Les maladies à prions sont des maladies neurodégénératives fatales, affectant de nombreuses espèces animales, dont l'homme. Elles se caractérisent par l'accumulation, notamment dans le système nerveux central, d'une isoforme anormale d'une protéine membranaire ubiquiste, la protéine prion cellulaire (PrPc). Il n'existe à l'heure actuelle aucun traitement réellement efficace. Ces dernières années, l'immunothérapie, passive et active, basée sur l'utilisation d'anticorps dirigés contre la conformation native de la PrPc et capables de bloquer sa transconformation en forme pathogène, est apparue comme une méthode prometteuse.<br />En vue d'obtenir des anticorps susceptibles d'être utilisés en immunothérapie passive chez l'homme, nous avons développé différents protocoles d'immunisation génique chez des souris de type sauvage, une technique reconnue pour favoriser la production d'anticorps dirigés contre la conformation native de l'antigène, mais souvent décrite comme peu efficace. L'injection intramusculaire par électrotransfert de l'ADNc codant la PrP humaine nous a permis d'obtenir, en augmentant fortement le niveau d'expression in vivo de la protéine, de fortes quantités d'anticorps polyclonaux contre la PrP humaine native. Ces résultats ouvrent la voie à la production d'anticorps monoclonaux puis recombinants, dans un format d'expression qu'il reste à définir pour tester et optimiser leur potentiel thérapeutique in vivo.<br />Dans le cadre d'une approche par immunothérapie active (vaccination), nous avons essayé de rompre la tolérance immunitaire vis-à-vis de la PrPc endogène chez des souris de type sauvage. La potentialisation de la réponse en anticorps spécifiques, induite par l'électrotransfert in vivo de l'ADNc de la PrP humaine, nous a permis de mettre en évidence une réaction croisée de ces anticorps avec la PrPc murine.<br />D'un point de vue général, nos résultats pourraient contribuer à ouvrir de nouvelles perspectives pour l'immunothérapie, passive et active, de nombreuses pathologies, en particulier d'autres maladies neurodégénératives, comme la maladie d'Alzheimer, ou certains cancers caractérisés par une surexpression de protéines membranaires

L'immunothérapie cellulaire passive par injection de lymphopcytes T cytotoxiques offre des possibilités thérapeutiques nouvelles dans l'immunité anti-virale et anti-tumorale. Par rapport aux méthodes actuelles de stimulation utilisant des lignées présentatrices d'antigènes, nous essayons de développer une méthode alternative d'amplification des lymphocytes T CD8 à l'aide d'une combinaison de protéines recombinantes immobilisées sur billes.<br />L'interaction 4-1BB/4-1BBL (CD137/CD137L) constitue un des signaux de co-stimulation impliqués dans l'activation des lymphocytes T CD8 effecteurs. Le travail présenté ici décrit pour la première fois la production et la caractérisation d'une forme fonctionnelle de 4-1BBL recombinant soluble. De plus, nous montrons qu'il est possible d'amplifier in vitro des lymphocytes T mémoires anti-CMV et anti-EBV avec des complexes HLA-peptide associés à ce 4-1BBL ou à de l'anticorps anti-CD28. L'intérêt de la co-stimulation du 4-1BB est comparée à celle du CD28 dans les 2 contextes antigéniques étudiés.

Le foie est un organe connu empiriquement pour sa capacité à induire une tolérance immunologique des lymphocytes T (LT). Cette propriété pourrait s'exercer en particulier visà- vis d'antigènes alimentaires drainés de l'intestin dans le foie via la veine porte. L'objectif de ce travail de thèse était d'étudier l'implication du foie dans la tolérance périphérique et en particulier la tolérance induite par voie orale, en utilisant un modèle murin d'hypersensibilité retardée de contact (HSRC) spécifique d'haptène (DNFB), induit par des LT CD8+ spécifiques. Nous avons identifié deux types cellulaires enrichis dans le foie et doués de propriétés régulatrices/tolérogènes : i) Les cellules dendritiques plasmacytoïdes, capables d'induire une tolérance des LT CD8+ in vivo et jouant un rôle clef dans l'induction de la tolérance orale, et ii) les cellules NKT capables de réguler la réponse T CD8+ aussi bien au cours de la phase afférente que de la phase efférente de la réponse immunitaire.

L'interleukine (IL)-27, constituée de EBV-induced gene 3 (EBI3) et de p28, joue un rôle important dans la régulation des réponses T. Son rôle dans la réponse B est peu connu. EBI3 est une protéine induite in vitro par l'oncogène viral LMP1 via l'activation de NF-kB. Ce travail montre qu'EBI3 est également induite par l'oncogène Tax du virus HTLV-1, de façon dépendante de NF-kB, et est exprimée in situ par les cellules tumorales dans les lymphomes EBV+ LMP1+ et dans certains lymphomes associés à l'HTLV-1, en l'absence de détection de p28. Nous montrons que l'IL-27 a des effets directs sur le lymphocyte B humain, modulés au cours de la différenciation et dépendants du type de co-stimulation. EBI3, mais pas p28, est exprimée par des cellules B du centre germinatif (CG) et par les cellules tumorales de lymphomes B d'origine du CG. Ces résultats suggèrent un rôle d'EBI3 indépendamment de son association à p28.

Au cours de la réponse immunitaire, comme au cours de la sélection thymique, les interactions cellulaires sont dépendantes de la formation d'un contact étroit entre cellules caractérisé par une synapse. De nombreuses molécules associées aux synapses neurologiques ou neuro-musculaires se sont également exprimées au niveau des cellules immunitaires et impliquées dans la régulation des contacts. Nous avons donc recherché la présence d'autres récepteurs neurologiques au niveau des cellules immunitaires. La neuropilin-1 (Np-1), responsable de la régulation de l'orientation et des contacts des neurones, a été mise en évidence à la fois sur les cellules dendritiques (DC) et les lymphocytes T (LT). De même, la sémaphorin-3A (Sema-3A), un de ces principaux ligands, est exprimée et sécrétée au niveau de ces cellules. La Np-1 est impliquée dans la formation des contacts entre les LT-DC et Thymocytes-cellules épithéliales thymiques. Sa régulation est dépendante de l'activation T médiée par le TcR et/ou par l'interleukine-7 concernant les thymocytes. La production et la sécrétion de la Sema-3A, est exclusivement dépendante de la stimulation du TcR. La Sema-3A interfère avec la prolifération des LT via l'inhibition de la polymérisation de l'actine ce qui empêche la polarisation du TcR au site du contact cellulaire. Le blocage de la Sema-3A, par des anticorps neutralisants provoque une augmentation de la prolifération T. La Sema-3A joue également un rôle au niveau de l'adhésion des thymocytes en bloquant la capacité d'adhésion de ces derniers aux molécules de la matrice extracellulaire (laminine et fibronectine). De plus, la Sema-3A induit la chemorépulsion des thymocytes Np-1 positifs.

L'asthme est une maladie inflammatoire chronique des voies aériennes dont l'incidence a augmenté dramatiquement au cours de ces deux dernières décennies. Chez les individus sensibles, cette inflammation induit des épisodes de sifflements récurrents, une oppression thoracique, une sécrétion de mucus ainsi qu'une obstruction des voies respiratoires, un recrutement éosinophilique et une hyperréactivité broncho-pulmonaire (HRB). Les avancées dans la compréhension de la physiopathologie de l'asthme ont été réalisées grâce aux modèles expérimentaux murins. Ces travaux ont mis en évidence le rôle de différentes cellules dans l'immunorégulation de l'inflammation bronchique, notamment les lymphocytes T de type Th2. Toutefois, les mécanismes immunologiques impliqués dans la protection ou l'exacerbation de la maladie sont encore peu connus. Au cours de notre étude, nous avons mis en évidence l'influence de cellules Natural Killer T invariantes (iNKT) dans le développement de l'asthme allergique expérimental. Les cellules iNKT représentent une population immunorégulatrice de lymphocytes T, caractérisée par l'expression d'une chaîne alpha invariante du TCR (Va14Ja18 et Va24Ja18, respectivement chez la souris et chez l'homme) qui est positivement sélectionnée par la molécule CD1d. Ces cellules synthétisent rapidement et massivement de nombreuses cytokines, comme l'IL-4 et l'IFN-g, lorsqu'elles sont simulées par l'a-galactosylcéramide (a-GalCer), glycolipide reconnu spécifiquement par les lymphocytes iNKT. Le spectre d'action attribué aux cellules iNKT est particulièrement large. Elles sont impliquées dans le contrôle des réponses immunes contre des infections, des maladies autoimmunes, des modèles de contact de sensibilité et des tumeurs.<br /><br />En utilisant un modèle où les souris sont immunisées de façon systémique par l'ovalbumine (OVA) et ensuite stimulées au niveau des voies aériennes par ce même antigène (étape désignée comme « challenge »), nous avons démontré que les cellules iNKT sont impliquées dans la sévérité de l'asthme allergique expérimental. En effet, divers symptômes de l'asthme sont diminués chez les souris déficientes en cellules iNKT (Ja18-/-), notamment, l'inflammation éosinophilique, la production de cytokines de type Th2, comme l'IL-4 et l'IL-5, la sécrétion d'IgE et l'HRB. L'implication des cellules iNKT dans la sévérité de l'asthme a été confirmée puisque le transfert adoptif des cellules iNKT à des souris Ja18-/- rétablit les symptômes décrits ci-dessus. <br /><br />En nous basant sur ces résultats, nous nous sommes demandés si nous pourrions modifier la sévérité de l'asthme allergique en agissant sur les lymphocytes iNKT. Pour cela, nous avons traité des souris par l'a-GalCer. Nous avons ainsi démontré qu'une seule injection d'a-GalCer 1 h avant le premier challenge intranasal à des souris précédemment immunisées inhibait la totalité des symptômes de l'asthme. L'administration intranasal de l'a-GalCer inhibe les symptômes de l'asthme chez les souris immunisées et provoquées par l'OVA. Cette protection peut être transférée chez des souris immunisées grâce à des cellules en provenance de souris traitées par l'a-GalCer. L'implication de l'IFN-g dans cette protection a été mise en évidence par des anticorps neutralisants, ainsi que par le transfert de cellules iNKT en provenance de souris IFN-g-/-. <br /><br />En conclusion, nos résultats démontrent que les cellules iNKT sont impliquées dans la sévérité de l'asthme allergique expérimental en activant la sécrétion de cytokines de type Th2 et que le traitement par l'a-GalCer, qui agit spécifiquement sur les lymphocytes iNKT, inhibe le développement de la maladie en induisant la sécrétion d'IFN-g. Ainsi, nos résultats suggèrent que l'a-GalCer pourrait constituer un nouvel outil thérapeutique dans le traitement de l'asthme allergique.

Les cellules iNKT ont des propriétés régulatrices qui suscitent un intérêt particulier en immunopathologie. Mon travail de thèse a eu pour objectif de mesurer l'impact du défaut des cellules iNKT de la souris NOD dans deux situations auto-immunes : 1) le diabète de type 1, une maladie développée spontanément par la souris NOD dans laquelle nous avons montré que les cellules iNKT, tout en constituant des cibles thérapeutiques sous l'impulsion de leur ligand a-GalCer n'ont pas d'activité protectrice spontanée; 2) l'hépatite induite par la ConA, dont la moindre susceptibilité chez la souris NOD a révélé le caractère dominant du rôle délétère de la production d'IL-4 assurée surtout par les cellules iNKT spléniques et non hépatiques et qui est directement potentialisée par l'IL-12, une cytokine qui exacerbe la maladie. En conclusion, notre travail ouvre une nouvelle voie thérapeutique tout en illustrant le caractère ambivalent « mi ange, mi démon » des cellules iNKT en situation auto-immune.

Le rôle des lymphocytes T CD4+ dans la réponse immune anti-tumorale s'est révélé être de plus en plus important au cours de ces dix dernières années. Nous nous sommes attachés à l'étude de leur fonction dans les lymphomes malins non hodgkiniens de type B. <br />Dans la première partie de ce travail de thèse, nous avons étudié un modèle à partir des cellules fraîches splénique d'un patient porteur d'un lymphome B splénique de la zone marginale. Nous avons pu déterminer un effet fonctionnel des lymphocytes T CD4+ réactifs par rapport aux cellules malignes B autologues. Ces cellules T CD4+ sont capables d'induire une différenciation des lymphocytes B tumoraux en plasmocytes, et cette induction a été dévoilée pour la première fois dans un système cellulaire autologue. <br />Nous avons ensuite étudié la capacité fonctionnelle des lymphocytes T CD4+ réactifs sur une lignée de lymphome B folliculaire obtenue dans notre laboratoire. Nous avons obtenu un effet cytotoxique par les cellules T CD4+ totales autologues venant des lymphocytes du sang périphérique. Cependant, cette cytotoxicité s'est montrée à la fois sur les cellules B malignes et les cellules B normales lymphoblastoïdes. Un clonage a été ensuite réalisé dans le but d'écarter les clones non spécifiques et de trouver des clones T cytotoxiques spécifiques des cellules malignes. Parmi les six clones obtenus, trois sont spécifiques et ils possèdent un TCR identique Vb17-Db1-Jb1.2. Ces clones exercent une cytotoxicité contre les cellules tumorales en reconnaissant l'antigène tumoral présenté par la molécule HLA-II DP et leur mécanisme de lyse correspond à la voie perforine/granzymes. <br />Ces deux résultats nous ont permis de conclure que les cellules T CD4+ peuvent induire un effet direct anti-tumoral avec des mécanismes variés. Ce travail donne de nouveaux arguments concernant le rôle pivot des lymphocytes T CD4+ dans l'immunité anti-tumorale et permet d'envisager l'identification de l'antigène tumoral.

Les conséquences immunitaires d'un stress d'origine environnementale sont complexes et encore difficilement prévisibles. Le stress affecte le système immunitaire soit en agissant sur l'immunité innée, en altérant la réactivité inflammatoire, soit en agissant sur l'immunité acquise, en modulant la production de cytokines dites Th1 et Th2. L'environnement social<br />contribue largement au développement et à l'expression de maladies. Dans les espèces sociales, la position sociale occupée dans le groupe module la susceptibilité aux infections mais les supports endocriniens et immunitaires de ces différences de susceptibilité sont ignorés. La remise en cause de l'organisation sociale engendre un stress important dont les conséquences immunitaires sont encore sujettes à controverse.<br />Ce travail de thèse a pour objectifs (1) de décrire l'influence du statut social sur le fonctionnement des systèmes endocrinien et immunitaire, (2) de préciser les effets du stress<br />social sur la production de cytokines et la susceptibilité aux infections et (3) de rechercher des facteurs à l'origine de la variabilité des conséquences immunitaires du stress social.<br />Chez le porcelet, un regroupement après le sevrage élève transitoirement le cortisol salivaire et altère le comportement mais n'affecte pas la réactivité des lymphocytes sanguins.<br />La suite des travaux a utilisé une procédure de défaite sociale chronique chez la souris. Les résultats obtenus mettent en évidence une influence du statut social. En absence de stress, les<br />dominants présentent des niveaux de base de corticostérone et une réponse spécifique à la tuberculine supérieurs aux dominés. Suite à une défaite sociale, les dominants sont plus affectés que les dominés. La défaite sociale augmente la réactivité inflammatoire mais ne modifie pas de façon nette l'équilibre de la production de cytokines de type Th1 et Th2 et n'affecte pas l'immunité spécifique développée contre une infection mycobactérienne. Les conséquences immunitaires de la défaite sociale ne sont observées que lorsque le stress est associé à des combats et à des blessures. Ces travaux montrent que la réponse au stress dépend de l'histoire sociale de l'individu, en particulier de son statut social. De plus, les<br />répercussions immunitaires du stress dépendent aussi de l'histoire immunitaire récente. En effet, une réaction inflammatoire systémique inhibe la libération plasmatique de cytokines<br />inflammatoires en réponse à un stress psychologique ultérieur.

Les cellules immunitaires infiltrant le foie (CD3+, CD4+, CD8+, CD20+, CD56+, TCRγδ+, FoxP3+ et CD123+) sont plus nombreuses (p<0.05) dans les zones cirrhotiques comparés aux zones tumorales dans les 2 cas d'hépatocarcinomes (induits par l'hépatite C (HCC-HCV) ou par l'alcool (HCC-OH)). Les niveaux d'expressions tumoraux de CD8β dans le groupe HCC-HCV et CD8α et IFN-γ dans le groupe HCC-OH sont plus élevés (p<0.05) que ceux des zones cirrhotiques. Les comparaisons des cirrhoses cancéreuses montrent que les cellules CD3+, CD4+, CD8+, CD20+, FoxP3+, CD123+ et TCRγδ+ (p=0.089) ainsi que les ratios CD3/CD20, FoxP3/CD4 sont plus élevés (p<0.05) dans la cirrhose HCV que dans celle OH. Les niveaux d'expression de l'IFN-γ, CD8α et de la perforine sont plus faibles (p<0.05) dans la cirrhose HCV que dans la cirrhose OH. De plus, le nombre de cellules CD8+ est corrélée avec celui de cellules FoxP3+ dans les nodules parenchymateux pour la cirrhose HCV alors qu'il l'est avec le niveau d'expression de l'IFN-γ et de la perforine pour la cirrhose OH. Les résultats concernant les HCC-HCV et les cirrhoses C sans cancer montrent que les cellules CD3+, CD4+, CD20+ et CD8+ sont plus nombreuses dans la cirrhose cancéreuse (p<0.05) mais que le nombre de cellules CD56+ (p=0.067) et le rapport CD3/CD20 (p<0.05) est plus bas dans la cirrhose cancéreuse. Le TGF-β et l'IFN-γ sont corrélés dans la cirrhose C. Aucune différence n'a été observée à l'intérieur des tumeurs dans les 2 groupes au niveau cellulaire et transcriptionnel, à l'exception du niveau de CD8α, plus bas dans le groupe HCC-HCV (p<0.05). Le nombre intra-tumoral de cellules FoxP3+ est corrélé positivement avec celui des cellules CD4 et CD8+ et négativement avec l'expression tumorale de la perforine. Dans les tumeurs, des corrélations positives entre le nombre de cellules CD4+ et CD8+, CD56+ et TCRγδ+, perforine avec IFN-γ et RANTES ont aussi été observées. Il est important de noter que les cellules CD3+ sont presque toujours corrélées avec les CD20+ dans toutes les zones et les groupes. Concernant la relation immunité-agressivité tumorale, les niveaux d'ALAT, d'AFP et le score METAVIR sont corrélés avec les cellules CD3+, CD4+ et TCRγδ+ dans le groupe HCC-HCV. La taille des tumeurs est corrélée avec l'age dans les 2 groupes et avec l'expression de FoxP3 dans le groupe HCC-HCV. La nécrose tumorale est plus importante (p<0.05) dans le groupe HCC-OH et inversement corrélée avec l'age et l'expression de RANTES dans les 2 groupes. Le marquage Ki67 est corrélé positivement avec les ALAT, AFP, PT et la virémie et inversement avec le niveau de perforine intra-tumoral. Dans les 2 groupes, le nombre de cellules FoxP3+ est inversement corrélé avec le taux de bilirubine. La rechute est plus fréquente (p<0.05) dans le groupe HCC-HCV. Pour les patients rechuteurs, le nombre de cellules CD3+, CD4+, CD8+, CD20+ et FoxP3+ est plus élevé (p<0.05) dans les zones cirrhotiques alors que le nombre de cellules CD123+ et le rapport FoxP3+/CD4+ sont plus élevés (p<0.05) dans la tumeur. De plus, une réduction significative de la fréquence des cellules NK et du rapport CD56bright/dim est observée pour l'hépatite C comparé à la B. La proportion intra-hépatique de cellules NK CD158a,h+ et CD158b,j+ est plus basse que dans le sang périphérique chez les patients HCV+ et que dans le foie des patients HBV+. La fréquence des NK NKG2A+ est plus basse dans le sang et le foie des patients HBV+ comparativement aux HCV+. Pour les patients HCV+, i) les cellules CD56+ intra-hépatiques se localisent préférentiellement hors des nécroses lorsque l'activité nécro-inflammatoire augmente et ii) les cellules circulantes CD3-CD56brightNKG2A+ corrèlent positivement avec l'extension de la nécro-inflammation et de la fibroses. De plus, chez les patients HCV+ chroniques, les cellules FoxP3+ situées dans les zones nécro-inflammatoires sont majoritairement associées aux cellules T CD8+ et positivement corrélées avec les cellules CD8+ et le score METAVIR de fibrose. Globalement, beaucoup de cellules infiltrant les tumeurs semblent être moins actives et associées avec la rechute et un mauvais pronostic. Les cellules NK et régulatrices dans l'hépatite C chronique pourraient donc être d'un grand intérêt dans le suivi de la maladie.