京都大学 / 0048 / 新制・論文博士 / 博士(医学) / 乙第12920号 / 論医博第2095号 / 新制||医||1010(附属図書館) / 32130 / (主査)教授 髙橋 良輔, 教授 松田 文彦, 教授 瀬原 淳子 / 学位規則第4条第2項該当 / Doctor of Medical Science / Kyoto University / DFAM

Obwohl der Ca2+ permeable Ionenkanal TRPV2 in zahlreichen Immunzellen exprimiert wird, ist wenig über seine physiologische Funktion bekannt. Bisherige Studien verließen sich größtenteils auf die Anwendung von unspezifischen Modulatoren, TRPV2-defizienten Mäusen oder siRNA-vermittelten TRPV2-knockdown. Weder zelluläre Kompensationsmechanismen noch unspezifische Effekte können dabei ausgeschlossen werden. Daher haben wir eine etwa 5.500 Substanzen umfassende Substanzbibliothek auf niedermolekulare Modulatoren mit einer TRPV2-Aktivität untersucht. Mittels Fluoreszenz-basiertem Mediumdurchsatz-Screening und HEK293-Zellen, die stabil Ratten-TRPV2-Ionenkanäle exprimieren (HEKrTRPV2), konnten 3 strukturchemisch verwandte neuartige Inhibitoren ermittelt werden (IV2-1, IV2-2, IV2-3). Selektivitätsuntersuchen mit HEK293-Zellen, die stabil Ratten-TRPV1, Ratten-TRPV2, Maus TRPV3, Maus-TRPV4 oder Maus-TRPM3 exprimieren, zeigten, dass alle drei Substanzen eine TRPV2-Selektivität aufwiesen. Aufgrund des besseren IC50-Wertes wurde IV2-1 (IC50 = 6,3 ± 0.7 µM) als Leitstruktur ausgewählt und für weitere Untersuchungen verwendet. In Fluoreszenz-basierten Einzelzell-Ca2+-Assays von HEKrTRPV2- und RBL-2H3-Zellen, welche TRPV2 endogen exprimieren, blockierte IV2-1 durch 2 APB oder 2 APB/Probenecid induzierte TRPV2-vermittelte Ca2+-Einströme. In elektrophysiologischen Patch-Clamp-Messungen konnten 2-APB-verursachte Ein- und Auswärtsströme des TRPV2-Kanals in HEKrTRPV2- und RBL-2H3-Zellen durch IV2-1 reversibel blockiert werden. MTT Assays zur Ermittlung zytotoxischer Effekte von IV2-1 auf HEK293-, HEKrTRPV2- und RBL-2H3-Zellen ergaben keine Minderung der Zellviabilität bis zu einer Konzentration von 50 µM. Somit konnte IV2 1 als neuer, nicht toxischer TRPV2-Inhibitor validiert werden. In Zellen des angeborenen Immunsystems wie z.B. Makrophagen könnten TRPV2-vermittelte Ca2+-Signale wichtige Mechanismen wie Phagozytose und Migration beeinflussen. Um den physiologischen Einfluss von TRPV2 in primären Makrophagen zu untersuchen, wurden aus Stammzellen des Knochenmarks von Mäusen primäre Makrophagen (BMDM) differenziert. Als Bestätigung der funktionellen Expression von TRPV2-Kanälen in BMDM konnten in Fluoreszenz-basierten Einzelzell-Analysen mittels 2-APB Ca2+-Einströme ermittelt werden, welche durch Zugabe von IV2 1 blockiert wurden. Weiterhin wurde ein siRNA-vermittelter knockdown von TRPV2 in BMDM etabliert. Mittels quantitativer Polymerase-Kettenreaktion (qPCR) konnte sowohl die Expression von TRPV2-mRNA als auch der knockdown um etwa 70 Prozent in BMDM beobachtet werden. Die Kombination 2 APB/Probenecid induzierte auch in moderaten Konzentrationen einen TRPV2-vermittelten Ca2+Einstrom in BMDM, ohne zytotoxische Effekte zu verursachen. Als nächstes sollte in BMDM der Einfluss der TRPV2-Aktivität auf die Phagozytose von Zymosan- und Staphylococcus aureus-Biopartikeln untersucht werden, welche mit einem pH-sensitiven Fluoreszenzindikator gekoppelt waren. Sowohl siRNA-vermittelter knockdown von TRPV2 als auch TRPV2-Inhibition durch IV2-1 oder Valdecoxib reduzierten die Phagozytoseaktivität der BMDM auf etwa 70 Prozent im Vergleich zu unbehandelten Kontrollzellen. Diese Ergebnisse bestätigen eine Beteiligung von TRPV2 bei der Phagozytose. Anschließend wurden Transwell-Migrationsassays von BMDM in einem Gradienten aus Lipopolysacchariden (LPS) durchgeführt. Während die TRPV2-Inhibiton mit IV2 1, Valdecoxib oder ein TRPV2-knockdown die LPS-induzierte Migration von BMDM signifikant verringerte, steigerte die TRPV2-Aktivierung durch 2-APB/Probenecid die Anzahl migrierter BMDM im Vergleich zu unbehandelten Kontrollzellen signifikant. Somit konnte ebenso eine TRPV2-Beteiligung bei der Migration von Makrophagen gezeigt werden. Da Phagozytose und Migration zielgerichtete Prozesse darstellen, sollten auch die Ca2+-Signale räumlich und zeitlich koordiniert auftreten. Solche lokal begrenzten, kurzen Ca2+-Fluktuationen können durch Ca2+-Mikrodomänen verursacht werden, welche der Aktivität einzelner oder weniger Kanäle entsprechen. Mittels TIRF-Mikroskopie und eines niederaffinen Ca2+-Indikators können hohe Ca2+-Fluktuationen in unmittelbarer Nähe zur Zellmembran selektiv detektiert und somit potenzielle durch TRPV2 generierte Ca2+ Mikrodomänen in Makrophagen untersucht werden. Nach der TRPV2-Aktivierung mit 2 APB/Probenecid konnten punktuelle, hohe Ca2+ Fluktuationen in BMDM ermittelt werden, welche nach Zugabe von IV2-1 inhibiert wurden. Unter physiologischeren Bedingungen wurden zudem basal aktive Ca2+ Mikrodomänen beobachtet, welche durch IV2 1 inhibiert wurden. Dementsprechend scheint TRPV2 in BMDM basal aktive Ca2+-Mikrodomänen ausbilden zu können. Bisher konnte nur die Kombination aus 2-APB und Probenecid in moderaten Konzentrationen genutzt werden, um TRPV2-Ionenkanäle ohne zytotoxische Effekte durch hohe Konzentrationen der Einzelsubstanzen zu aktivieren. Allerdings zeigt 2-APB keine Wirkung auf humane TRPV2 Kanäle, weshalb neue Möglichkeiten der TRPV2-Aktivierung essentiell sind. Um weitere potenzierende Effekte zu untersuchen, wurde Cannabidiol (CBD) als potentester TRPV2-Aktivator aus der Gruppe der Cannabinoide in Kombination mit Probenecid untersucht. In einer zweidimensionalen Analyse von CBD- und Probenecid-Verdünnungsreihen konnte eine potenzierende Wirkung der Kombination festgestellt werden, die sowohl humane als auch Ratten TRPV2-Kanäle superadditiv aktivierte. Mittels Fluoreszenz-basierten Einzelzell-Analysen sowie elektrophysiologischen Patch-Clamp-Messungen von HEKrTRPV2- und HEKhuTRPV2-Zellen konnte dieser superadditive Effekt von CBD/Probenecid bestätigt werden. Die CBD/Probenecid-induzierte Aktivität humaner oder Ratten TRPV2-Kanäle konnte durch IV2-1 inhibiert werden, wohingegen Valdecoxib zwar Ratten-TRPV2 blockierte, jedoch humanen TRPV2 nicht vollständig inhibieren konnte. Mastzellen sind maßgeblich an der Freisetzung von allergischen und inflammatorischen Mediatoren beteiligt und stellen somit einen wichtigen Bestandteil des angeboren Immunsystems dar. Während die Ausschüttung von Leukotrienen, β-Hexosaminidase oder Histamin größtenteils IgE-vermittelt stattfindet, können davon unabhängig auch andere Signalkaskaden, wie z.B. durch MRGPRX2-vermittelt, die Degranulation von Mastzellen induzieren. Da Mastzellen ebenfalls TRPV2-Ionenkanäle exprimieren, könnte ein TRPV2-vermittelter Ca2+ Einstrom die Freisetzung von Mediatoren beeinflussen. Mit Hilfe der neuen TRPV2-Modulatoren und Fluoreszenz-basierten Einzelzell-Ca2+-Analysen wurde zunächst die endogene TRPV2-Expression in basophilen RBL-2H3-Zellen als alternatives Zellmodell zu Mastzellen bestätigt. Zudem konnten keine zytotoxischen Effekte bis zu Konzentrationen von 50 µM IV2-1 oder Valdecoxib sowie einer Kombination aus 12.5 µM CBD und 500 µM Probenecid festgestellt werden. In Fluoreszenz-basierten Einzelzell-Ca2+-Analysen konnte nach physiologischer Stimulation der Fcε-Rezeptoren ein Anstieg der intrazellulären Ca2+ Konzentration gemessen werden, der durch TRPV2-Inhibition mit IV2-1 oder Valdecoxib nicht blockiert wurde. In Untersuchungen zur Freisetzung von β-Hexosaminidase steigerte die Kombination CBD/Probenecid die Mediatorausschüttung hingegen deutlich. Dieser Effekt konnte durch TRPV2-Inhibition mit IV2-1 oder Valdecoxib inhibiert werden. Eine Kombination des TRPV2-vermittelten sowie des IgE-induzierten Stimulus führte zu einer additiv gesteigerten Freisetzung. Somit könnte TRPV2 unabhängig von der IgE-Signalkaskade eine wichtige physiologische Funktion bei der Degranulation von Mastzellen spielen. Daher wurden im nächsten Schritt primäre Mastzellen aus dem Knochenmark von Mäusen differenziert (BMMC) und die mRNA- sowie funktionelle Expression von TRPV2 durch qPCR und Fluoreszenz-basierte Ca2+-Assays bestätigt. Die verwendeten Modulatoren induzierten auch in BMMC in gleichen Konzentrationen wie in RBL 2H3-Zellen keine zytotoxischen Effekte. Die vorherigen Ergebnisse des Einflusses der TRPV2-Aktivität auf die Ausschüttung von β-Hexosaminidase konnten mit BMMC ebenso bestätigt werden. Mittels ELISA wurde zuletzt ein TRPV2-vermittelter Effekt auf die Histaminfreisetzung aus BMMC untersucht. Demnach steigerte die Kombination CBD/Probenecid die Histaminausschüttung deutlich, was durch TRPV2-Inhibition mit IV2 1 blockiert werden konnte. Auch hier hatte IV2-1 keinen Effekt auf die IgE-induzierte Histaminfreisetzung. Die simultane Stimulation der Fcε-Rezeptoren und der TRPV2-Kanäle resultierte in einer additiv gesteigerten Histaminausschüttung. Folglich scheint TRPV2-Aktivität die Freisetzung von Mediatoren wie Histamin oder β-Hexosaminidase unabhängig von der klassischen IgE-vermittelten Signalkaskade zu beeinflussen, was TRPV2 zu einer vielversprechenden Zielstruktur zur weiteren Erforschung im pathophysiologischen Kontext von entzündlichen und allergischen Reaktionen macht.

Hepatocyte Growth Factor/Scatter Factor (HGF/SF) stimulates migration of various cells and has been linked via Met tyrosine kinase signaling to transformation and the metastatic phenotype. HGF/SF-Met signaling also plays a role in malignancy. Migration of transformed MDCK-F cells depends on activation of a charybdotoxin (ChTX)-sensitive, volume-activated membrane K+ current. Patch-clamp electrophysiology and transwell migration assays were used to study the effects of HGF/SF on membrane K+ currents and cell migration in MDCK II cells. HGF/SF activated membrane K+ currents that increased over 24 hr, and these could be modulated by altering intracellular free calcium concentration [Ca2+]i. HGF/SF also significantly increased MDCK II cell migration. Specific Ca2+-activated K+ channel blockers, ChTX, iberiotoxin (IbTX), stichodactyla toxin (Stk) and clotrimazole (CLT) inhibited HGF/SF stimulation of membrane K+ currents and cell migration. This suggests that the activation of Ca2+-activated K+ channels is necessary for HGF/SF stimulation of MDCK II cell migration. Furthermore, HGF/SF induced ERK phosphorylation, and addition of the MEK inhibitor PD98059 inhibited ERK phosphorylation, as well as HGF/SF stimulation of Ca2+-activated K+ currents and cell migration in MDCK II cells. Taken together, HGF/SF induces phosphorylation of ERK, which plays a role in HGF/SF activation of Ca2+-activated K+ channels and enhancing cell migration in MDCK II cells.

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Yes / Ion channels represent a large and growing family of target proteins regulated by gasotransmitters such as nitric oxide, carbon monoxide and, as described more recently, hydrogen sulfide. Indeed, many of the biological actions of these gases can be accounted for by their ability to modulate ion channel activity. Here, we report recent evidence that H2S is a modulator of low voltage-activated T-type Ca2+ channels, and discriminates between the different subtypes of T-type Ca2+ channel in that it selectively modulates Cav3.2, whilst Cav3.1 and Cav3.3 are unaffected. At high concentrations, H2S augments Cav3.2 currents, an observation which has led to the suggestion that H2S exerts its pro-nociceptive effects via this channel, since Cav3.2 plays a central role in sensory nerve excitability. However, at more physiological concentrations, H2S is seen to inhibit Cav3.2. This inhibitory action requires the presence of the redox-sensitive, extracellular region of the channel which is responsible for tonic metal ion binding and which particularly distinguishes this channel isoform from Cav3.1 and 3.3. Further studies indicate that H2S may act in a novel manner to alter channel activity by potentiating the zinc sensitivity/affinity of this binding site. This review discusses the different reports of H2S modulation of T-type Ca2+ channels, and how such varying effects may impact on nociception given the role of this channel in sensory activity. This subject remains controversial, and future studies are required before the impact of T-type Ca2+ channel modulation by H2S might be exploited as a novel approach to pain management. / This work was supported by grants from the British Heart Foundation, the Medical Research Council, and the Hebei Medical University

No / T-type Ca2+ channels are a distinct family of low voltage-activated Ca2+ channels which serve many roles in different tissues. Several studies have implicated them, for example, in the adaptive responses to chronic hypoxia in the cardiovascular and endocrine systems. Hydrogen sulfide (H2S) was more recently discovered as an important signalling molecule involved in many functions, including O2 sensing. Since ion channels are emerging as an important family of target proteins for modulation by H2S, and both T-type Ca2+ channels and H2S are involved in cellular responses to hypoxia, we have investigated whether recombinant and native T-type Ca2+ channels are a target for modulation by H2S. Using patch-clamp electrophysiology, we demonstrate that the H2S donor, NaHS, selectively inhibits Cav3.2 T-type Ca2+ channels heterologously expressed in HEK293 cells, whilst Cav3.1 and Cav3.3 channels were unaffected. Sensitivity of Cav3.2 channels to H2S required the presence of the redox-sensitive extracellular residue H191, which is also required for tonic binding of Zn2+ to this channel. Chelation of Zn2+ using TPEN prevented channel inhibition by H2S. H2S also selectively inhibited native T-type channels (primarily Cav3.2) in sensory dorsal root ganglion neurons. Our data demonstrate a novel target for H2S regulation, the T-type Ca2+ channel Cav3.2. Results have important implications for the proposed pro-nociceptive effects of this gasotransmitter. Implications for the control of cellular responses to hypoxia await further study.

No / T-type Ca2+ channels regulate proliferation in a number of tissue types, including vascular smooth muscle and various cancers. In such tissues, up-regulation of the inducible enzyme heme oxygenase-1 (HO-1) is often observed, and hypoxia is a key factor in its induction. HO-1 degrades heme to generate carbon monoxide (CO) along with Fe2+ and biliverdin. Since CO is increasingly recognized as a regulator of ion channels (Peers et al. 2015), we have explored the possibility that it may regulate proliferation via modulation of T-type Ca2+ channels. Whole-cell patch-clamp recordings revealed that CO (applied as the dissolved gas or via CORM donors) inhibited all 3 isoforms of T-type Ca2+ channels (Cav3.1-3.3) when expressed in HEK293 cells with similar IC50 values, and induction of HO-1 expression also suppressed T-type currents (Boycott et al. 2013). CO/HO-1 induction also suppressed the elevated basal [Ca2+ ]i in cells expressing these channels and reduced their proliferative rate to levels seen in non-transfected control cells (Duckles et al. 2015). Proliferation of vascular smooth muscle cells (both A7r5 and human saphenous vein cells) was also suppressed either by T-type Ca2+ channel inhibitors (mibefradil and NNC 55-0396), HO-1 induction or application of CO. Effects of these blockers and CO were non additive. Although L-type Ca2+ channels were also sensitive to CO (Scragg et al. 2008), they did not influence proliferation. Our data suggest that HO-1 acts to control proliferation via CO modulation of T-type Ca2+ channels.

No / Lysophosphatidic acid (LPA) enhances cell migration and promotes wound healing in vivo, but the intracellular signaling pathways regulating these processes remain incompletely understood. Here we investigated the involvement of agonist-induced Ca2+ entry and STIM1 and Orai1 proteins in regulating nuclear factor of activated T cell (NFAT) signaling and LPA-induced keratinocyte cell motility. As monitored by Fluo-4 imaging, stimulation with 10 μM LPA in 60 μM Ca2+o evoked Ca2+i transients owing to store release, whereas addition of LPA in physiological 1.2 mM Ca2+o triggered store release coupled to extracellular Ca2+ entry. Store-operated Ca2+ entry (SOCE) was blocked by the SOCE inhibitor diethylstilbestrol (DES), STIM1 silencing using RNA interference (RNAi), and expression of dominant/negative Orai1R91W. LPA induced significant NFAT activation as monitored by nuclear translocation of green fluorescent protein-tagged NFAT2 and a luciferase reporter assay, which was impaired by DES, expression of Orai1R91W, and inhibition of calcineurin using cyclosporin A (CsA). By using chemotactic migration assays, LPA-induced cell motility was significantly impaired by STIM1, CsA, and NFAT2 knockdown using RNAi. These data indicate that in conditions relevant to epidermal wound healing, LPA induces SOCE and NFAT activation through Orai1 channels and promotes cell migration through a calcineurin/NFAT2-dependent pathway.