La photochimiothérapie extracorporelle (PCE) est une thérapie cellulaire prometteuse utilisée avec succès dans le traitement de pathologies impliquant des lymphocytes T (LT) telles que les lymphomes T cutanés et la GvHD. Contrairement aux immunosuppresseurs, la PCE semble induire une immunomodulation dirigée spécifiquement à l'encontre des LT « pathogènes » sans immunosuppression généralisée, cependant son mode d'action reste inconnu. Afin de comprendre ces mécanismes d'action, nous avons caractérisé dans un premier temps l'effet de la PCE sur la fonctionnalité des monocytes présents en forte proportion dans l'échantillon traité. Ils entrent en apoptose lente et les cellules encore vivantes conservent leur propriétés fonctionnelles. Dans la GvHD, nous avons montré qu'après PCE, les LT « pathogènes » activés entraient plus rapidement en apoptose que les LT « normaux » au repos. L'apoptose des LT activés est immunogène et induit la maturation des cellules dendritiques, leur conférant des propriétés de stimulation T plus fortes tout en diminuant la proportion de T régulateurs induits. Nous développons un modèle in vitro afin de mettre en évidence l'induction d'une réponse anti-clonotypique fortement suggérée par nos résultats. Enfin, en collaborant avec des pédiatres oncologues, nous avons participé au développement d'un modèle in vitro pré-clinique validant un protocole allégé de la technique pour le traitement de la GvHD en pédiatrie, conduisant à l'ouverture d'un essai clinique. Nos travaux constituent une étape clé dans la compréhension des mécanismes d'action de la PCE et contribuent à l'amélioration des pratiques cliniques et ainsi de la qualité de vie des patients.

Candida albicans est une levure commensale du tube digestif humain mais aussi un opportuniste vrai. Il est à l'origine de candidoses superficielles et de candidoses profondes avec un taux de mortalité élevé (30 à 40% des cas). La transition saprophyte-pathogène s'opère à la suite d'une baisse des défenses immunitaires de l'hôte (locales ou générales), permettant la multiplication des levures. Les travaux développés dans le laboratoire depuis les années 90, ont montré que les glycannes pariétaux des levures sont des stimuli pour la cellule macrophagique. Le but de ce travail a été de déterminer l'implication des glycannes présents dans la paroi des levures dans l'induction et la régulation de la réponse immune. Le développement de la technique de cytométrie de flux appliquée aux levures, a permis d'examiner les glycannes pariétaux susceptibles d'interagir avec la cellule hôte au moment du contact avec les macrophages. Les expériences de stimulation ont montré l'activité stimulatrice des levures vis-à-vis de cellules macrophagiques. Les résultats ont indiqué que, dépendant des récepteurs macrophagiques et des glycannes exprimés, différentes réponses cellulaires sont observées. Ainsi, S. cerevisiae, levure non pathogène, induit une réponse de type pro-inflammatoire. Des réponses cytokiniques opposées sont observées avec C. albicans. Cette balance entre réponse pro- et anti-inflammatoire dépend de la charge de levure intéragissant avec les cellules macrophagiques. Les études portant sur la modulation de l'expression glycannique de surface lors de la phagocytose des levures par les macrophages indiquent que lorsque le ratio levure/macrophage est important, l'expression des β-1,2 oligomannosides est augmentée dans le phagosome, sans exposition des β-glucanes, conduisant à une réponse cellulaire de type anti-inflammatoire. Au contraire, quand la charge en levure est limitée, les β-glucanes sont exposés, conduisant à une réponse pro-inflammatoire. Ainsi, ces résultats indiquent qu'en fonction des associations moléculaires et des ligands glycaniques, une réponse pro- ou anti-inflammatoire est élaborée. Les interactions entre les différents glycannes de la paroi de C. albicans et les récepteurs spécifiques des cellules macrophagiques sont critiques dans l'orientation de la réponse immune de l'hôte et donc dans la pathogénèse de la levure et l'infection.

Les maladies allergiques sont en constante augmentation tant en prévalence qu'en gravité. Les mécanismes physiopathologiques connus impliquent l'induction d'une réponse Th2 par les cellules dendritiques, conduisant à une production d'IgE et une inflammation. L'immunité innée a récemment été mise en avant dans le contrôle de l'immunité adaptative, spécifique de l'antigène. Cependant, le rôle des cellules Natural Killer (NK), cellules de l'immunité innée connues essentiellement pour leurs fonctions anti-tumorales et anti-microbiennes, est encore inconnu dans la pathologie allergique. Néanmoins, quelques études ont montré une modification de certaines sous-populations de cellules NK chez les patients asthmatiques allergiques. Le but général du travail de thèse était d'étudier le rôle des cellules NK dans l'asthme allergique. Dans un premier temps, les variations quantitatives et qualitatives des cellules NK, ainsi que l'effet de leur déplétion ont été évalués dans l'asthme expérimental. Dans un deuxième temps, l'effet de CCL18, chimiokine impliquée dans l'asthme allergique, a été étudié sur les cellules NK de sujets non allergiques et de sujets allergiques. Tout d'abord, le premier modèle murin d'asthme expérimental utilisé était celui très largement décrit chez les souris BALB/cByJ, consistant en deux sensibilisations systémiques d'ovalbumine (OVA) et d'alum suivies de trois provocations allergéniques d'OVA par aérosols. Chez les souris sensibilisées et provoquées à l'OVA, une augmentation du nombre de précurseurs de cellules NK, mais également du nombre de cellules NK, et plus particulièrement des cellules NK immatures, a été observé dans les ganglions médiastinaux (ganglions drainant les poumons). Celle-ci était accompagnée d'une augmentation du pourcentage de cellules NK ayant incorporé du BrdU. Outre ces variations quantitatives, nous avons également montré que les cellules NK étaient activées. Dans les poumons, le nombre de cellules NK n'était pas significativement modifié chez les souris sensibilisées et challengées à l'OVA comparativement aux souris contrôle. Néanmoins, une diminution non significative du nombre de cellules NK, et plus particulièrement des cellules NK les plus matures chez les souris sensibilisées et provoquées à l'OVA a été observée. De plus, comme dans les ganglions médiastinaux, les cellules NK pulmonaires étaient activées. Nous avons ensuite évalué l'effet de la déplétion des cellules NK par administration de l'anticorps anti-ASGM1 avant les provocations allergéniques sur l'inflammation pulmonaire allergique. Chez les souris sensibilisées et provoquées à l'OVA, la déplétion en cellules NK diminuait significativement l'éosinophilie dans les lavages bronchoalvéolaires, sans affecter pour autant l'hyperréactivité bronchique et les taux sériques d'immunoglobulines spécifiques de l'OVA (IgE, IgG2a et IgG1) (Article soumis). La déplétion des cellules NK par l'anti-ASGM1 n'étant pas totale (73%), nous avons choisi de reproduire ces expériences chez les souris NKDTR qui expriment le récepteur de la toxine diphtérique dans le promoteur du gène NKp46, permettant la déplétion spécifique et plus efficace (>90%) des cellules NK (Collaboration Pr E Vivier et Dr T Walzer). Ces souris étant de fond génétique C57BL/6, nous avons mis au point un autre modèle de sensibilisation allergique pulmonaire. Les souris ont reçu deux sensibilisations systémiques d'ovalbumine (OVA) et d'alum suivies de deux séries de trois provocations allergéniques d'OVA par voie intranasale. Dans les ganglions médiastinaux, contrairement au modèle précédent, aucune modification du nombre de cellules NK et de la distribution des sous-populations n'a été observée chez les souris sensibilisées et provoquées à l'OVA. D'un point de vue phénotypique, chez les souris sensibilisées et provoquées à l'OVA, les cellules NK étaient activées et l'expression membranaire du CD107a augmentée témoignant ainsi d'une dégranulation. Dans les poumons, le pourcentage de cellules NK les plus matures était diminué chez les souris sensibilisées et provoquées à l'OVA. Les cellules NK pulmonaires étaient également activées et l'expression membranaire de CD107a augmentée. Le pourcentage de cellules NK exprimant l'IFN-g était diminué. Concernant CCL18, cette dernière est une chimiokine produite préférentiellement au niveau du poumon. Dans le laboratoire, il a été montré que la production de CCL18 était augmentée chez les patients asthmatiques, et qu'elle recrutait les lymphocytes Th2 et les basophiles, suggérant le rôle de cette chimiokine dans l'asthme allergique. Notre objectif était d'évaluer la réponse des cellules NK isolées du sang périphérique de sujets allergiques vis-à-vis de CCL18 et de la comparer à celle de sujets non allergiques. Le récepteur de CCL18 étant encore inconnu, nous avons analysé son expression par les cellules NK par la fixation de CCL18 biotinylé. L'étude en cytométrie en flux a révélé que des cellules NK de donneurs allergiques et non allergiques exprimaient un récepteur pour CCL18. De plus, nous avons montré que les cellules NK de sujets allergiques et non allergiques migraient en réponse à CCL18, et ce dans une voie dépendante des protéines G. L'attraction des cellules NK par CCL18 était dépendante du donneur, mais indépendante du statut allergique. Aucune attraction préférentielle d'une sous-population de cellules NK (CD56hi ou CD56lo) par CCL18 n'a été mise en évidence. CCL18 était également capable de stimuler la cytotoxicité des cellules NK de sujets allergiques et de donneurs non allergiques, vis-à-vis des cellules cibles Jurkat. Les réponses étaient variables en fonction du donneur, mais une fois encore étaient indépendantes du statut allergique. Enfin, CCL18 n'induisait pas de production de cytokines (IFN-g et TNF-a) par les cellules NK de sujets allergiques et non allergiques. Au vu de l'ensemble de ces résultats, nous pouvons conclure que les cellules NK de sujets allergiques sont attirées et activées par CCL18 de façon similaire aux cellules NK de sujets non allergiques. En résumé, ces travaux ont permis de montrer que, dans un modèle murin d'asthme allergique, les cellules NK s'accumulent dans les ganglions médiastinaux et semblent réguler l'éosinophilie pulmonaire. Nous avons également montré que les cellules NK de sujets allergiques ne présentaient pas de dysfonctionnement dans la réponse vis-à-vis de CCL18 comparativement aux sujets non-allergiques.

Les myopathies inflammatoires sont un groupe de myopathies acquises caractérisées par une atteinte musculaire auto-immune. Une sous population lymphocytaire T, appelée les lymphocytes T régulateurs (Treg), joue un rôle déterminant dans la tolérance périphérique aux antigènes du soi. Dans ce travail, nous avons voulu étudier les Treg au cours des myosites afin de tenter d‟en éclaircir la physiopathologie et de dévélopper de nouvelles approches thérapeutiques. Dans un premier temps, nous avons mis au point un modèle murin de myopathie inflammatoire auto-immune. Dans ce modèle nous avons pu observer que la déplétion des Treg aggravait la myosite et qu‟à l‟inverse le transfert de Treg en diminuait la sévérité. D'autre nous avons pu observer l‟effet bénéfique de la rapamycine sur la sévérité de la myosite en permettant en particulier d‟augmenter le pourcentage de Treg. Dans un second temps nous avons étudié les Treg aux cours d‟une myosite dépourvue de traitement la myosite à inclusions (MI). Nous avons pu observer qu‟il existait un déficit en Treg dans le compartiment sanguin alors même qu‟il existait une activation Th1 du système immunitaire. L‟ensemble de ces observations nous a conduit à envisager l‟utilisation de la rapamycine au cours de la myosite à inclusions.Dans cette optique, nous avons cherché à definir quel pouvait être le meilleur marqueur de suivi de la maladie afin d‟évaluer l‟efficacité du traitement. L‟étude que nous avons menée a permis de montrer que la mesure de la force maximale isométrique des extenseurs du genou était un bon marqueur évolutif de la maladie. Ainsi, ensemble ces données permet d‟envisager la mise au point d‟un essai thérapeutique avec la rapamycine au cours de la MI.

Au cours des dernières décennies, la radiothérapie s'est imposée comme étant un outil majeur dans le traitement des cancers de la zone abdomino-pelvienne. Malgré les évolutions technologiques, la radiothérapie reste associée à des effets secondaires pouvant parfois être très handicapants, principalement dus à la toxicité des rayonnements ionisants pour les tissus sains entourant la tumeur. Dans le cadre des radiothérapies abdomino-pelviennes, ces effets secondaires vont majoritairement toucher le tractus gastro-intestinal, très sensible aux radiations. La mise au point de traitements curatifs est donc devenue une priorité. Les cellules stromales mésenchymateuses (CSM) ont montré leurs capacités de régénération tissulaire et d'immunomodulation dans de nombreux modèles. Durant ma thèse, nous avons voulu mettre en évidence le bénéfice thérapeutique apporté par les CSM dans le traitement des lésions radio-induite, ainsi que les mécanismes sous-jacents. Nos résultats nous ont permis de démontrer l'efficacité de notre traitement, avec un effet à la fois sur la structure et sur les fonctions contractiles coliques. Nous avons pu montrer que cette efficacité thérapeutique dépend de deux processus. La stimulation de la prolifération épithéliale par la voie Wnt permet ainsi d'améliorer la régénération épithéliale. Une sécrétion locale accrue de corticostérone permet quant à elle de diminuer le nombre et l'état d'activation des lymphocytes T. Nos résultats suggèrent également l'existence d'un lien entre les deux phénomènes observés, donnant une nouvelle preuve des effets combinatoires de la thérapie par CSM

La protection contre certains agents infectieux ainsi que le traitement de cancers nécessite l'induction d'une réponse cellulaire. Le développement de vaccins induisant une réponse T CD8 efficace est donc essentiel. La présentation croisée de l'antigène est importante pour l'activation de lymphocytes T CD8 spécifiques et de nombreux facteurs participent au développement d'une réponse lymphocytaire T efficace. Nous nous sommes intéressés à deux d'entre eux : la voie d'immunisation et la séquence d'aministration de l'antigène et d'un adjuvant. Nous avons développé une technique d'enrichissement des lymphocytes T CD8 spécifiques d'un antigène, ce qui a permis une étude précise de la réponse T CD8 endogène. Nous avons ensuite étudié l'influence de la voie d'immunisation sur l'efficacité de la réponse T CD8. Nous avons observé que l'injection intradermique d'un antigène cellulaire induit une réponse T CD8 plus tardive, comparée à une administration par voie systémique. Cependant, la réponse T CD8 induite par une injection locale de l'antigène est plus efficace. Puis, nous avons évalué l'influence de l'administration d'un adjuvant - le poly I:C connu pour induire la production d'interférons (IFN) de type I - en parallèle de celle de l'antigène. Nous avons montré que le moment optimal d'administration de l'adjuvant dépend de la voie d'immunisation. De plus, il existe une durée limitée durant laquelle l'adjuvant induit des effets positifs sur l'activation des lymphocytes T CD8. Nous avons identifié plusieurs effets du poly I:C et des IFN de type I sur les cellules du système immunitaire

Les antigènes exprimés sur les cellules cancéreuses peuvent être ciblées par des anticorps monoclonaux thérapeutiques (mAbs) capables, d'induire une réduction de la masse tumorale. Dans la plupart des cas, la fixation des mAbs à la surface des cellules tumorales induit, par la portion Fc, le recrutement de cellules phagocytaires et cytotoxiques qui expriment des récepteurs pour la pour la portion Fc des IgG (RFcy). Chez l'homme et chez la souris plusieurs RFcy existent et ont différentes fonctions et expression à la surface des cellules hématopoïétiques. En revanche, lequel parmi les multiples RFcy est responsable pour l'activité thérapeutique des anticorps monoclonaux n'est pas connu, ni quelle population cellulaire qui les exprime est responsable de la destruction des cellules tumorales. Au cours de ma thèse j'ai développé deux modèles d'immunothérapie à base d'anticorps monoclonaux chez la souris : un modèle syngenique (Melanome B16) et un modèle xenogenique (Cancer du sein humain BT474). Dans ces modèles, l'injection de l'anticorps murin TA99 qui reconnaît la protéine gp75 exprimée par les cellules tumorales B16, d'une part, et l'injection de l'anticorps humanisé Trastuzumab qui reconnaît le récepteur HER2 exprimé par les cellules BT474, d'autre part, induit une réduction de la masse tumorale. En utilisant ces deux modèles j'ai identifié des récepteurs murins (RFcyI/RFcyIII) et humains (RFcyI/RFcyIIA) responsables de l'activité anti tumorale de ces anticorps. De plus, j'ai identifié les neutrophiles comme population cellulaire responsable de la destruction des cellules tumorales en présence des anticorps thérapeutiques.

L'hémophilie A (HA) est une maladie hémorragique congénitale qui se traduit par un défaut en facteur VIII (FVIII) de la coagulation. Le traitement privilégié des saignements est l'administration de FVIII exogène cependant, 30% des patients développent une réponse anticorps alloimmune contre le FVIII thérapeutique qui inhibe son activité pro-coagulante. L'endocytose du FVIII par les cellules dendritiques (DC) et sa présentation aux lymphocytes T ont été documentées. Cependant, la nature des signaux de danger (SD) responsables de la maturation des DC indispensable à l'initiation de la réponse immunitaire anti-FVIII, est inconnue. Au cours de ma thèse, j'ai cherché à identifier l'origine de ces SD et envisagé 3 possibilités: Une origine liée à la structure intrinsèque du FVIII, au contexte inflammatoire avant l'administration de FVIII, ou au contexte inflammatoire généré par l'injection de FVIII. Mes résultats ont montré que le FVIII n'était pas capable d'induire la maturation de macrophages ou d'activer directement le TLR2. J'ai également écarté l'hypothèse d'un état d'activation compensatoire des plaquettes (PLT) dans un organisme privé de FVIII. En revanche, mes travaux ont mis en évidence un rôle des PLT dans l'initiation de la réponse immunitaire anti-FVIII dans le modèle murin d'HA. Mes résultats suggèrent que l'implication des PLT passe par leur activation par la thrombine générée lors de l'administration de FVIII. L'identification des médiateurs de l'inflammation issus de l'activation plaquettaire devrait ouvrir des perspectives thérapeutiques intéressantes dans le contrôle de l'inflammation au moment de l'administration de FVIII, afin de réduire son immunogénicité.

Les cytokines de la famille γc sont essentielles au développement, à la différenciation thymique et à la survie périphérique des lymphocytes T naïfs. Transmettant leurs signaux par des récepteurs qui ont en commun la chaîne γc, les interleukines -2, -7, -15 et -21 sont des facteurs solubles pléiotropes. De par leur redondance lors d'une réponse immunitaire, le rôle individuel des cytokines γc dans l'homéostasie des lymphocytes T CD8 et dans la réponse anti-virale n'a été que partiellement élucidé. De plus, l'état actuel des connaissances ne permet pas de savoir avec précision à quel moment de la différenciation et selon quels mécanismes ces cytokines interviennent. Afin d'évaluer le rôle des cytokines γc dans l'homéostasie des lymphocytes T CD8 naïfs, nous avons comparé des cellules monoclonales CD8 issues de souris TCR transgéniques P14 γc-compétentes ou γc-déficientes. Nous avons montré que les cellules T CD8 naïves γc -/- ne s'accumulent pas dans les organes lymphoïdes secondaires et que les quelques cellules résiduelles se caractérisent par une petite taille, une diminution de l'expression du CMH de classe I et une augmentation de l'apoptose. Nous avons ensuite corrigé le défaut intrinsèque de survie des cellules T CD8 γc -/-naïves, en surexprimant la molécule humaine Bcl-2, un facteur anti-apoptotique. Cette approche nous a permis de restaurer le nombre de lymphocytes T CD8 naïfs en périphérie, malgré l'absence de chaîne γc. Par contre, tout comme ce qui avait été démontré pour les cellules T CD4, l'expression de Bcl-2 ne permet pas de corriger le défaut de taille et de synthèse protéique des cellules γc-déficientes. Nous concluons donc que les cytokines γc génèrent des signaux Bcl-2-dépendants et Bcl-2-indépendants pour maintenir le phénotype et l'homéostasie des lymphocytes T CD8 naïfs. Afin de définir l'implication précise des cytokines γc au cours de la différenciation des cellules T CD8, nous avons évalué la réponse des cellules T CD8 Bcl-2+ γc +/+ ou γc -/- après infection par le virus de la chorioméningite lymphocytaire. De façon tout à fait étonnante, nous avons démontré que de nombreuses étapes de la réponse anti-virale primaire se déroulent normalement en l'absence de chaîne γc. En effet, l'expansion clonale, les changements phénotypiques associés à une activation et l'acquisition de fonctions effectrices par les lymphocytes T CD8 γc-déficients sont préservés. Par contre, les signaux dépendants de la chaîne γc s'avèrent essentiels à la différenciation et la prolifération des effecteurs tardifs ainsi qu'à la génération et le maintien des lymphocytes T CD8 mémoires. Nous proposons donc que les cytokines γc-dépendantes ne sont pas indispensables à l'acquisition de fonctions cytotoxiques et à la réponse anti-virale, mais génèrent des signaux Bcl-2-indépendants essentiels à la survie et à la prolifération des cellules T CD8 mémoires.

La pentraxine longue PTX3, récepteur soluble de l'immunité innée, joue un rôle important dans la protection contre certains pathogènes, en favorisant leur élimination et l'initiation de réponses immunitaires protectrices. PTX3 a notamment un rôle protecteur lors d'infections par Aspergillus fumigatus et Pseudomonas aeruginosa. La mucoviscidose, maladie héréditaire grave à transmission autosomique récessive, est caractérisée par des infections pulmonaires récurrentes, notamment par ces deux pathogènes. Nous avons donc émis l'hypothèse que le statut de PTX3 pourrait être altéré chez ces patients. L'expression et l'intégrité de PTX3 ont été analysées dans les expectorations de 51 patients atteints de mucoviscidose et de 7 patients atteints de broncho-pneumopathie chronique obstructive (BPCO). Les résultats montrent que la concentration de PTX3 est augmentée dans les sérums de patients atteints de mucoviscidose. Au contraire, la concentration de PTX3 dans les expectorations de patients atteints de mucoviscidose est considérablement plus faible que celle des patients atteints de BPCO. Cette faible concentration de PTX3 résulte d'un clivage protéolytique par l'élastase du neutrophile et par les protéases sécrétées par Aspergillus fumigatus. De manière intéressante, le domaine N-terminal de PTX3, impliqué dans la protection contre Aspergillus fumigatus, est préférentiellement dégradé par ces protéases. Cette dégradation est spécifique de la pentraxine longue PTX3 car les pentraxines courtes, CRP et SAP, ne sont pas dégradées. Ces résultats indiquent que la protéolyse sélective de PTX3 au niveau des voies respiratoires des patients atteints de mucoviscidose peut expliquer, en partie, les infections pulmonaires récurrentes par certains pathogènes.