Les MICI (maladies inflammatoires chroniques de l'intestin) invalident 200 000 personnes en France. La région Nord-Pas-de-Calais est particulièrement touchée par ces affections et les traitements disponibles pour ces pathologies demeurent coûteux et peu nombreux. Des études récentes ont suggéré que le système endocannabinoïde, exprimé au seing du tractus gastro-intestinal, est une cible thérapeutique prometteuse pour le traitement des MICI. Ce système se compose des récepteurs aux cannabinoïdes CB1 et CB2, des ligands endogènes de ces récepteurs, notamment l'anandamide et le 2-arachidonoylglycérol et des protéines impliquées dans l'anabolisme et le catabolisme des ligands. L'anandamide a présenté des capacités à prévenir la colite induite par le TNBS à des rongeurs. Toutefois, in vivo ce composé possède un temps de demi-vie court et est rapidement dégradé par une amidase à sérine, la FAAH (Fatty Acid Amide Hydrolase). Nous avons ainsi envisagé la conception, la synthèse et l'évaluation pharmacologique de nouveau inhibiteurs de la FAAH. L'une de nos molécules, le composé 95, présentant une CI50 sur l'enzyme de 88 nM a ensuite été injectée par voie intrapéritonéale à des souris dont la colite a été induite trois jours plus tard par l'injection intrarectale de TNBS. L'évaluation des scores macroscopiques et microscopiques des dommages causés sur le côlon par l'agent irritant a ensuite été effectuée. L'inflammation du côlon a été significativement réduite chez le groupe de souris ayant été traité par le composé 95, montrant que l'inhibition de la FAAH est une stratégie thérapeutique efficace dans le traitement des MICI.

La production de globules rouges dépend du taux apoptose des précurseurs érythroïdes et est principalement régulé par l'érythropoïétine (Epo). La privation en Epo aboutit à l'activation de la caspase-3 (casp-3) qui clive GATA-1 ce qui entraîne l'apoptose des érythroblastes immatures. L'activation de la casp-3 est également indispensable aux modifications morphologiques caractéristiques observées au cours de la différenciation érythroïde terminale humaine, sans qu'il n'y ait ni d'apoptose ni de clivage de GATA-1. L'objectif de cette thèse était de mettre en évidence si Hsp70 inductible, dont un des rôles principaux est la régulation de l'apoptose, est impliquée dans la protection sélective des substrats de la casp-3 activée au cours de la différenciation érythroïde terminale humaine. Nous avons mis en évidence que lors de la différentiation érythroïde terminale pendant la phase d'activation des caspases, Hsp70 a une expression nucléo-cytoplasmique constitutive et co-localise avec GATA-1 dans le noyau. La localisation nucléaire d'Hsp70 est régulée par l'Epo : après privation des cellules en Epo, il y a une importante diminution de la localisation nucléaire d'Hsp70 et GATA-1 est clivée. L'inhibition de l'expression d'Hsp70 par une approche siRNA a comme conséquence le clivage de GATA-1 lors de l'activation de la casp-3 avec un arrêt de différenciation et une augmentation de la mort cellulaire. Hsp70 est une nouvelle protéine anti-apoptotique de la différenciation érythroïde terminale. Nous proposons un modèle dans lequel l'Epo détermine le destin des érythroblastes (apoptose vs différenciation) en aval de la casp-3 en régulant la localisation nucléaire d'Hsp70.

Les formes réactives de l'oxygène (FRO) ont été analysées dans différents compartiments cellulaires en utilisant des méthodes spectroscopiques (UV/VIS, fluorescence, infrarouge, résonance paramagnétique électronique). L'identité et les mécanismes catalytiques des enzymes qui produisent les FRO dans les membranes plasmiques (MP) et les mitochondries ont été étudiés, ainsi que le rôle protectif de l'oxydase terminale plastidiale (PTOX) des chloroplastes. Cd2+ s'est révélé être un inhibiteur de la NADPH oxydase des MP. In vivo Cd2+ inhibait la production extracellulaire de O2•- mais stimulait l'accumulation de H2O2. Dans des mitochondries isolées, Cd2+ a augmenté la production de FRO. Antimycin A a entraîné une élévation du H2O2 extracellulaire, confirmant que la mitochondrie est le site principal de production de l'H2O2 extracellulaire induite par Cd2+ in vivo. Une quinone réductase (QR) génératrice de FRO a été isolée des MP. La déprotonation pH-dépendante du quinole a produit des formes intermédiaires instables qui génèrent des FRO par réaction avec O2. Des espèces quinoniques ont été détectées dans la MP et pourraient servir de substrat aux QR in vivo. La protection de la chaine photosynthétique de transfert d'électron par la plastoquinol:O2 oxydoréductase a été étudiée chez des plantes PTOX+ surexprimant PTOX. En raison de leur réponse altérée en conditions de faible et forte intensité lumineuse, il a été proposé que pour fonctionner comme enzyme protectrice, PTOX est couplée à une SOD. Chez les lignées PTOX+, le niveau de SOD chloroplastique n'était pas plus élevé, limitant probablement leur capacité à détoxifier les taux élevés de O2•- généré.

L'érythropoïétine (Epo) est la principale cytokine contrôlant l'érythropoïèse. Les concentrations d'Epo retrouvées dans la circulation sont sous-optimales et ne permettent la survie que d'une partie des érythroblastes de la moelle osseuse. Dans cette étude, nous avons cherché à identifier des facteurs modulant la sensibilité des érythroblastes à l'Epo. Les érythroblastes expriment fortement le récepteur de la transferrine (CD71/RTf1), précédemment identifié comme un récepteur des Immunoglobulines A1 (IgA1). Nous montrons que chez l'Homme, le taux d'IgA1 polymériques (pIgA1) dans la moelle osseuse est augmenté par rapport au sérum et que les concentrations sériques de pIgA1 sont plus importantes chez des patients soumis à une hypoxie chronique par rapport aux volontaires sains. En concentration sous-optimale d'Epo, la liaison des pIgA1 au RTf1 permet de rétablir la prolifération cellulaire des érythroblastes. Cette activation du RTf1 implique l'activation des voies de signalisation MAPK/ERK et PI3K/AKT, mais pas de la voie JAK2/STAT5. In vivo, lors de l'induction d'anémies hémolytiques dans deux modèles murins (souris knock-in pour la chaîne lourde des IgA1 humaines et souris NODSCID injectées avec des pIgA1 humaines), les souris exposées aux IgA1 ont présenté un nombre accru d'érythroblastes spléniques rapport au contrôle, et ont restauré plus rapidement leur hématocrite. Nos résultats montrent que l'interaction pIgA1/TfR1 module la sensibilité des érythroblastes à l'Epo dans des situations physiologiques et pathologiques, apparaissant ainsi comme un régulateur positif de l'érythropoïèse.

Les Récepteurs Toll-Like (TLR) permettent d'initier et d'orienter les réponses immunes dirigées contre les pathogènes. Ils participent également à la régulation des réponses induites, comme en témoigne leur implication dans de nombreuses maladies du système immunitaire.<br />Notre recherche a eu pour objectif d'étudier le rôle des voies de signalisation TLR en situation normale et immunopathologique. Nous avons démontré que : 1) les agonistes des TLR protègent efficacement de l'apparition du diabète spontané chez la souris NOD via l'activation et/ou le recrutement de cellules régulatrices et la production de cytokines immunorégulatrices; 2) Les cellules iNKT sont activées par l'agoniste TLR7 ; 3) La signalisation via TLR7 protège de l'asthme allergique. 4) la voie signalisation via TLR2/MyD88 a un effet majeur sur le développement de l'athérosclérose, ainsi que sur la production de chimiokines et cytokines ; 5) la voie de signalisation MyD88 est impliquée dans le développement et la fonction des lymphocytes iNKT. En conclusion, notre travail met en évidence les propriétés immunomodulatrices des voies de signalisation TLR.

L'intégration des données biologiques est un des principaux défis de la bioinformatique aujourd'hui. La mise à disposition de quantités importantes de données concernant tous les niveaux d'organisation de la cellule, nécessite la mise en place de stratégies d'intégration pour rassembler toutes ces données, et ainsi mieux comprendre le fonctionnement de la cellule. Nous nous sommes intéressés à l'exploitation du concept de voisinage pour représenter et intégrer des données biologiques. Dans un premier temps, notre travail met l'accent sur l'importance du choix de la représentation pour mener une intégration efficace. Notre étude sur la représentation du métabolisme a montré que les modes élémentaires sont une alternative pertinente à la représentation classique sous forme de voies métaboliques. De plus, les modes élémentaires nous ont permis de trouver des routes métaboliques utilisées par la cellule en réponse à divers stress. Nous avons également exploité le voisinage dans une perspective de génomique comparative. Nous avons cherché à déterminer si le voisinage d'expression peut être une signature pour les gènes, et s'il peut être utilisé pour caractériser des gènes en établissant des équivalences entre des génomes (orthologues ou gènes fonctionnellement similaires). Les résultats présentés confirment l'intérêt de l'exploration du voisinage, des gènes et de leur produit, pour intégrer des données hétérogènes. L'efficacité de cette exploration est fortement liée au choix de la représentation des connaissances.

En mammographie numérique, il existe deux approches pour évaluer la qualité de l'image. Dans la première approche, une méthode visuelle basée sur un observateur humain permet la détectabilité des lésions en radiographie mammographique. Malheureusement, cette approche de qualité nécessite d'importantes ressources humaines et du temps lors de son implémentation, et elle est affectée par la variabilité inter‐évaluateurs. Dans une deuxième approche, des paramètres objectifs et indépendants de l'observateur humain, présentant une relation avec la résolution et le contraste de l'image, sont utilisés pour une évaluation de la performance des détecteurs. Cependant, il n'existe pas de relation directe entre ces paramètres et la détectabilité des lésions. Une méthode permettant d'avoir une approche de la qualité de l'image, à la fois indépendante de facteurs humains et présentant une relation directe avec la détectabilité des lésions, permettrait d'utiliser l'équipement mammographique de manière optimale. Ce travail de thèse présente le développement d'une telle méthode, consistant à générer par ordinateur des images virtuelles à partir d'un modèle « Source à rayons X/Détecteur numérique », qui prend en compte les valeurs mesurées de la MTF et du NPS des équipements mammographiques en conditions cliniques d'utilisation. De par les résultats obtenus dans notre travail, nous avons contribué à établir le lien entre les caractéristiques physiques des détecteurs et la qualité clinique de l'image dans les conditions habituelles d'exposition. De plus, nous suggérons que notre modèle de création d'images virtuelles puisse être utilisé pour déterminer rapidement les conditions optimales en mammographie. Il s'agit, en effet, d'un aspect essentiel à considérer pour la radioprotection des patientes, particulièrement dans le cadre du dépistage de masse organisé, et qui est habituellement un processus expérimental long et fastidieux à mettre en oeuvre.

Le démarrage de la traduction est un processus central dans toute cellule. L'étude des protéines assistant le ribosome pour réaliser cette étape, les facteurs de démarrage (Initiation Factors Ifs), permet d'obtenir des informations sur les mécanismes moléculaires complexes assurant la fidélité et l'efficacité du démarrage. La comparaison des jeux de facteurs protéiques dans les trois règnes du monde vivant a permis de mettre en évidence la présence de trois facteurs universellement conservés. Parmi ceux-ci, le facteur eucaryotique/archéen e/aIF5B, homologue au facteur bactérien IF2, stimule l'association des sous-unités ribosomales au même titre que chez les Bactéries. Néanmoins, l'universalité du facteur est limitée par l'absence d'interaction reportée entre le facteur e/aIF5B et l'ARNt initiateur alors que cette liaison est parfaitement caractérisée chez les Bactéries. Une partie de ce travail de thèse a permis d'étendre la similitude fonctionnelle entre les facteurs en mettant en évidence une liaison de l'ARNt initiateur méthionylé par le facteur e/aIF5B. Cette liaison présente des caractéristiques identiques à celle de l'ARNt initiateur méthionylé et formylé par le facteur bactérien IF2. Une deuxième partie du travail de thèse a concerné le facteur eIF3, le plus complexe du système de démarrage chez les Eucaryotes. Ce complexe de 13 sous-unités chez l'humain et de 5 sous-unités chez la levure n'a pas d'équivalent dans les autres domaines du vivant bien qu'il joue un rôle central et essentiel chez les Eucaryotes. La compréhension de ses fonctions est néanmoins fortement limitée par le manque d'information à l'échelle moléculaire sur les interactions entre les sous-unités le composant et avec ses autres facteurs partenaires. De plus, le facteur s'avère être impliqué dans de nombreux cancers, ce qui étend l'intérêt de son étude. Mon travail a permis de développer une bibliothèque de vecteurs permettant de coexprimer les différentes sous-unités ou des formes stabilisées des sous-unités du facteur eIF3 de levure chez la Bactérie Escherichia coli. La purification des sous-unités isolées et de différents sous-complexes nous permet d'envisager la résolution de la structure du facteur et de son organisation par une approche alliant la cristallographie et la microscopie électronique.

Le cancer est un véritable problème de santé publique et représentera en 2010 la première cause de mortalité dans le monde. La lutte contre cette maladie est donc, plus que jamais, un enjeu capital. Les processus tumoraux associés à la carcinogénèse, tels que la métastase, l'invasion ou l'angiogenèse, dépendent étroitement de la composition du milieu extracellulaire, lui-même affecté par la sécrétion de protéines par les cellules tumorales. La mutation ou la variation d'expression de facteurs pro- ou anti-oncogénique joue un rôle important dans le développement et la progression de la tumeur. Durant ce travail de thèse, nous avons voulu apporter des éléments de réponse à la problématique suivante : l'étude par protéomique des protéines sécrétées par la tumeur apporte t'elle des informations contribuant à la compréhension des mécanismes de la tumorogenèse et peut elle permettre de mettre en valeur de nouvelles cibles d'intérêt clinique ? Nous avons ciblé notre étude sur le cancer du poumon, le plus fréquent au niveau mondial tant en terme d'incidence que de mortalité. Ce cancer présente le plus fort taux de mutation du gène p53, un anti-oncogène clé de la cellule. Cette perte de fonction module la sécrétion de nombreuses protéines dont l'investigation est primordiale, bien que paradoxalement, peu étudiée. Notre travail s'est ainsi focalisé sur l'étude de l'influence de p53 sur la modulation de la sécrétion de protéines par les tumeurs du poumon. Nous avons ainsi développé un procédé d'analyse protéomique adapté, basé notamment sur un marquage iTRAQ, une séparation par isoélectrofocalisation de type OFFGEL et une analyse LC-MALDI-MS/MS. Ce procédé a été appliqué à l'étude du rôle joué par l'expression conditionnelle de p53 sur la modulation du secretome d'une lignée cellulaire d'adénocarcinome du cancer du poumon non à petites cellules. Plusieurs protéines d'intérêt ont ainsi été caractérisées et confirmées in vivo chez la souris au niveau tumoral et plasmatique. Ces résultats apportent une meilleure compréhension du rôle primordial joué par l'altération de p53 dans la modulation de l'environnement tumoral et font des secretomes cellulaires un modèle de choix pour l'identification de marqueurs tumoraux.

Le ciblage de la néoangiogenèse tumorale est une voie actuelle de recherche pour le diagnostic et pour le traitement des tumeurs solides. Les cellules endothéliales des néovaisseaux tumoraux surexpriment certains marqueurs spécifiques tels que l'intégrine avb3, qui reconnaît spécifiquement les peptides possédant le motif « RGD » (-Arg-Gly Asp-). Nous avons étudié le potentiel d'un nouveau radiotraceur - le RAFT-RGD - en vue d'imagerie moléculaire nucléaire des néovaisseaux. In vitro, le couplage de 4 c(RGDfK) au RAFT augmente la captation du traceur par les cellules avb3 positives, par rapport au c(RGDfK). De plus, le RAFT-RGD possède une meilleure affinité que le c(RGDfK) et des propriétés d'inhibition de l'angiogenèse similaires. In vivo, l'ensemble des tumeurs, avb3 positives et négatives, est visible par imagerie planaire non invasive corps entier, comme en SPECT, dès 30 min post-injection et au-delà de 24 h, grâce à une gamma caméra dédiée au petit animal. Le RAFT-RGD, malgré l'absence d'amélioration du contraste par rapport au cRGD, semble être un traceur prometteur de l'angiogenèse tumorale : il pourrait renseigner sur l'évolution de la pathologie et le suivi de l'efficacité des traitements des tumeurs dans les services de<br />Médecine Nucléaire. De plus, par sa structure chimique, le RAFT-RGD apporte de multiples possibilités de marquage (émetteurs γ et β-), ce qui permet d'envisager des applications intéressantes notamment dans le domaine thérapeutique (radiothérapie interne vectorisée).