise und Standardversuchsbedingungen
3.4.2.3 Variation der Antibiotika Konzentration
3.4.2.4 Untersuchungen mit TEM-8-haltigen Kulturüberständen
3.4.3 Einsatz von gereinigter TEM-1 β-Lactamase
3.4.3.1 Proteinbestimmung
3.4.3.2 Allgemeine Vorgehensweise und Standardversuchsbedingungen
3.4.3.3 Variation der Enzymkonzentration
3.4.3.4 Einfluss der Art des Puffers
3.4.3.5 Pufferkonzentration und Leitfähigkeit
3.4.3.6 Variation des pH Wertes
3.4.3.7 Einfluss der Temperatur
3.4.3.8 Variation des eingesetzten β-Lactam-Antibiotikums (Substrat)
3.4.3.9 Variation der AMP-Konzentration
3.4.3.10 Bestimmung der Michaelis-Menten-Konstante Km bei der AMP-Umsetzung mittels TEM-1-His
3.4.3.11 Aktivität und Stabilität der TEM-1-His in Realwässern
3.4.3.12 Bestimmung der spezifischen Enzymaktivität
3.4.4 Einsatz von zellfreien Rohextrakten
3.4.4.1 Allgemeine Versuchsbedingungen
3.4.4.2 Untersuchungen zur Esterase Ere-A
3.5 LC-MS/MS-Analytik
3.5.1 Probenvorbereitung und Herstellung von Kalibrierstandards
3.5.2 HPLC-Parameter
3.5.2.1 Zusammensetzung der Eluenten
3.5.2.2 HPLC-Methoden
3.5.3 Massenspektrometrische Parameter
3.5.4 Auswertung mittels Analyst
3.5.5 Leistungsgrenzen für die qualitative und quantitative AMP Bestimmung
3.5.6 Charakterisierung von Transformationsprodukten
4 Ergebnisse und Diskussion
4.1 Einsatz von TEM-1-haltigem Kulturüberstand zur Transformation von β-Lactam-Antibiotika
4.1.1 Entwicklung einer Versuchsvorschrift zum Nachweis der Enzymaktivität gegenüber β-Lactam-Antibiotika im Kulturüberstand
4.1.1.1 Nachweis der enzymatischen Aktivität mittels Nitrocefin-Assay
4.1.1.2 Versuche mit β-Lactam-Antibiotika
4.1.1.3 Probenvorbereitung
4.1.2 Optimierung einer HPLC-MS/MS-Methode zur Quantifizierung von β-Lactam-Antibiotika unter Berücksichtigung der Probenmatrix
4.1.3 Nachweis der Antibiotika Umsetzung mit TEM-1-haltigen Kulturüberständen
4.1.4 Wirksamkeit der TEM-1-haltigen Kulturüberstände in Abhängigkeit von ausgewählten Randbedingungen
4.1.4.1 Einfluss der Enzymkonzentration
4.1.4.2 Einfluss der Leadersequenz
4.1.4.3 Einfluss des pH-Wertes
4.1.4.4 Einflüsse auf die Enzymkonzentration im Kulturüberstand
4.1.4.5 Enzymatische Stabilität bei Lagerung
4.1.4.6 Variation der Substratkonzentration
4.1.4.7 Substratspezifität
4.1.5 Zwischenfazit
4.2 Einsatz von TEM-8-haltigem-Kulturüberstand zur Transformation von β-Lactam-Antibiotika
4.2.1 Nachweis der enzymatischen Aktivität von TEM-8
4.2.1.1 Auswahl der Modellsubstanzen AMP und CEF
4.2.1.2 Versuche zum Nachweis der TEM-8-Aktivität in nicht-gepuffertem Kulturüberstand
4.2.1.3 Nachweis der TEM-8-Aktivität unter Verwendung von MES-gepuffertem Kulturmedium
4.2.2 Wirksamkeit der TEM-8-haltigen Kulturüberständen in Abhängigkeit von ausgewählten Randbedingungen
4.2.2.1 Einfluss der Leadersequenz
4.2.2.2 Einfluss des Polyhistidin-tags
4.2.2.3 Substratspezifität
4.2.3 Vergleich TEM-1 und TEM-8
4.2.3.1 Prinzipielle Unterschiede in der Kultivierung zur Gewinnung von TEM-8
4.2.3.2 Versuche zur AMP-Umsetzung
4.2.3.3 Abnahme der AMP-Konzentration in den Kontrollproben
4.2.3.4 Versuche zur CEF-Umsetzung
4.2.4 Zwischenfazit
4.3 Einsatz von isolierter TEM-1-His zur Transformation von β-Lactam-Antibiotika
4.3.1 Nachweis der Enzymaktivität
4.3.2 Wirksamkeit des Enzyms TEM-1-His in Abhängigkeit von ausgewählten Randbedingungen
4.3.2.1 Variation der Enzymkonzentration
4.3.2.2 Variation der Pufferkonzentration und Pufferart
4.3.2.3 Variation des pH-Wertes
4.3.2.4 Variation der Temperatur
4.3.2.5 Variation des Substrates
4.3.2.6 Variation der Substratkonzentration
4.3.2.7 Kinetik der enzymatischen Reaktion mit TEM-1-His
4.3.2.8 Untersuchungen zur Umsetzung in Realwässern
4.3.2.9 Langzeitstabilität der isolierten TEM-1-His
4.3.3 Zwischenfazit: spezifische enzymatische Aktivität der TEM-1-His in Abhängigkeit von verschiedenen Versuchsparametern
4.4 Einsatz von Esterase Ere-A-haltigen Rohextrakten
4.4.1 Nachweis der Enzymaktivität im Rohextrakt
4.4.2 Wirksamkeit der Esterase Ere-A in Abhängigkeit von ausgewählten Randbedingungen
4.4.2.1 Einfluss verschiedener Puffer
4.4.2.2 Einfluss von C- und N-terminal angefügten Sequenzen
4.4.2.3 Substratspezifität
4.4.3 Zwischenfazit
4.5 Charakterisierung von Transformationsprodukten
4.5.1 Vorbemerkungen
4.5.2 Transformationsprodukte bei der Umsetzung von β-Lactam-Antibiotika
4.5.3 Einsatz der Esterase Ere A zur Transformation von Makrolid-Antibiotika
4.5.3.1 Transformationsprodukte von Erythromycin
4.5.3.2 Transformationsprodukte von Clarithromycin
4.5.3.3 Transformationsprodukte von Roxithromycin
4.5.4 Zwischenfazit
5 Zusammenfassung
6 Ausblick
Literaturverzeichnis
Abbildungsverzeichnis
Tabellenverzeichnis
Anhang
A-1 Weitere Analysenmodi bei der Tandem-Massenspektrometrie
A-2 Verwendete Geräte und Chemikalien
A-3 HPLC-Methoden
A-4 Massenspektrometrische Parameter
A-5 Erster Versuch zum Nachweis der enzymatischen Aktivität von TEM-1-haltigen Kulturüberstand
A-6 Nachweis der Inhibitorwirkung von Sulbactam in Kombination mit TEM-1-His
A-7 TEM-1: Variation der Substratkonzentration
A-8 TEM-8: Substratspezifität
A-9 Vergleich der AMP-Umsetzung mit TEM-1- und TEM-8-haltigen Kulturüberständen sowie den Rohextrakten
A-10 TEM-1-His: Variation des pH-Wertes
A-11 TEM-1-His: Substratspezifität
A-12 Ere-A: Variation der Puffer
A-13 Ere-A: Substratspezifität
Selbstständigkeitserklärung
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Genesis of immune diversity and selection of catalytic antibodies : a new investigation / Genèse de la diversité immune et la sélection des anticorps catalytiques : une nouvelle investigationShahsavarian, Melody 16 October 2015 (has links)
Les anticorps catalytiques (ou abzyme) ont fait l’objet de nombreuses recherches et ont été produits pour réaliser de nombreuses réactions. Ces protéines ont été ensuite découvertes dans le sérum d’individus sains ou atteints de pathologies, dont les pathologies autoimmunes. Les études suggèrent que ces abzymes peuvent avoir des effets bénéfiques ou délétères sur la santé des individus. L’origine des anticorps catalytiques et leur rôle restent ambigus et doivent être approfondis. Nous avons développé une nouvelle stratégie visant à étudier les abzymes, basée sur la technologie du phage display. Nous avons construit 4 banques de fragments d’anticorps, chacune présentant un répertoire immun différent (fond génétique et état d’immunitaire) : saine et naïve, saine et immunisée, autoimmune et naïve, et autoimmune et immunisée. Les stratégies d’amplification et de clonage des régions variables des immunoglobulines ont été conçues afin d’optimiser la taille et la diversité des banques. Nous avons rassemblé les 4 banques en une banque unique élargie contenant 2.7×109 séquences. L’analyse des séquences a mis en évidence des différences dans les profils d’expression des sous-groupes de gènes selon la banque. Nous avons ensuite procédé à la sélection d’abzymes à activité β-lactamase en utilisant deux cibles : un peptide cyclique, et un dérivé de sulfone pénam, inhibiteurs de l’enzyme. Nous avons sélectionné 5 abzymes. Chacun de ces immunoglobulines ont des séquences protéiques propres, incluant un potentiel site actif. Ces résultats montrent que différents motifs peuvent assurer la fonction catalytique de la β-lactamase, confirmant la flexibilité moléculaire de cette enzyme. / Catalytic antibodies (or abzymes) have been the focus numerous studies for some decades and have been produced with the ability to catalyze a wide range of reactions. They have also been discovered naturally in normal physiological and pathological conditions, notably on the background of autoimmune disease. Some have beneficial effects and others are detrimental to individual’s health. Hence, the origin of abzymes and their role in the immune response are ambiguous and must be enhanced. We have developed a novel strategy for the study of abzymes based on the phage display technology. We have constructed 4 libraries representing 4 murine immune repertoires with different genetic backgrounds and immunological states : healthy and naïve, healthy and immunized, autoimmune and naïve , and autoimmune and immunized. The strategies for the amplification and cloning of the immunoglobulin (lg) variable regions have been designed to optimize the size and diversity of the libraries. We have been able to pool the four libraries to create a large repertoire of size 2.7x109. After sequence analysis, we have found a number of statistically significant differences between the libraries. We have then used two strategically chosen targets to select for antibodies endowed with β lactamase activity : a cycle peptide and a penam sulfone, both inhibitors of the enzyme. We have selected for a total of 5 lgs endowed with β lactamase activity. The selected abzymes have different amino acid sequences. 3D modeling has provides insights on potential active sites demonstrating the ability of different structures to maintain the β lactamase activity and confirming the flexibility of the active site.
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