Orientador: Ranulfo Monte Alegre / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia de Alimentos / Made available in DSpace on 2018-08-03T21:37:20Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Ubeda_BeatrizTorsani_M.pdf: 641694 bytes, checksum: c53e16a612aae01ef3b3a7713c0e5ae2 (MD5) Previous issue date: 2004 / Resumo: Biossurfactantes são agentes de superfície ativa sintetizados por várias espécies de microrganismos sendo as bactérias e as leveduras os principais produtores. A molécula do biossurfactante é formada por uma parte hidrofílica, solúvel em água, e uma parte hidrofóbica, solúvel em solvente orgânico. Tal composto é sintetizado durante o crescimento ou na fase estacionária do desenvolvimento do microrganismo em meios de cultura contendo hidrocarbonetos ou açúcares como fonte de carbono. A produção pode ser espontânea ou induzida através da presença de compostos lipídicos, por variações de pH, temperatura, aeração e agitação ou ainda, quando o crescimento celular é mantido sob condições de stress como baixas concentrações de nitrogênio e alterações nas condições ótimas de pH e temperatura. O processo de produção do biossurfactante contribui para a degradação de compostos hidrofóbicos, podendo ser empregado, no tratamento de águas residuárias e em solos contaminados por derramamento de petróleo e seus derivados, pois a célula microbiana busca a assimilação do hidrocarboneto como forma de obtenção de energia. Existe vasta possibilidade de aplicação em alimentos, na agricultura, na indústria cosmética e farmacêutica, devido principalmente à baixa toxicidade e biodegradabilidade. Neste trabalho a bactéria Kocuria rhizophila, aeróbia e gram-positiva, isolada de água residuária de abatedouro avícola, foi utilizada na produção de biossurfactante. As variáveis: substrato (querosene, sacarose e óleo de soja), pH inicial da fermentação (5,0, 7,0 e 9,0), temperatura de incubação (20, 30 e 38°C), concentrações das fontes de nitrogênio orgânica e inorgânica (0% e 50% alternadamente) e aeração (0,5, 1,5 e 2,0 VVM) foram avaliadas em relação ao crescimento celular e à produção do biossurfactante. Para isto os experimentos foram conduzidos em Erlenmeyers com agitação de 150 rpm e em fermentador de bancada. O estudo mostrou que a bactéria não é capaz de utilizar o querosene como fonte de carbono, sendo a massa celular máxima obtida em Erlenmeyers, à temperatura de incubação de 38°C e pH inicial de fermentação 9,0 e em meio de cultura contendo sacarose. Já a produção de biossurfactante aconteceu independentemente do crescimento celular, e em maior concentração no meio de cultura contendo óleo de soja como substrato. A maior atividade de emulsificação foi obtida em 48 horas de fermentação com óleo de soja comercial (5%v/v) e pH inicial 9,0, a 38°C e 150 rpm em Erlenmeyers com 1,00 g/L de NH4Cl e sem extrato de levedura. O sobrenadante obtido do caldo fermentado, após ajuste de pH para 7,0, apresentou atividade de 1,959 UA. Obteve-se redução da tensão superficial do meio de cultura de 59,9 mN/m para 38,8 mN/m e massa de biossurfactante igual a 1,10 g/L em amostra com atividade de emulsificação de 1,685 UA. Observou-se que a exposição do sobrenadante a 80°C resultou na redução da atividade de emulsificação / Abstract: Biosurfactants are active surface agents produced by a large number of microorganisms mainly by bacterias and yeast, which are the best producers. The biosurfactant molecule is composed for hydrophobic moiety soluble in organic compounds and for hydrophilic moiety soluble in water. This compound is produced during growth cellular or in the stationary phase of microorganism development in the culture medium with hydrocarbons or sugar as carbon source. The production can be spontaneously or induced by lipids compounds, pH of the medium, temperature, aeration and agitation, or when cellular growth is submitted under stress condition like low temperature, low nitrogen concentration and when the good condition of pH and temperature are changed. The process of biosurfactant production contribute with degradation of hydrophobic compounds, which can be employee in the wastewater treatment, in the soil contaminated by oil spilling and its derives, because the microrganins cellules firecracker the hydrocarbon assimilation as energy source. Oversea immense possibility of food application, in the agricultural, pharmaceutical and cosmetic industry due mainly lower toxicity and higher biodegradability. In this work the bacteria Kocuria rhizophila aerobic and gram-positive, isolated of wastewater poultry was used in the biosurfactant production. The effect of the variables: carbon source (kerosene oil, sucrose and soybean oil), initial pH of fermentation (5,0, 7,0 and 9,0), incubation temperature (20, 30 and 38°C), concentration of organic and inorganic nitrogen source (0% and 50% alternate) and aeration (0,5, 1,5 and 2,0 VVM) were studied to evaluate cellular growth and production of biosurfactant. The experiments were carried out conduction in Erlenmeyers flasks and fermentor. This study showed that the bacteria was able to use kerosene as carbons source. The maximum cellular growth occurred in Erlenmeyers flaks, at incubation temperature 38°C e initial pH of fermentation 9,0 and in the medium with sucrose. The biosurfactant production happened independent of cellular growth and the maximum concentration was reached in medium with soybeam oil. The maximun of emulsifyng activity was obtained in 48 hours of fermentation with soybean oil (5%v/v) and initial pH of fermentation 9,0, at 38°C and 150 rpm with 1,00 g/L of NH4Cl and without yeast extract. The emulsifyng activity was 1,959 UA after pH adjustment to 7,00. The superficial tension of the medium was reduced of 59,9 mN/m to 38,8 mN/m and the biosurfactant mass was 1,10 g/L in a sample which the emulsifyng activity was 1,685 UA. The fermented broth exposed at 80°C resulted in the reduction of emulsifyng activity / Mestrado / Mestre em Engenharia de Alimentos

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Rhamnolipids are surface-active molecules produced by Pseudomonas aeruginosa as congener mixtures. They are considered “green” alternatives to synthetic surfactants used in many applications. Optimizing yield and controlling congener distribution are necessary steps for successful commercialization. Studies have noted that vegetable oils, composed of a mixture of fatty acids, increase rhamnolipid yield. The physiological explanation for this is not yet understood. Furthermore the exact effects of various fatty acid components in the oils on rhamnolipid production have not been reported. The first part of the dissertation was to investigate rhamnolipid biosynthesis when fatty acid substrates are present. A combination of stable isotope tracing and gene expression assays were used to identify rhamnolipid lipid precursors and potential lipid metabolic pathways used in rhamnolipid synthesis. Result suggests that an octanoyl-CoA intermediate of β-oxidation is diverted from β-oxidation to de novo fatty acid synthesis via a “bypass route”, and is incorporated into either a 2-carbon or a 4 carbon β-ketoacyl- ACP, which can then be recognized by the RhlA enzyme for the biosynthesis of rhamnolipid lipid moiety. The second part of the dissertation focuses on studying how fatty acid substrates of different chain length (C₁₂ to C₂₂) and saturation (C(18:1) and C(18:2)) affect rhamnolipid yield, carbon conversion rate, and congener distribution. Results showed that stearic acid significantly increased rhamnolipid yield. A positive linear correlation between the mass percent of stearic acid used and the carbon conversion rate was observed. For all treatments, the RhaC₁₀C₁₀ was the most abundant and RhaC₁₀C(12:1) was the least abundant of the major congeners produced. However, the relative amounts of RhaC₁₀C₈ and RhaC₁₀C₁₂ congeners were dependent on several factors. In general, fatty acid substrates with relatively short chain length (C₁₂ and C₁₄), the unsaturated fatty acid C(18:2), and longer cultivation times resulted in a higher RhaC₁₀C₈/ RhaC₁₀C₁₂ ratio. The studies presented here demonstrate that the medium composition, in particular the organic substrate component, can affect rhamnolipid biosynthesis, yield, and congener distribution. Furthermore, this work presents evidence that C₁₈ fatty acids as co-substrates increase rhamnolipid yield by draining rhamnolipid intermediates directly from the β-oxidation pathway.

Rhamnolipid (RL) biosurfactants have been considered "green" alternatives to synthetic surfactants. Here, systematic studies of monorhamnolipids (mRLs) and their synthetic analogues are performed to characterize their interfacial and solution behaviors as surfactants. Chemical structure-surface activity relationships of rhamnolipids were probed using surface tension measurements on RLs and a series of their synthetic analogues designed by "truncation modification." Based on our study on RLs and the rationally-designed RL analogues, the key structural factor responsible for the excellent surface activity performance of rhamnolipids is the presence of the rhamnose moiety in the headgroup. As a result, rhamnopyranosides (RhEs), the simplest surfactants with a rhamnose moiety in the headgroup, show surface activity comparable to the bioproduced mRLs. The purified mixture of mRLs harvested from Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027 was mixed with a nonionic surfactant Tween-20 (TW) and studied by surface tension measurements at pH 8. The experimental values of CMC show deviation from the theoretical values predicted by ideal solution theory, which is hypothesized to be due to a shape change from rod-shaped to spherical as the mole fraction of TW is increased. The hypothesis about the shape change is supported by dynamic light scattering results, regular solution theory, and packing parameter theory. Polarization modulated-infrared reflection-absorption spectroscopy (PM-IRRAS) has been used to characterize the orientation of the synthetic rhamnolipid Rha-C18-C18 at the air-water interface. Although rhamnolipids exhibit pH-dependent micellization, their orientation at the air-water interface is not affected by pH. The average tilt angle of their alkyl chains is determined to be ~45° at a surface pressure π = 40 mN/m which decreases to 36° when Pb²⁺ is present in the subphase. Assisted by molecular modeling, the packing of mRLs at the air-water interface is believed to be dominated by the packing of their large hydrophilic headgroups. Finally, the adsorption isotherm of mRLs on hydrophobic polyethylene surfaces was generated by ATR-FTIR from solutions of different pH, which were then fit to a Frumkin adsorption model to yield the thermodynamic adsorption parameters, the adsorption equilibrium constant and the interaction parameter. mRLs strongly adsorb to d-PE, and the adsorption is pH dependent.

A formação de biofilme representa preocupação à indústria de alimentos pois é uma fonte crônica de contaminação. Encontrar estratégias eficientes para controlar o crescimento de microrganismos continua a ser um importante desafio. Uma delas é o uso dos ramnolipídeos (RLs), um biossurfatante produzido tipicamente por P. aeruginosa que apresenta potencial como agente antimicrobiano, anti-adesivo e dispersivo. Sua baixa toxicidade, biodegradabilidade, eficiência e especificidade em comparação aos surfatantes sintéticos podem torná-los promissores agentes de biocontrole. O presente estudo teve como objetivo estudar o potencial de uso de ramnolipídeos, em diferentes condições de concentração e temperatura, no controle e remoção de biofilmes de patógenos alimentares formados em meio de cultura e leite. Foram utilizadas Escherichia coli ATCC 43895, Listeria monocytogenes ATCC 19112, Staphylococcus aureus ATCC 8095, reconhecidos patógenos alimentares. Os biofilmes foram formados em placas de microtitulação de poliestireno nos meios de cultivo: caldo nutriente (CN), extrato de levedura com triptona de soja (TSYE) e matriz alimentar (leite) à 37 °C, por 24 h (E. coli) e 48 h (S. aureus e L. monocytogenes). Os biofilmes foram avaliados pela quantificação da biomassa, viabilidade celular, hidrofobicidade de superfície e análises qualitativa (microscopia eletrônica de varredura e de fluorescência) e quantitativa (caracterização da matriz polimérica). O ramnolipídeo foi submetido à análise físico-química de espalhamento dinâmico de luz (DLS), espalhamento de raios-X a baixo ângulo (SAXS). Os resultados obtidos para E. coli mostraram que a concentração de RL que mais removeu o biofilme foi 2 ‰, porém em temperaturas diferentes, para o CN à 25 °C e para o leite à 37 °C, com 33 ‰ e 80 ‰ de remoção, respectivamente. Para o biofilme de S. aureus em caldo nutriente os resultados mais eficientes foram à 25 °C, na concentração de 0,1 ‰ de RL e em leite 4 °C, na concentração de 0,05 ‰ de RL, com remoção de 35 ‰ e 89 ‰, respectivamente. O biofilme de L. monocytogenes em TSYE mostrou-se mais sensível à 37 °C, na concentração 0,5 ‰ de RL, o qual foi possível remover 35,3 ‰ da biomassa. Enquanto que em leite a 4 °C e 0,5 ‰ de RL, com remoção de 63,6 ‰ .Quanto à redução das células viáveis foi observado que para as bactérias Gram-positivas o tratamento mais efetivo foi à 4 °C com 0,05 ‰ de RL, nos meios CN e TSYEe 1 ‰ em leite. Para os biofilmes de E. coli a maior redução da viabilidade ocorreu em leite, após tratamento com RL 0,05 ‰ à 37 °C. As imagens de microscopia mostraram uma morfologia heterogênea na presença dos diferentes meios de cultivos, com destaque para os biofilmes de S. aureus (leite) e L. monocytogenes (TSYE), nos quais houve grande produção de matriz polimérica extracelular (MPE), e também apresentaram as maiores quantidades de carboidratos e proteínas. O tratamento com o ramnolipídeo reduziu a hidrofobicidade dos biofilmes. As análises de DLS e SAXS mostraram uma predominância em número de micelas com diâmetro entre 1-10 nm, independente das concentrações e temperaturas analisadas. De modo geral, a aplicação de ramnolipídeo promoveu remoção da biomassa celular como também redução de células viáveis presentes no biofilme. As evidências obtidas aqui, podem ser importantes subsídios para futuras investigações sobre as interações físico-químicas entre ramnolipídeos e a camada de biofilme visando aplicação como agentes sanitizantes em indústria de alimentos. / Biofilm formation is a concern to the food industry because it is a chronic source of contamination. Finding effective strategies to control the growth of microorganisms remains a major challenge. One strategy is the use of rhamnolipids (RLs), a biosurfactant typically produced by P. aeruginosa that has potential as antimicrobial, anti-adhesive and biofilm disrupting agent. RLs low toxicity, biodegradability, efficiency and specificity comparatively to synthetic surfactants, makes them promising biocontrol agents. This work aimed to study the potential use of rhamnolipid at different conditions of concentration and temperature, to control and removal of biofilms of food pathogens established in culture medium and milk. The bacterial strain utilized Escherichia coli ATCC 43895, Listeria monocytogenes ATCC 19112, Staphylococcus aureus ATCC 8095, are well-recognized food pathogens. The biofilms were formed in polystyrene microtiter plates in culture media: nutrient broth (NB), yeast extract and tryptone soya (TSYE) and in food matrix (milk) at 37 °C for 24 h (E. coli) and 48 h (S. aureus and L. monocytogenes). Biofilms were assessed by biomass quantification, cell viability, surface hydrophobicity, qualitative (scanning electron microscopy and fluorescence) and quantitative (characterization of polymer matrix) analysis. The rhamnolipid was subjected to physical and chemical analysis of dynamic light scattering (DLS) and X-ray small angle scattering (SAXS). E. coli biofilms were removed more efficiently using 2 ‰ RL, but at different temperatures for NB (25 °C) and milk (37 °C) showing 33 ‰ and 80 ‰ respectively. For the biofilm of S. aureus in NB the best results was obtained at 25 °C and 0.1 ‰ RL and in milk medium at 4 °C with 0.05 ‰ RL showing 35 ‰ and 89 ‰ of biofilm disruption, respectively. The biofilm of L. monocytogenes in TSYE was more sensitive to the treatment at 37 °C with 0.5 ‰ RL, removing 35.3 ‰ of the biofilm; while in milk at 4 °C and 0.5 ‰ RL, biofilm removal reached 63.6 ‰. Reduction on cell viability was more effective for Gram-positive bacteria at 4 °C with 0.05 ‰ RL, for NB and TSYE and at 1 ‰ in milk. For E. coli biofilms the largest reduction of viability occurred in milk after treatment with 0.05 ‰ RL at 37 °C. The microscopy images showed a heterogeneous morphology in the presence of different media, especially biofilms of S. aureus (milk) and L. monocytogenes (TSYE), in which there was a great production of extracellular polymeric matrix (EPM), and also the highest amounts of carbohydrates and protein. The treatment with RL reduced the hydrophobicity of biofilms. The DLS and SAXS analysis of RL showed a predominance of micelles with diameters between 1-10 nm, independent of the concentrations and temperatures utilized. In general, the application of rhamnolipid promoted a reduction in biofilm mass as well in cell viability. The evidences obtained can provide a basis for future research on the physical and chemical interactions between rhamnolipid and biofilm layer aiming their application as sanitizers in food industry.

A produção comercial dos surfactantes ocorre principalmente por síntese química a partir do petróleo. A via biotecnológica se apresenta como uma alternativa promissora por possibilitar a utilização de biomassas vegetais, ricas em carboidratos a exemplo da palha de cana-de-açúcar. Assim, esta biomolécula torna-se mais competitiva comercialmente em relação aos surfactantes químicos, obtendo um processo biossustentável e biodegradável. Microrganismos isolados da Antártica apresentam potencial para a produção destas biomoléculas, uma vez que em condições extremas de sobrevivência estas poderiam ser produzidas em concentrações elevadas. Assim, este estudo avaliou a produção de biossurfactante em hidrolisado hemicelulósico de palha de cana-de-açúcar (HHPC) a partir de leveduras da Antártica, além da caracterização parcial da biomolécula e testes de estabilidade da emulsão. Inicialmente foram avaliadas 24 leveduras, cultivadas em frascos Erlenmeyer de 50 mL em meio semi-definido contendo xilose ou glicose como fontes de carbono, a 25ºC, 150 rpm, por até 72 horas. As propriedades emulsificante e tensoativa do bioproduto foram avaliadas e as culturas que apresentaram resultados satisfatórios para ambas as propriedades e consumo de xilose superior ou igual a 80% foram selecionadas para cultivo em meio formulado com HHPC. Das 24 leveduras testadas, três foram selecionadas para cultivo em hidrolisado: Cryptococcus laurentii (L62), Cryptococcus adeliensis (L95) e Rhodotorula mucilaginosa (L52). Destas, a levedura Cryptococcus adeliensis (L95) se destacou por apresentar produção de biomoléculas com maior propriedade emulsificante e tensoativa. Para esta levedura o consumo de xilose em meio semi-definido e em HHPC bem como o índice de emulsificação nas diferentes condições foram semelhantes. O biossurfactante produzido por Cryptococcus adeliensis (L95) foi caracterizado como glicolipídeo. Diferentes métodos de extração desta biomolécula foram testados, no entanto, estes não apresentaram diferença significativa. A estabilidade da emulsão obtida do sobrenadante de L95 em HHPC foi determinada em distintas condições físico-químicas, sendo que esta foi estável a pH extremamente baixo (2,00), baixas temperaturas (0oC e 4oC) e elevada concentração salina (10% m/V). Estes resultados são promissores considerando o potencial de aplicação de biossurfactantes em biorremediação bem como insumos nos mais diversos segmentos industriais, os quais necessitam de biomoléculas que resistam às mais diversas condições ambientais. Desta forma nesta pesquisa foi possível inferir que a biomassa de palha de cana pode ser destinada à obtenção de biossurfactantes a partir de leveduras da Antártica, destacando a relevância da pesquisa quanto à inovação biotecnológica. / The commercial production of surfactants occurs mainly by chemical synthesis from petroleum. The biotechnological pathway is considered as a promising alternative because it allows the use of vegetable biomass, rich in carbohydrates such as sugarcane straw. Thus, this biomolecule becomes more commercially competitive with respect to the chemical surfactants, obtaining a biodegradable process. Microorganisms isolated from Antarctica have the potential to produce these biomolecules, since under extreme conditions of survival, these could be produced in higher concentrations. In this way, this study aims to evaluate the biosurfactant production in sugarcane straw hemicellulosic hydrolysate from Antarctic yeasts, in addition to the partial characterization of the biomolecule and stability tests of the emulsion. Initially, 24 yeasts were evaluated, grown in 50 mL Erlenmeyer flasks in semi-defined medium with xylose or glucose as carbono sources, at 25ºC, 150 rpm, up to 72 hours. The emulsifying and surfactante properties of the bioproduct were evaluated, and the cultures that had satisfactory results for both properties and xylose consumption higher or equal to 80% were selected to be cultivated in a medium formulated with sugarcane straw hemicellulosic hydrolysate (SSHH). In the 24 yeasts tested, three were selected to be cultivated in the hydrolysed: Cryptococcus laurentii (L62), Cryptococcus adeliensis (L95) and Rhodotorula mucilaginosa (L52). Among these C. adeliensis (L95) was distinguished by the production of biomolecules with higher emulsifying and tensoactive properties. For this yeast, the xylose consumption in semi-defined medium and in SSHH, as well as the emulsification index under diferente conditions were similar. The biosurfactant produced by C. adeliensis (L95) was characterized as glycolipid. Different methods of extraction of this biomolecule were tested, however, these did not have significant difference. The emulsion stability obtained from the C. adeliensis (L95) supernatant in SSHH was determined under different physicochemical conditions, which was stable at extremely low pH (2,00), low temperatures (0oC and 4oC) and high saline concentration (10% m/v). These results are interesting considering the potential of the biosurfactants application in bioremediation and inputs for several industrial segments, which require biomolecules that resist to the most diverse environmental conditions. In this research, it was concluded that sugarcane straw biomass can be used to obtain biosurfactants from Antarctic yeasts, consequently highlighting the research relevance regarding to the biotechnological innovation.

Os ramnolipídeos (RLs) são biossurfactantes glicolipídeos que podem ser produzidos por diferentes espécies bacterianas. P. aeruginosa produz RLs ricos em 3-hidroxidecanoato, já o RL produzido por B. thailandensis apresenta elevada proporção de 3-hidroxitetradecanoato. A enzima RhlA sintetiza o 3-(3-hidroxialcanoiloxi)alcanoato (HAA), porção lipídica de RLs, e apresenta diferenças estruturais nas espécies de P. aeruginosa e B. thailandensis. Esse trabalho concentrou-se na clonagem e expressão heteróloga dos genes rhlA da linhagem P. aeruginosa LFM634 e Burkholderia thailandensis E264. Os HAAs e RLs produzidos pelas linhagens recombinantes foram caracterizados. Além disso, genes quiméricos foram sintetizados com a finalidade de modificar a especificidade das enzimas RhlAs. Os resultados obtidos neste trabalho demonstraram que a expressão de genes rhlA de diferentes espécies modificou a composição dos HAAs e/ou RLs produzidos em P. aeruginosa, B. thailandensis e E. coli. Os dados indicam que a enzima RhlA desempenha um papel importante na composição dos HAAs produzidos, porém o metabolismo bacteriano também é responsável pela composição desses tensoativos. Além disso, os resultados sugerem que a enzima RhlB, responsável pela ligação de ramnose ao HAA, também apresenta diferenças de especificidade. Quando as enzimas quiméricas foram avaliadas, detectou-se um comportamento semelhante à RhlA de B. thailandensis indicando que a estrutura de RhlA de P. aeruginosa é muito específica para funcionar adequadamente junto com a enzima RhlB. Por fim, as propriedades tensoativas demonstraram diferenças quando há modificações na composição dos 3-hidroxiácidos incorporados aos RLs. / Rhamnolipids (RLs) are glycolipid biosurfactants that can be produced by different bacterial species. P. aeruginosa produces RLs rich in 3-hydroxydecanoate, whereas the RL produced by B. thailandensis presents a high proportion of 3-hydroxytetradecanoate. RhlA enzyme synthesizes 3-(3-hydroxyalkanoyloxy)alkanoate (HAA), lipid portion of RLs, and presents structural differences in P. aeruginosa and B. thailandensis. HAAs and RLs produced by the recombinant strains were characterized. In addition, chimeric genes were synthesized for the purpose of modifying the specificity of the RhlAs enzymes. The results obtained in this study demonstrated that the expression of rhlA genes from different species modified the composition of HAAs and/or RLs produced by P. aeruginosa, B. thailandensis and Escherichia coli. The data also strongly suggest that the composition of the RLs produced depends on the 3-hidroxiacids supplies by the cellular metabolism. Futhermore, the results suggest that the RhlB enzyme that binds to the molecule of HAA a d-TDP-L-rhamnose, also exhibits differences in specificity. When the chimeric enzymes were evaluated, a RhlA-like behavior of B. thailandensis was detected indicating that the RhlA structure of P. aeruginosa is very specific to function properly together with the RhlB enzyme. Finally, the results also indicate differences in the tensoactive properties of the RLs with different compositions.

A bactéria Lactococcus lactis subsp. lactis CECT-4434 foi empregada para investigar o efeito da composição do meio de cultivo na produção biotecnológica de biossurfactante e, adicionalmente bacteriocina. Utilizou-se resíduos agroindustriais, tais como soro de leite e vinhaça de uva, para formular meios de cultivos mais econômicos e naturais, suplementados sacarose e extrato de levedura. Um planejamento fatorial fracionado 24, com adição de três ensaios nos pontos centrais foi empregado para avaliar a influência destas variáveis. A produção de biossurfactante foi influenciada positivamente pela concentração soro de leite, onde 15 % deste demonstrou melhor resultado reduzindo a tensão superficial em cerca de 18,1 mN/m, alcançando produção máxima de biossurfactante equivalente em surfactina de 11,02 mg/L. Em relação à síntese de bacteriocina, a fonte de carbono adicional (sacarose) interferiu de forma antagonista, ou seja, quanto menor a concentração de sacarose, maior a síntese de bacteriocina (com aumento da zona de inibição em 14,2% contra Staphylococcus aureus CECT-239). Observou-se que o ensaio conduzido em biorreator, sob microaeração com 5% de oxigênio dissolvido, promoveu maior produção de biossurfactante (11,6 mg/L) quando comparados aos estudos conduzidos com maior concentração de oxigênio entre 30 a 100%, com produção em média de 2,3 mg/mL. Destaca-se que nenhum estudo da influência do oxigênio dissolvido, principalmente em microaerofilia, para a produção de biossurfactante por bactérias láticas já havia sido realizado. Ademais, o biossurfactante produzido se mostrou altamente estável frente a valores extremos de pH e temperatura, além de demonstrar notável propriedade antimicrobiana e antiadesiva, inibindo Listeria monocytogenes NADC 2045 e Salmonella entérica<i/> CECT-724 em mais de 90%. / Lactococcus lactis subsp. lactis CECT-4434 was used to investigate the effect of the composition of the culture media on the biotechnological production of biosurfactant and bacteriocin additionally. Agroindustrial residues, such as whey and grape vinasse, were used to formulate more economical and natural culture media, supplemented with sucrose and yeast extract. A fractional factorial design 24, with addition of three runs at the central points was used to evaluate the influence of these variables. The biosurfactant production was positively influenced by the concentration of whey, where 15% showed a better result reducing the surface tension by 18.1 mN/m, reaching a maximum production of biosurfactant equivalent in surfactin of 11.02 mg/L. In relation to bacteriocin synthesis, the sucrose interfered in an antagonistic way, that is, the lower the sucrose concentration, the greater the bacteriocin synthesis (with an increase in the zone of inhibition in 14.2% against Staphylococcus aureus CECT-239). It was observed that the bioreactor conducted under microaeration with 5% dissolved oxygen promoted a higher biosurfactant production (11.6 mg/L) when compared to studies conducted with a higher concentration of oxygen between 30 and 100%, with production on average 2.3 mg/mL. It is noteworthy that no study of the influence of dissolved oxygen, mainly in microaerophilic, for the biosurfactant production by lactic acid bacteria had already been carried out. In addition, the biosurfactant produced proved to be highly stable against extreme values of pH and temperature, and demonstrated remarkable antimicrobial and antiadhesive properties, inhibiting Listeria monocytogenes NADC 2045 and Salmonella entérica CECT-724 in more than 90%.

Os biossurfatantes (BS) são produtos de origem microbiana com propriedades tensoativas e emulsificantes. Estes compostos são candidatos para substituir os surfatantes sintéticos em aplicações industriais devido à sua menor toxicidade, maior biodegradabilidade, maior diversidade química e maior eficiência e efetividade em condições físicas extremas de salinidade, pressão e temperatura. O uso comercial e industrial dos BS ainda não é sustentável devido a seu alto custo de produção relacionado principalmente ao baixo rendimento. A utilização de substratos de baixo custo e ferramentas estatísticas para melhorar o rendimento de produção dos BS são duas das principais estratégias para tratar este problema. O objetivo do trabalho foi estudar a produção e recuperação do BS produzido por B. luteolum, visando o melhoramento na sua produção através do uso do planejamento fatorial e caracterizar a estrutura química do BS. A partir dos resultados, determinou-se que a adsorção em resina foi mais efetiva para a recuperação do BS comparada com a precipitação ácida. A produção do BS foi melhorada através de um planejamento fatorial 23 usando como fatores as concentrações da fonte de carbono (vaselina), a fonte de nitrogênio (nitrato de amônio) e a água do mar artificial e como resposta a tensão superficial da solução 0,1% de BS. A maior produção de BS foi obtida com 4% de fonte de carbono, 2% de fonte de nitrogênio e 20% de água do mar artificial gerando tensão superficial de 27 mNm-1. O BS foi caracterizado como uma mistura de lipopeptídeos com ácidos graxos cujo comprimento da cadeia variou entre 10-18 unidades de carbono e um conteúdo de proteína total de 5%. Três estruturas químicas foram sugeridas para os compostos ativos: dois prolina-lipídeos com os ácidos graxos C16:0 e C18:0 respectivamente e um lipopeptídeo com uma sequência peptídica Phe-Al-X-X-Pro-Pro-Thr (X=Leu/Ile) ligada a uma cadeia de ácido graxo C16:0. Não observou-se atividade antimicrobiana contra as cepas de S. aureus, E. coli, S. enteritidis, L. monocytogenes e S. mutans nas faixas de concentrações de BS testadas. O uso de vaselina como substrato para a produção do BS sugere que a bactéria e o BS podem ser explorados para aplicações como a biorremediação e a recuperação melhorada de petróleo (EOR). / Biosurfactants (BS) are microbial-derived molecules showing tensoactive and emulsification properties. These compounds are candidates to replace synthetic surfactants for industrial applications due to their less toxicity, greater biodegradation capacity, greater chemical diversity and greater efficiency and effectiveness under extreme physical conditions of salinity, pressure and temperature. Commercial and industrial use of BS is not sustainable due their high production cost mainly related to low production yields. The use of low cost substrates and statistical tools to enhance the production yield of biosurfactants are two of the main strategies to deal with that problem. The objective of this work was to study the production and recovery of the BS produced by B. luteolum, aiming to enhance its production through a factorial experimental design, and to characterize the chemical structure of the BS. It was found that resin adsorption was more effective than acid precipitation to recover the BS. The production of BS was enhanced through a factorial experimental design 23 using the concentrations of the carbon source (mineral oil), the nitrogen source (ammonium nitrate) and artificial seawater as the factors and the surface tension of a solution 0,1% of BS as the response. The value of factors that enhanced the production of BS were 4% of carbon source, 2% of nitrogen source and 20% of artificial sea water showing a surface tension of 27mNm-1. The BS was characterized as a mix of lipopeptides with fatty acid chains varying between 10-18 carbon units and a total protein content of 5%. Three chemical structures were proposed for the active compounds: two proline-lipids with the fatty acid chains C16:0 e C18:0 respectively and a lipopeptide with a peptide sequence Phe-Al-X-X-Pro-Pro-Thr (X=Leu/Ile) linked to a fatty acid chain C16:0. BS did not show antimicrobial activity against S. aureus, E. coli, S. enteritidis, L. monocytogenes and S. mutans at concentration range tested. The use of mineral oil as a substrate for the production of the BS suggests that the bacteria and the BS can be explore for applications as bioremediation and enhanced oil recovery (EOR).

A crescente preocupação com a sustentabilidade e com o consumo de produtos naturais, ecologicamente corretos e biodegradáveis, coloca em evidência a importância do desenvolvimento de processos que utilizem matérias-primas renováveis para a obtenção de produtos de interesse à indústria. Nos últimos anos, tem-se buscado viabilizar as biorrefinarias lignocelulósicas para a obtenção de produtos a partir de biomassa vegetal, principalmente de subprodutos agrícolas e agroindustriais. Neste contexto, os biossurfactantes, os quais são metabólitos microbianos com propriedades tensoativas, emulsificantes e antimicrobianas, são bioprodutos alvos de pesquisa por apresentarem aplicações diversas nas indústrias petrolífera, química, alimentícia, farmacêutica e cosmética. Diferentes estratégias de redução do custo da produção microbiológica de compostos surfactantes vêm sendo desenvolvidas, a fim de tornar o processo mais viável do ponto de vista econômico e industrial e entre elas estão o desenvolvimento de bioprocessos mais eficientes, incluindo a otimização das condições do processo fermentativo e a utilização de substratos mais baratos, entretanto, poucos abordam a utilização de leveduras e do bagaço de cana-de-açúcar como matéria-prima renovável disponível no Brasil. Dentro deste contexto, esta pesquisa tem como principal objetivo estudar a influência da agitação e da aeração na produção de biossurfactante a partir de meio formulado com hidrolisado hemicelulósico de bagaço de cana-de-açúcar e suplementado com nutrientes, pela levedura Cutaneotrichosporon mucoides em biorreator de bancada. Para tanto, foi utilizado planejamento fatorial completo 22 com triplicata no ponto central e o índice de emulsificação (I.E.) e a tensão superficial (T.S.) do meio foram analisados após 96 h de fermentação. Os melhores resultados (I.E. = 69.4 % e T.S. = 57.8 mN.m-1) foram obtidos quando se empregou a maior agitação (250 rpm) e a menor aeração (0,5 vvm). O alto valor de I.E. evidencia o pontencial emulsificante do biossurfactante produzido, principalmente na indústria petroquímica. Entretanto, ainda se faz necessário otimizar os parâmetros agitação e aeração e reduzir a formação de espuma durante a fermentação, a fim de viabilizar este bioprocesso. / The growing concern with sustainability and the consumption of natural, ecologically correct and biodegradable products highlights the importance of developing processes that use renewable raw materials to obtain products that can be applied in industry. In the last years, it has been tried to make viable the lignocellulosic biorrefinaries concept in order to obtain products from vegetal biomass, mainly from agricultural and agroindustrial by-products. In this context, the biosurfactants, which are microbial metabolites with tensoactive, emulsifying and antimicrobial properties, are bioproducts studied because they can be applied in the petroleum, chemical, food, pharmaceutical and cosmetic industries. Different strategies to reduce the cost of microbiological production of surfactant compounds have been developed in order to make the process viable from an economic and industrial point of view and among them are the development of more efficient bioprocesses, including the optimization of fermentation process conditions and the use of cheaper substrates, however, few works were done using yeasts and sugarcane bagasse as a renewable raw material available in Brazil. In this context, the main objective of this research is to study the influence of agitation and aeration in the production of biosurfactant using hemicellulosic hydrolyzate of sugarcane bagasse supplemented with nutrients and the yeast Cutaneotrichosporon mucoides in stirred tank bioreactor. For this purpose, a 22 full factorial design was used and the emulsification index (E.I.) and the surface tension (S.T.) of the medium were analyzed after 96 h of fermentation. The best results (E.I. = 69.4% and S.T. = 57.8 mN.m-1) were obtained when using the highest agitation (250 rpm) and the lowest aeration (0.5 vvm). High results of E.I. showed the emulsifying potential of the biosurfactant produced, mainly in petrochemical industry. However, it is still necessary optimizing agitation and aeration parameters and decrease foaming formation during the fermentation in order to favor the viability of this bioprocess.