Les processus d'apprentissage et de mémoire sont contrôlés par des circuits et éléments neuronaux spécifiques. De nombreuses études ont récemment mis en évidence que les circuits corticaux jouent un rôle important dans la régulation des comportements de peur, cependant, leurs caractéristiques anatomiques et fonctionnelles restent encore largement inconnues. Au cours de ma thèse, en utilisant des enregistrements unitaires et des approches optogénétiques chez la souris libre de se comporter, nous avons pu montrer que les interneurones inhibiteurs du cortex auditif et du cortex préfrontal médian forment un microcircuit désinhibiteur permettant respectivement l'acquisition et l'expression de la mémoire de peur conditionnée. Dans les deux cas, les interneurones parvalbuminergiques constituent l'élément central du circuit et sont inhibés de façon phasique. D’un point de vue fonctionnel, nous avons démontré que cette inhibition était associée à la désinhibition des neurones pyramidaux par un mécanisme de réduction de l'inhibition continue exercée par les interneurones parvalbuminergiques. Ainsi, les interneurones parvalbuminergiques peuvent contrôler temporellement l'excitabilité des neurones pyramidaux. En particulier, nous avons montré que l'acquisition de la mémoire de peur conditionnée dépend du recrutement d'un microcircuit désinhibiteur localisé dans le cortex auditif. En effet, au cours du conditionnement de peur, la présentation du choc électrique induit l'inhibition des interneurones parvalbuminergiques, ce qui a pour conséquence de désinhiber les neurones pyramidaux du cortex auditif et de permettre l’apprentissage du conditionnement de peur. Dans leur ensemble, ces données suggèrent que la désinhibition est un mécanisme important dans l'apprentissage et le traitement de l'information dans les circuits corticaux. Dans un second temps, nous avons montré que l'expression de la peur conditionnée requière l'inhibition phasique des interneurones parvalbuminergiques du cortex préfrontal médian. En effet, leur inhibition désinhibe les cellules pyramidales préfrontales et synchronise leur activité en réinitialisant les oscillations thêta locales. Ces résultats mettent en évidence deux mécanismes neuronaux complémentaires induits par les interneurones parvalbuminergiques qui coordonnent et organisent avec précision l’activité neuronale des neurones pyramidaux du cortex préfrontal pour contrôler l'expression de la peur conditionnée. Ensemble, nos données montrent que la désinhibition joue un rôle important dans les comportements de peur en permettant l’association entre des informations comportementalement pertinentes, en sélectionnant les éléments spécifiques du circuit et en orchestrant l'activité neuronale des cellules pyramidales. / Learning and memory processes are controlled by specific neuronal circuits and elements. Numerous recent reports highlighted the important role of cortical circuits in the regulation of fear behaviour, however, the anatomical and functional characteristics of their neuronal components remain largely unknown. During my thesis, we used single unit recordings and optogenetic manipulations of specific neuronal elements in behaving mice, to show that both the auditory cortex and the medial prefrontal cortex contain a disinhibitory microcircuit required respectively for the acquisition and the expression of conditioned fear memory. In both cases, parvalbumin-expressing interneurons constitute the central element of the circuit and are phasically inhibited during the presentation of the conditioned tone. From a functional point of view, we demonstrated that this inhibition induced the disinhibition of cortical pyramidal neurons by releasing the ongoing perisomatic inhibition mediated by parvalbumin-expressing interneurons onto pyramidal neurons. Thereby, this disinhibition allows the precise temporal regulation of pyramidal neurons excitability. In particular, we showed that the acquisition of associative fear memories depend on the recruitment of a disinhibitory microcircuit in the auditory cortex. Fear-conditioning-associated disinhibition in auditory cortex is driven by foot-shock-mediated inhibition of parvalbumin-expressing interneurons. Importantly, pharmacological or optogenetic blockade of pyramidal neuron disinhibition abolishes fear learning. Together, these data suggest that disinhibition is an important mechanism underlying learning and information processing in cortical circuits. Secondly, in the medial prefrontal cortex, we demonstrated that expression of fear behaviour is causally related to the phasic inhibition of prefrontal parvalbumin-expressing interneurons. Inhibition of parvalbumin-expressing interneuron activity disinhibits prefrontal pyramidal neurons and synchronizes their firing by resetting local theta oscillations, leading to fear expression. These results identify two complementary neuronal mechanisms both mediated by prefrontal parvalbumin-expressing interneurons that precisely coordinate and enhance the neuronal efficiency of prefrontal pyramidal neurons to drive fear expression. Together these data highlighted the important role played by neuronal disinhibition in fear behaviour by binding behavioural relevant information, selecting specific circuit elements and orchestrating pyramidal neurons activity.

[pt] Este estudo investiga o envolvimento do córtex pré-frontal medial ventral nos comportamentos de defesa inatos e aprendidos em paradigmas de condicionamento de medo e estimulação elétrica intracraniana em ratos. A lesão cortical aumentou significativamente o comportamento defensivo condicionado. No comportamento defensivo incondicionado, a lesão cortical diminuiu significativamente o congelamento pós-fuga dos animais. Os resultados replicam os dados da literatura científica a respeito do papel do córtex infralímbico como uma estrutura inibitória do estímulo condicionado em um circuito amidaloide de medo condicionado, e indicam uma participação do córtex pré-frontal na modulação dos comportamentos de defesa originários da estimulação da MCPd, em especial a sustentação do congelamento motor pós fuga. / [en] This study investigates the role of the prefrontal cortex in the innate and conditioned defensive behaviors in rats during classical conditioning and intracranial electrical stimulation procedurals. It was found that the cortical lesion augmented the conditioned freezing behavior to contextual fear cues. On the other hand, the lesions impaired the motor freezing presented after the escaping provoked by dPAG stimulation. These results replicate the findings from the literature about a prefrontal cortex role as an inhibitory structure in the aversive classic conditioning circuitry, as well as presenting a role for it in modulating freezing behavior in a panic circuitry involving the dPAG, especially regarding its function as a possible short term memory device for innate fear expression.

OLIVEIRA, A.R. Envolvimento de receptores dopaminérgicos da área tegmental ventral e do complexo basolateral da amígdala na aquisição e na expressão do medo condicionado. 2010. 93 f. Tese (Doutorado) Faculdade de Filosofia, Ciências e Letras de Ribeirão Preto, Universidade de São Paulo. O condicionamento Pavloviano é um dos paradigmas mais utilizados para estudar as bases biológicas das emoções, assim como da aprendizagem e memória. A dopamina (DA) é um dos principais neurotransmissores envolvidos na mediação de estados de medo e ansiedade. Um conjunto crescente de evidências dá suporte à hipótese de que a ativação da via mesocorticolímbica, proveniente de neurônios dopaminérgicos da área tegmental ventral (ATV), é particularmente sensível à estimulação aversiva. Entre as regiões inervadas por esta via, o complexo basolateral da amígdala (BLA) é um componente essencial dos circuitos neurais do medo condicionado. Assim, o presente estudo explorou o envolvimento de mecanismos DA da ATV e do BLA, através do uso de agonistas e antagonistas de receptores DA, na aquisição e expressão do medo condicionado à luz. Não houve efeito das drogas DA no sobressalto potencializado pelo medo (SPM), quando injetadas na ATV antes do condicionamento, indicando que os receptores DA da ATV não participam da aquisição do medo condicionado à luz. Ao contrário, quando injetado na ATV antes do teste, quimpirole (agonista D2) reduziu o SPM, enquanto as demais drogas não tiveram efeito. A administração de SCH 23390 (antagonista D1) no BLA não produziu efeitos no SPM, indicando que os receptores D1 do BLA não parecem envolvidos na expressão do SPM. Já a administração de sulpirida (antagonista D2) no BLA inibiu o SPM produzido pela luz. Além disso, a expressão do medo condicionado foi associada a um aumento do congelamento e dos níveis extracelulares de DA no BLA, ambos inibidos com a administração de quimpirole na ATV. A capacidade do quimpirole em diminuir o SPM e o congelamento condicionado parece ser resultado de sua ação em auto-receptores D2 da ATV. A ativação desses receptores diminui os níveis de dopamina em áreas que recebem terminações da via mesocorticolímbica. Os resultados com a sulpirida realçam a importância dos receptores D2 do BLA na expressão do medo condicionado Pavloviano. / OLIVEIRA, A.R. Involvement of dopaminergic receptors of ventral tegmental area and basolateral amygdala in the acquisition and expression of conditioned fear. 2010. 93 p. Thesis (Doctoral) Faculdade de Filosofia, Ciências e Letras de Ribeirão Preto, Universidade de São Paulo. The Pavlovian fear conditioning is one of the most used paradigms to study the biological basis of emotion, as well as of learning and memory. Dopamine (DA) is one of the most important neurotransmitters involved in mechanisms underlying states of fear and anxiety. A growing body of evidence supports the hypothesis that excitation of the mesocorticolimbic pathway, originating from DA neurons in the ventral tegmental area (VTA), is particularly sensitive to fear-arousing stimuli. Among the forebrain regions innervated by this pathway, the basolateral amygdala (BLA) is an essential component of the neural circuitry of conditioned fear. The present study explored the involvement of VTA and BLA DA receptors, using DA agonists and antagonists, in the acquisition and expression of conditioned fear to a light conditioned stimulus (CS). None of the drugs used produced significant effects on fear-potentiated startle (FPS) when injected in VTA before conditioning, indicating that VTA DA receptors are not involved in the acquisition of conditioned fear to a light-CS. In contrast, when injected before the test session, intra-VTA quinpirole (D2 agonist) significantly reduced FPS, whereas the other drugs had no effect. Intra-BLA SCH 23390 (D1 antagonist) did not produce significant effects on FPS, indicating that BLA D1 receptors do not appear to be involved in the expression of FPS. On the other hand, intra-BLA sulpiride (D2 antagonist) inhibited FPS produced by light-CS previously paired with footshocks. Also, conditioned fear was associated with increased freezing and DA levels in the BLA, both inhibited by intra-VTA quinpirole. Quinpirole\'s ability to decrease FPS and conditioned freezing may be the result of an action on VTA D2 presynaptic autoreceptors. The activation of those receptors decreases dopamine levels in terminal fields of the mesocorticolimbic pathway. Sulpirides results stress the importance of BLA D2 receptors in the fear-activating effects of the Pavlovian conditioning.

O aumento do reflexo de sobressalto na presença de um estímulo que tenha sido previamente pareado a choques nas patas é tomado como índice de medo e nomeado sobressalto potencializado pelo medo (SPM). O congelamento, interrupção de todos os movimentos observáveis, exceto aqueles associados com a respiração, também tem sido utilizado como índice de medo em ratos. Um crescente número de evidências sugere o envolvimento de mecanismos dopaminérgicos em diferentes aspectos da memória afetiva, como sua formação, evocação e expressão. No entanto, resultados sobre como e por meio de quais receptores os mecanismos dopaminérgicos influenciam o medo têm sido inconsistentes. O presente estudo examina o envolvimento dos receptores dopaminérgicos na aquisição e na expressão do medo condicionado à luz. Para isso, foram analisados os efeitos do antagonista D1, SCH 23390, do agonista D1, SKF 38393, do antagonista D2, sulpirida, e do agonista D2, quimpirole, no SPM e no congelamento. A atividade motora dos animais também foi avaliada no teste do campo aberto. SCH 23390, SKF 38393, sulpirida e quimpirole, administrados antes do condicionamento, não produziram efeitos no SPM, mas SCH 23390 diminuiu o congelamento. As administrações de SCH 23390, SKF 38393 e sulpirida antes do teste também não produziram efeitos no SPM e no congelamento. Quimpirole, em doses que agem em receptores pré-sinápticos, causou uma redução significativa no SPM e no congelamento, quando administrado antes do teste. A ação das drogas não foi devida a efeitos não-específicos uma vez que elas não produziram efeitos no teste do campo aberto. Os resultados sugerem que mecanismos dopaminérgicos devem estar envolvidos tanto na aquisição, quanto na expressão do medo condicionado à luz. Receptores D1 pós-sinápticos parecem participar da aquisição do congelamento condicionado à luz-CS, mas não do SPM. Por outro lado, receptores D2 pré-sinápticos parecem estar envolvidos na expressão do medo condicionado à luz-CS. / The increase in the startle reflex in the presence of a stimulus that has been previously paired to footshock is taken as an index of fear and named fear potentiated startle (FPS). Freezing behavior, a cessation of all observable movements, except those associated with respiration, has also been used as an index of fear in rats. A growing body of evidence has suggested that dopaminergic mechanisms are implicated in different aspects of affective memory, namely its formation, expression or retrieval. However, the results of studies that have examined how, and through which receptors, dopaminergic mechanisms influence fear have been inconsistent. This work is aimed at examining the involvement of dopaminergic receptors in the acquisition and expression of conditioned fear to ligth-CS. We evaluated the effects of systemic administration of the D1 antagonist, SCH 23390, the D1 agonist, SKF 38393, the D2 antagonist, sulpiride, and the D2 agonist, quinpirole before and after conditioning on FPS and freezing. The motor activity of the animals was also evaluated in an open field test. SCH 23390, SKF 38393, sulpiride and quinpirole, injected before conditioning sessions, did not produce any effect on FPS, but SCH 23390 decreased freezing. Injections of SCH 23390, SKF 38393 and sulpiride before testing session did not produce any effect on FPS or freezing. Quinpirole, injected at doses acting at presynaptic level, caused significant reduction in FPS and freezing, when injected before testing. Drugs’ action was not due to nonspecific effects since they had no effect in the open field test. Our findings indicate that DA mechanisms are involved in the acquisition and expression of conditioned fear using light-CS. Dopaminergic mechanisms mediated by postsynaptic D1 receptors seem to be involved in the acquisition of conditioned freezing to light-CS, but not in FPS. On the other hand, dopaminergic mechanisms mediated by presynaptic D2 receptors seem to be involved in the expression of conditioned fear to light-CS.

Alterações no sistema glutamatérgico e mudanças no funcionamento do córtex pré-frontal medial (CPFm) têm sido associadas a diversos distúrbios psiquiátricos, dentre os quais a ansiedade. Também é reconhecido que alterações nas concentrações circulantes de glicocorticóides podem induzir alterações nas sinapses e circuitos glutamatérgicos e, consequentemente, modificar a reatividade emocional dos animais. Embora se saiba que os glicocorticóides influenciam a liberação de glutamato no CPFm, a interação entre os efeitos mediados pelos receptores mineralocorticóides (MR) ou glicocorticóides (GR) e o sistema glutamatérgico, na expressão da resposta condicionada de medo, ainda não está elucidada. Nesse sentido, os objetivos do presente estudo foram investigar (i) a influência dos glicocorticóides na expressão do medo condicionado contextual e seus efeitos sobre a atividade do CPFm em ratos, (ii) o papel dos receptores MR e GR localizados no córtex prelímbico (PrL) na expressão da resposta condicionada de congelamento e (iii) a interação entre os mecanismos mediados pelos glicocorticoides e o sistema glutamatérgico, via receptores do tipo NMDA, na expressão dessa resposta. Ratos Wistar machos foram tratados com veículo ou metirapona, um bloqueador de síntese de corticosterona, e expostos a um contexto previamente pareado com choque nas patas. Foram avaliados o tempo de medo contextual (comportamento de congelamento) e a expressão de proteína Fos em diferentes regiões do CPFm. Os resultados mostraram que a exposição ao contexto aversivo levou a um aumento significativo da expressão de congelamento e de proteína Fos no PrL, nas áreas do córtex cingulado anterior 1 e 2 (Cg1 e Cg2), mas não no córtex infralímbico. A administração de metirapona levou a uma diminuição da expressão de congelamento e de proteína Fos no PrL, Cg1 e Cg2. A administração bilateral de espironolactona, um antagonista de receptores MR, no PrL antes do teste diminuiu as respostas de medo e o pré-tratamento com RU38486, um antagonista de receptores GR, aboliu este efeito. Os resultados também mostraram que a diminuição da resposta de congelamento induzida por injeções intra-PrL de corticosterona foi abolida pela administração prévia de RU38486, mas não por espironolactona, indicando que a corticosterona recruta preferencialmente os receptores GR para produzir esses efeitos. A administração prévia do antagonista de receptor NMDA também preveniu os efeitos induzidos pelo tratamento com corticosterona sugerindo que, no PrL, parte dos efeitos rápidos do glicocorticóides sobre a expressão do medo condicionado se dá por uma interação com o sistema glutamatérgico. A administração de NMDA no PrL, antes do teste, induziu efeitos similares ao tratamento com corticosterona nessa região. De modo geral, os resultados sugerem que a liberação de corticosterona durante a apresentação de um estímulo condicionado aversivo influencia a atividade do CPFm de maneira que, uma mudança no equilíbrio das atividades mediadas por MR e GR, por meio de um aumento da atividade de GR, interage com o sistema glutamatérgico via aumento da atividade dos receptores NMDA influenciando a expressão da resposta de medo condicionado contextual. Sugere-se que a redução na expressão do medo condicionado observada após a administração local de corticosterona no PrL também seja decorrente de mudanças no equilíbrio entre MR e GR em direção a um aumento de suas ações mediadas por GR, assim como um aumento na liberação de glutamato e maior atividade de receptores NMDA nessa região. / Changes in the glutamatergic system and in the functioning of the medial prefrontal cortex (mPFC) have been associated with different psychiatric disorders, including anxiety. It is also recognized that changes in circulating levels of glucocorticoids can induce changes in glutamatergic synapses and circuits and therefore alter the emotional reactivity of animals. Although is known that glucocorticoids can influence the release of glutamate in the mPFC, the interaction between mineralocorticoid receptors (MR) and glucocorticoid receptors (GR) activation and the glutamatergic activity on the expression of conditioned fear response is not yet elucidated. The aims of the present study were to investigate (i) the influence of glucocorticoids on the expression of contextual conditioned fear and its effects in the activity of the mPFC in rats, (ii) the role of MR and GR in the prelimbic cortex (PrL) on expression of conditioned freezing response and (iii) a possible interaction between the effects mediated by the glucocorticoids and the glutamatergic system, via NMDA receptors on the expression of this response. Male Wistar rats were treated with vehicle or metyrapone, a corticosterone synthesis blocker, and exposed to a context previously paired with footshock. The time of contextual fear (freezing behavior) and Fos protein expression in different regions of mPFC were evaluated. The results showed that exposure to the aversive context induced a significant increase in freezing and Fos protein expression in the PrL, in the anterior cingulate cortex, areas 1 and 2 (Cg1 and Cg2), but not in the infralimbic cortex. The administration of metyrapone induced a decrease on the expression of freezing and Fos in PrL, Cg1 and Cg2. Bilateral administration of spironolactone (a MR antagonist) in PrL before the test, decreased conditioned fear response and the pretreatment with RU38486 (a GR antagonist) abolished this effect. The results also showed that the decrease of freezing response induced by intra-PrL corticosterone injections was abolished by prior administration of RU38486, but not by spironolactone, indicating that corticosterone recruits preferentially GR to produce the observed effects. Prior administration of the NMDA receptor antagonist also prevented the effects induced by corticosterone treatment in the PrL, suggesting that part of rapid effects of glucocorticoids on the expression of conditioned fear occurs by an interaction with the glutamatergic system. Additionally, NMDA administration in the PrL prior to the test induced similar effects to corticosterone treatment in this region. Overall, the results suggest that the release of corticosterone during the presentation of a conditioned aversive stimulus influences the mPFC activity so that a change in the balance of the activities mediated by MR and GR through an increase in GR activity interacts with the glutamatergic system by increasing the activity of NMDA receptors influencing the expression of contextual fear conditioning response. It is suggested that the reduction in the expression of conditioned fear observed after local administration of corticosterone in the PrL is also due to changes in the balance between MR and GR towards an increase in the actions mediated by GR, as well as an increase in the release of glutamate and a greater NMDA receptor activity in this region.

É reconhecido que as experiências que geram reações de medo são praticamente indeléveis do encéfalo dos organismos e que condicionamentos aversivos suscitam inúmeras respostas defensivas, como o congelamento, sendo esta resposta um indicador de medo em roedores. Vários trabalhos têm apontado para a relação entre alterações na transmissão dopaminérgica e os estados aversivos. Entretanto, observam-se resultados conflitantes com a utilização de drogas dopaminérgicas em diferentes modelos animais de ansiedade. Assim, investigações devem ainda ser realizadas objetivando avaliar a funcionalidade da modulação dopaminérgica nos estados emocionais aversivos. O objetivo do presente estudo foi avaliar o envolvimento de mecanismos dopaminérgicos na expressão do medo condicionado ao contexto. Inicialmente foram avaliados os efeitos de agonistas (SKF 38393 e quimpirole) e antagonistas (SCH 23390 e sulpirida) de receptores D1 e D2 administrados sistemicamente sobre a expressão do medo condicionado contextual, sendo mensurado o tempo de congelamento dos animais. A atividade motora foi avaliada com o teste do campo aberto. Os resultados indicam que os receptores da família D2, e não D1, estão envolvidos na expressão do medo condicionado contextual, uma vez que a administração de quimpirole e sulpirida, mas não de SCH 23390 e SKF 38393, levou a uma diminuição do congelamento condicionado ao contexto. Não houve alterações na atividade motora dos animais. Com base nestes resultados foi levantada a hipótese de que a capacidade da sulpirida e do quimpirole em diminuir o medo condicionado poderia ocorrer devido a uma ação em receptores pós-sinápticos de estruturas do sistema mesocorticolímbico e em autoreceptores da área tegmental ventral (ATV), respectivamente, levando ao efeito comum de diminuição da atividade dopaminérgica. A fim de testar esta hipótese, foram realizadas microinjeções de quimpirole na ATV. Os resultados obtidos mostram uma diminuição da expressão do congelamento condicionado e que os efeitos obtidos com a administração sistêmica desse agonista de receptores D2 provavelmente devem-se a sua ação na ATV. Portanto, a ATV parece atuar na modulação das respostas de medo condicionado e a ativação desta estrutura deve ser importante para a recuperação da aprendizagem aversiva ocorrida no dia do condicionamento. / It is well established that experiences that generate fear reactions are practically unforgettable and that aversive conditioning raises several defensive responses such as freezing, which is an index of fear in rodents. Several studies have pointed to the existence of a relationship between changes in dopaminergic neurotransmission and aversive states. However, there are conflicting results in the literature with the use of dopaminergic drugs in different animal models of anxiety. Thus, further investigations should be conducted to evaluate the importance of dopaminergic modulation of aversive states. The aim of the present study was to evaluate the involvement of dopaminergic neurotransmission in the expression of contextual conditioned fear in rats. Initially, we evaluated the effects of intraperitoneal injections of D1 and D2 receptors agonists (SKF 38393 and quinpirole) and antagonists (SCH 23390 and sulpiride) in the expression of contextual conditioned fear by measuring the time of freezing response of the animals. The motor activity was evaluated in the open field test. The results indicate that the D2 receptors, but not D1 receptors, are involved in the expression of contextual conditioned fear, since administration of quinpirole and sulpiride, but not SCH 23390 and SKF 38393, decreased conditioned freezing to the context. There were no changes in motor activity of animals. Based on these results it was hypothesized that quinpirole and sulpiride probably acted on presynaptic and postsynaptic D2 receptors, respectively, leading to a decrease of dopaminergic neurotransmission in both cases. To test this hypothesis, microinjections of quinpirole were performed into the ventral tegmental area (VTA). The results show a decrease in the expression of conditioned freezing, indicating that the effects obtained with the intraperitoneal administration of the dopamine D2 receptor agonist is probably due to its action in the VTA. Therefore, dopaminergic mechanisms in the VTA seem to be important in the modulation of conditioned fear responses and activation of this structure appears to take place during the fear memory following the context aversive conditioning.

É reconhecido que as experiências que geram reações de medo são praticamente indeléveis do encéfalo dos organismos e que condicionamentos aversivos suscitam inúmeras respostas defensivas, como o congelamento, sendo esta resposta um indicador de medo em roedores. Vários trabalhos têm apontado para a relação entre alterações na transmissão dopaminérgica e os estados aversivos. Entretanto, observam-se resultados conflitantes com a utilização de drogas dopaminérgicas em diferentes modelos animais de ansiedade. Assim, investigações devem ainda ser realizadas objetivando avaliar a funcionalidade da modulação dopaminérgica nos estados emocionais aversivos. O objetivo do presente estudo foi avaliar o envolvimento de mecanismos dopaminérgicos na expressão do medo condicionado ao contexto. Inicialmente foram avaliados os efeitos de agonistas (SKF 38393 e quimpirole) e antagonistas (SCH 23390 e sulpirida) de receptores D1 e D2 administrados sistemicamente sobre a expressão do medo condicionado contextual, sendo mensurado o tempo de congelamento dos animais. A atividade motora foi avaliada com o teste do campo aberto. Os resultados indicam que os receptores da família D2, e não D1, estão envolvidos na expressão do medo condicionado contextual, uma vez que a administração de quimpirole e sulpirida, mas não de SCH 23390 e SKF 38393, levou a uma diminuição do congelamento condicionado ao contexto. Não houve alterações na atividade motora dos animais. Com base nestes resultados foi levantada a hipótese de que a capacidade da sulpirida e do quimpirole em diminuir o medo condicionado poderia ocorrer devido a uma ação em receptores pós-sinápticos de estruturas do sistema mesocorticolímbico e em autoreceptores da área tegmental ventral (ATV), respectivamente, levando ao efeito comum de diminuição da atividade dopaminérgica. A fim de testar esta hipótese, foram realizadas microinjeções de quimpirole na ATV. Os resultados obtidos mostram uma diminuição da expressão do congelamento condicionado e que os efeitos obtidos com a administração sistêmica desse agonista de receptores D2 provavelmente devem-se a sua ação na ATV. Portanto, a ATV parece atuar na modulação das respostas de medo condicionado e a ativação desta estrutura deve ser importante para a recuperação da aprendizagem aversiva ocorrida no dia do condicionamento. / It is well established that experiences that generate fear reactions are practically unforgettable and that aversive conditioning raises several defensive responses such as freezing, which is an index of fear in rodents. Several studies have pointed to the existence of a relationship between changes in dopaminergic neurotransmission and aversive states. However, there are conflicting results in the literature with the use of dopaminergic drugs in different animal models of anxiety. Thus, further investigations should be conducted to evaluate the importance of dopaminergic modulation of aversive states. The aim of the present study was to evaluate the involvement of dopaminergic neurotransmission in the expression of contextual conditioned fear in rats. Initially, we evaluated the effects of intraperitoneal injections of D1 and D2 receptors agonists (SKF 38393 and quinpirole) and antagonists (SCH 23390 and sulpiride) in the expression of contextual conditioned fear by measuring the time of freezing response of the animals. The motor activity was evaluated in the open field test. The results indicate that the D2 receptors, but not D1 receptors, are involved in the expression of contextual conditioned fear, since administration of quinpirole and sulpiride, but not SCH 23390 and SKF 38393, decreased conditioned freezing to the context. There were no changes in motor activity of animals. Based on these results it was hypothesized that quinpirole and sulpiride probably acted on presynaptic and postsynaptic D2 receptors, respectively, leading to a decrease of dopaminergic neurotransmission in both cases. To test this hypothesis, microinjections of quinpirole were performed into the ventral tegmental area (VTA). The results show a decrease in the expression of conditioned freezing, indicating that the effects obtained with the intraperitoneal administration of the dopamine D2 receptor agonist is probably due to its action in the VTA. Therefore, dopaminergic mechanisms in the VTA seem to be important in the modulation of conditioned fear responses and activation of this structure appears to take place during the fear memory following the context aversive conditioning.

OLIVEIRA, A.R. Envolvimento de receptores dopaminérgicos da área tegmental ventral e do complexo basolateral da amígdala na aquisição e na expressão do medo condicionado. 2010. 93 f. Tese (Doutorado) Faculdade de Filosofia, Ciências e Letras de Ribeirão Preto, Universidade de São Paulo. O condicionamento Pavloviano é um dos paradigmas mais utilizados para estudar as bases biológicas das emoções, assim como da aprendizagem e memória. A dopamina (DA) é um dos principais neurotransmissores envolvidos na mediação de estados de medo e ansiedade. Um conjunto crescente de evidências dá suporte à hipótese de que a ativação da via mesocorticolímbica, proveniente de neurônios dopaminérgicos da área tegmental ventral (ATV), é particularmente sensível à estimulação aversiva. Entre as regiões inervadas por esta via, o complexo basolateral da amígdala (BLA) é um componente essencial dos circuitos neurais do medo condicionado. Assim, o presente estudo explorou o envolvimento de mecanismos DA da ATV e do BLA, através do uso de agonistas e antagonistas de receptores DA, na aquisição e expressão do medo condicionado à luz. Não houve efeito das drogas DA no sobressalto potencializado pelo medo (SPM), quando injetadas na ATV antes do condicionamento, indicando que os receptores DA da ATV não participam da aquisição do medo condicionado à luz. Ao contrário, quando injetado na ATV antes do teste, quimpirole (agonista D2) reduziu o SPM, enquanto as demais drogas não tiveram efeito. A administração de SCH 23390 (antagonista D1) no BLA não produziu efeitos no SPM, indicando que os receptores D1 do BLA não parecem envolvidos na expressão do SPM. Já a administração de sulpirida (antagonista D2) no BLA inibiu o SPM produzido pela luz. Além disso, a expressão do medo condicionado foi associada a um aumento do congelamento e dos níveis extracelulares de DA no BLA, ambos inibidos com a administração de quimpirole na ATV. A capacidade do quimpirole em diminuir o SPM e o congelamento condicionado parece ser resultado de sua ação em auto-receptores D2 da ATV. A ativação desses receptores diminui os níveis de dopamina em áreas que recebem terminações da via mesocorticolímbica. Os resultados com a sulpirida realçam a importância dos receptores D2 do BLA na expressão do medo condicionado Pavloviano. / OLIVEIRA, A.R. Involvement of dopaminergic receptors of ventral tegmental area and basolateral amygdala in the acquisition and expression of conditioned fear. 2010. 93 p. Thesis (Doctoral) Faculdade de Filosofia, Ciências e Letras de Ribeirão Preto, Universidade de São Paulo. The Pavlovian fear conditioning is one of the most used paradigms to study the biological basis of emotion, as well as of learning and memory. Dopamine (DA) is one of the most important neurotransmitters involved in mechanisms underlying states of fear and anxiety. A growing body of evidence supports the hypothesis that excitation of the mesocorticolimbic pathway, originating from DA neurons in the ventral tegmental area (VTA), is particularly sensitive to fear-arousing stimuli. Among the forebrain regions innervated by this pathway, the basolateral amygdala (BLA) is an essential component of the neural circuitry of conditioned fear. The present study explored the involvement of VTA and BLA DA receptors, using DA agonists and antagonists, in the acquisition and expression of conditioned fear to a light conditioned stimulus (CS). None of the drugs used produced significant effects on fear-potentiated startle (FPS) when injected in VTA before conditioning, indicating that VTA DA receptors are not involved in the acquisition of conditioned fear to a light-CS. In contrast, when injected before the test session, intra-VTA quinpirole (D2 agonist) significantly reduced FPS, whereas the other drugs had no effect. Intra-BLA SCH 23390 (D1 antagonist) did not produce significant effects on FPS, indicating that BLA D1 receptors do not appear to be involved in the expression of FPS. On the other hand, intra-BLA sulpiride (D2 antagonist) inhibited FPS produced by light-CS previously paired with footshocks. Also, conditioned fear was associated with increased freezing and DA levels in the BLA, both inhibited by intra-VTA quinpirole. Quinpirole\'s ability to decrease FPS and conditioned freezing may be the result of an action on VTA D2 presynaptic autoreceptors. The activation of those receptors decreases dopamine levels in terminal fields of the mesocorticolimbic pathway. Sulpirides results stress the importance of BLA D2 receptors in the fear-activating effects of the Pavlovian conditioning.

Alterações no sistema glutamatérgico e mudanças no funcionamento do córtex pré-frontal medial (CPFm) têm sido associadas a diversos distúrbios psiquiátricos, dentre os quais a ansiedade. Também é reconhecido que alterações nas concentrações circulantes de glicocorticóides podem induzir alterações nas sinapses e circuitos glutamatérgicos e, consequentemente, modificar a reatividade emocional dos animais. Embora se saiba que os glicocorticóides influenciam a liberação de glutamato no CPFm, a interação entre os efeitos mediados pelos receptores mineralocorticóides (MR) ou glicocorticóides (GR) e o sistema glutamatérgico, na expressão da resposta condicionada de medo, ainda não está elucidada. Nesse sentido, os objetivos do presente estudo foram investigar (i) a influência dos glicocorticóides na expressão do medo condicionado contextual e seus efeitos sobre a atividade do CPFm em ratos, (ii) o papel dos receptores MR e GR localizados no córtex prelímbico (PrL) na expressão da resposta condicionada de congelamento e (iii) a interação entre os mecanismos mediados pelos glicocorticoides e o sistema glutamatérgico, via receptores do tipo NMDA, na expressão dessa resposta. Ratos Wistar machos foram tratados com veículo ou metirapona, um bloqueador de síntese de corticosterona, e expostos a um contexto previamente pareado com choque nas patas. Foram avaliados o tempo de medo contextual (comportamento de congelamento) e a expressão de proteína Fos em diferentes regiões do CPFm. Os resultados mostraram que a exposição ao contexto aversivo levou a um aumento significativo da expressão de congelamento e de proteína Fos no PrL, nas áreas do córtex cingulado anterior 1 e 2 (Cg1 e Cg2), mas não no córtex infralímbico. A administração de metirapona levou a uma diminuição da expressão de congelamento e de proteína Fos no PrL, Cg1 e Cg2. A administração bilateral de espironolactona, um antagonista de receptores MR, no PrL antes do teste diminuiu as respostas de medo e o pré-tratamento com RU38486, um antagonista de receptores GR, aboliu este efeito. Os resultados também mostraram que a diminuição da resposta de congelamento induzida por injeções intra-PrL de corticosterona foi abolida pela administração prévia de RU38486, mas não por espironolactona, indicando que a corticosterona recruta preferencialmente os receptores GR para produzir esses efeitos. A administração prévia do antagonista de receptor NMDA também preveniu os efeitos induzidos pelo tratamento com corticosterona sugerindo que, no PrL, parte dos efeitos rápidos do glicocorticóides sobre a expressão do medo condicionado se dá por uma interação com o sistema glutamatérgico. A administração de NMDA no PrL, antes do teste, induziu efeitos similares ao tratamento com corticosterona nessa região. De modo geral, os resultados sugerem que a liberação de corticosterona durante a apresentação de um estímulo condicionado aversivo influencia a atividade do CPFm de maneira que, uma mudança no equilíbrio das atividades mediadas por MR e GR, por meio de um aumento da atividade de GR, interage com o sistema glutamatérgico via aumento da atividade dos receptores NMDA influenciando a expressão da resposta de medo condicionado contextual. Sugere-se que a redução na expressão do medo condicionado observada após a administração local de corticosterona no PrL também seja decorrente de mudanças no equilíbrio entre MR e GR em direção a um aumento de suas ações mediadas por GR, assim como um aumento na liberação de glutamato e maior atividade de receptores NMDA nessa região. / Changes in the glutamatergic system and in the functioning of the medial prefrontal cortex (mPFC) have been associated with different psychiatric disorders, including anxiety. It is also recognized that changes in circulating levels of glucocorticoids can induce changes in glutamatergic synapses and circuits and therefore alter the emotional reactivity of animals. Although is known that glucocorticoids can influence the release of glutamate in the mPFC, the interaction between mineralocorticoid receptors (MR) and glucocorticoid receptors (GR) activation and the glutamatergic activity on the expression of conditioned fear response is not yet elucidated. The aims of the present study were to investigate (i) the influence of glucocorticoids on the expression of contextual conditioned fear and its effects in the activity of the mPFC in rats, (ii) the role of MR and GR in the prelimbic cortex (PrL) on expression of conditioned freezing response and (iii) a possible interaction between the effects mediated by the glucocorticoids and the glutamatergic system, via NMDA receptors on the expression of this response. Male Wistar rats were treated with vehicle or metyrapone, a corticosterone synthesis blocker, and exposed to a context previously paired with footshock. The time of contextual fear (freezing behavior) and Fos protein expression in different regions of mPFC were evaluated. The results showed that exposure to the aversive context induced a significant increase in freezing and Fos protein expression in the PrL, in the anterior cingulate cortex, areas 1 and 2 (Cg1 and Cg2), but not in the infralimbic cortex. The administration of metyrapone induced a decrease on the expression of freezing and Fos in PrL, Cg1 and Cg2. Bilateral administration of spironolactone (a MR antagonist) in PrL before the test, decreased conditioned fear response and the pretreatment with RU38486 (a GR antagonist) abolished this effect. The results also showed that the decrease of freezing response induced by intra-PrL corticosterone injections was abolished by prior administration of RU38486, but not by spironolactone, indicating that corticosterone recruits preferentially GR to produce the observed effects. Prior administration of the NMDA receptor antagonist also prevented the effects induced by corticosterone treatment in the PrL, suggesting that part of rapid effects of glucocorticoids on the expression of conditioned fear occurs by an interaction with the glutamatergic system. Additionally, NMDA administration in the PrL prior to the test induced similar effects to corticosterone treatment in this region. Overall, the results suggest that the release of corticosterone during the presentation of a conditioned aversive stimulus influences the mPFC activity so that a change in the balance of the activities mediated by MR and GR through an increase in GR activity interacts with the glutamatergic system by increasing the activity of NMDA receptors influencing the expression of contextual fear conditioning response. It is suggested that the reduction in the expression of conditioned fear observed after local administration of corticosterone in the PrL is also due to changes in the balance between MR and GR towards an increase in the actions mediated by GR, as well as an increase in the release of glutamate and a greater NMDA receptor activity in this region.

[pt] A suscetibilidade ao estresse é ditada por fatores externos e internos. Fatores externos estão associados a variáveis ambientais, enquanto os internos estão relacionados à função cerebral, cognição, constituição genética e epigenética e ao microbioma. Nesta tese, investigamos a influência das respostas individuais de enfrentamento ao medo sobre os efeitos do estresse crônico e sua modulação por uma dieta rica em calorias. Nesse intento, foram usadas as linhagens de cruzamento bidirecional Carioca como modelos de respostas opostas ao medo contextual condicionado. Inicialmente, caracterizamos essas linhagens quanto às suas respostas de congelamento após a aprendizagem e a extinção de medo. Em seguida, descrevemos em uma meta-análise o envolvimento da via serotoninérgica, importante mecanismo nos transtornos de ansiedade e medo, nos efeitos do estresse crônico. Finalmente, demonstramos que o estresse crônico tem efeitos mais fortes em ratos Cariocas de alto congelamento (CHF), alterando o equilíbrio entre as respostas de enfrentamento ativas e passivas em vários paradigmas comportamentais; por outro lado, os ratos Carioca de baixo congelamento (CLF) são minimamente afetados. Além disso, uma dieta suplementada com alimentos ricos em açúcar e gordura pode proteger os ratos CHF contra os efeitos do estresse crônico. Assim, demonstramos os efeitos adversos do estresse crônico em um modelo de transtorno de ansiedade generalizada e propomos que a suscetibilidade ao estresse está ligada à características individuais e inatas de medo e de transtorno de ansiedade, podendo ser alvo de novas terapias para transtornos de humor. / [en] Susceptibility to stress is dictated by external and internal factors. External factors are associated with environmental variables, whereas the internals are related to brain function, cognition, genetic and epigenetic constitution and the microbiome. In this thesis, we investigated the influence of the individual background underlying fear-coping responses on the effects of chronic stress and its modulation by a palatable diet. We used the Carioca bidirectional breeding lines as models of opposing conditioned contextual fear responses. At first, we characterize these lines concerning their freezing responses after fear learning and extinction. Then, we describe in a meta-analysis the involvement of the serotoninergic pathway, an important mechanism in anxiety and fear disorders, in the effects of chronic stress. Following, we demonstrate that chronic stress has stronger effects in the Carioca high-conditioned freezing (CHF) rats, altering the balance between active and passive coping responses in several behavioral paradigms; conversely, the Carioca low-conditioned freezing (CLF) rats are barely affected. Moreover, a diet supplemented with high-sugar and high-fat food can protect the CHF against the effects of chronic stress. Thus, we demonstrate the increased harmful effects of chronic stress in a model of generalized anxiety disorder and propose that susceptibility to stress is linked to fear and anxiety individual innate characteristics, which can be the target of novel therapies of mood disorders.