Zugl.: München, University, Diss., 2009.

Na medicina equina, procedimentos cirúrgicos ortopédicos, principalmente os que envolvem fixação de fratura, apresentam um grande índice de infecção e mortalidade. Diferentes métodos de liberação local de antibiótico têm sido utilizados com sucesso na profilaxia e tratamento das infecções musculoesqueléticas. O objetivo da presente investigação foi avaliar a capacidade da poliuretana de mamona como dispositivo de liberação local de antibiótico in vitro já que não existem relatos deste polímero para tal finalidade, além de analisar o efeito bactericida da gentamicina liberada pelo polímero. Foram confeccionados 40 corpos de prova de polímero de mamona, divididos igualmente em 4 grupos, sendo um grupo controle, este sem adição de sulfato de gentamicina e três grupos com diferentes concentrações de gentamicina (6, 12 e 24 mg/g de polímero), onde avaliou-se a liberação de gentamicina em solução PBS com pH 7,4 através da espectrofotometria colorimétrica com reação da ninhidrina em diferentes dias (01, 02, 07, 14, 21 e 28). A espectrofotometria colorimétrica com reação da ninhidrina não se mostrou o método de análise adequado para avaliar a liberação a partir deste polímero, porém a poliuretana de mamona mostrou-se efetiva como mecanismo de liberação de gentamicina quando avaliada in vitro em culturas de S. aureus. / In equine medicine, orthopedic procedures, especially those involving fracture fixation, presented a high rate of infection and mortality. Different methods of local release of antibiotics have been used successfully for prophylaxis and treatment of orthopaedic infections. The objective of this research was to evaluate the ability of castor oil polyurethane as a controlled release local antibiotic in vitro since there are no reports of this polymer for this purpose and the bactericidal effect of gentamicin released. Were prepared 40 samples of castor oil polymer, divided equally into four groups, one control group, without this addition of gentamicin sulfate and three groups with different concentrations of gentamicin (6, 12 and 24 mg / g of polymer) that was evaluated the release of gentamycin in PBS at pH 7.4 by spectrophotometry colorimetric reaction with ninhydrin in different days (01, 02, 07, 14, 21 and 28). The spectrophotometry colorimetric reaction with ninhydrin did not prove to be an appropriate method of analysis for assessing the release from this polymer, but the castor oil polyurethane proved to be an effective as a mechanism for release of gentamicin when evaluated in vitro in cultures of S. aureus

This study is designed to investigate via discriminant analysis the factors that are associated with the clinical outcome and nephrotoxicity in patients receiving gentamicin.

The presented works aimed on the analysis of new impurities in APIs and medicinal products. Different subtypes of LC were coupled to suitable detection methods, i.e. UV and various MS techniques, depending on the chemical natures of the analytes and the analytical task. Unexpected impurities in medicinal products and APIs caused several scandals in the past, concomitant with fatalities or severe side effects in human and veterinary patients. The detection of nitrosamines in sartans led to the discovery of nitrosamines in various other drugs, of which the antibiotic rifampicin was analyzed in this work. An examination of the synthesis of rifampicin revealed a high potential for the formation of 4-methyl-1-nitrosopiperazine (MeNP). An LC-MS/HRMS method suitable for the quantification of MeNP was applied in the analysis of drugs collected from Brazil, Comoros, India, Nepal, and Tanzania, where a single dose of rifampicin is used in the post-exposure prophylaxis of leprosy. All batches were contaminated with MeNP, ranging from 0.7-5.1 ppm. However, application of rifampicin containing up to 5 ppm MeNP was recommended by the regulatory authorities for the post-exposure prophylaxis of leprosy. In the 1990s the aminoglycoside antibiotic gentamicin attracted attention after causing fatalities in the USA, but the causative agent was never identified unequivocally. The related substance sisomicin was recognized as a lead impurity by the Holzgrabe lab at the University of Würzburg: sisomicin was accompanied by a variety of other impurities and batches containing sisomicin had caused the fatalities. In 2016, anaphylactic reactions were reported after application of gentamicin. A contamination of the medicinal products with histamine, an impurity of the raw material fish peptone used upon the production, could be identified as the cause of the adverse effects. Batches of gentamicin sulfate, which had been stored at the University of Würzburg since the earlier investigations, were analyzed regarding their contamination with histamine to determine whether the biogenic amine was responsible for the 1990s fatalities as well. Furthermore, a correlation with the lead impurity sisomicin was checked. Histamine could be detected in all analyzed batches, but at a lower level than in the batches responsible for the anaphylactic reactions. Moreover, there is no correlation of histamine with the lead impurity sisomicin. Hence, the causative agent for the 1990s fatalities was not histamine and remains unknown. Another source of impurities is the reaction of APIs with excipients, e.g. the esterification of naproxen with PEG 600 in soft gel capsules. The influence of the formulation’s composition on this reaction was investigated by means of LC-UV. Therefore, the impurity naproxen-PEG-ester (NPEG) was synthesized and used for the development of a method suitable for the analysis of soft gel capsule formulations. Different formulations were stressed for 7 d at 60 °C and the relative amount of NPEG was determined. The formation of NPEG was influenced by the concentrations of water and lactic acid, the pH, and the drug load of the formulation, which can easily be explained by the chemistry behind esterification reactions. Keeping in mind the huge variety of sources of impurities, it might be impossible to predict all potential impurities of a drug substance/product. Targeted and untargeted approaches were combined in the impurity profiling of bisoprolol fumarate. Eight versions of an LC-HRMS method were developed to enable the detection of a maximum number of impurities: an acidic and a basic buffered LC was coupled to MS detection applying ESI and APCI, both in positive in negative mode. MS and MS/MS data were acquired simultaneously by information dependent acquisition. In the targeted approach, potential impurities were derived from a reaction matrix based on the synthesis route of the API, while the untargeted part was based on general unknown comparative screening to identify additional signals. 18 and 17 impurities were detected in the targeted and the untargeted approach, respectively. The molecular formulae were assessed based on the exact mass and the isotope pattern. Theoretical fragment spectra generated by in silico fragmentation were matched with experimental data to estimate the plausibility of proposed/elucidated structures. Moreover, the detected impurities were quantified with respect to an internal standard. / In den vorgestellten Projekten wurden neue Verunreinigungen in Arzneistoffen und Arzneimitteln untersucht. Verschiedene flüssigchromatographische Methoden wurden mit geeigneten Detektionsverfahren gekoppelt. UV-Detektion und verschiedene massenspektrometrische Techniken wurden in Abhängigkeit der chemischen Eigenschaften der Analyten und der analytischen Herausforderung ausgewählt. Eine Kontamination von Wirkstoffen bzw. humanen und veterinären Arzneimittel mit unerwarteten Verunreinigungen löste mehrere Skandale aus, die mit Todesfällen oder ernsthaften Nebenwirkungen einhergingen. Die Identifikation von Nitrosamin-Verunreinigungen in Sartanen führte zur Entdeckung von Nitrosaminen in verschiedenen anderen Wirkstoffen, z.B. im Antibiotikum Rifampicin, das in dieser Arbeit untersucht wurde. Eine Betrachtung der Rifampicin-Synthese offenbarte ein hohes Potenzial der Bildung von 4-Methyl-1-nitrosopiperazin (MeNP). Arzneimittel aus Brasilien, Indien, Nepal, Tansania und von den Komoren wurden mittels LC-MS/HRMS bezüglich ihres MeNP-Gehaltes analysiert. Alle untersuchten Chargen waren mit MeNP im Bereich von 0.7-5.1 ppm belastet. Rifampicin wird in den genannten Ländern unter anderem als Einzeldosis zur Postexpositionsprophylaxe von Lepra eingesetzt. Für diese Indikation empfehlen die Zulassungsbehörden die Verwendung von Rifampicin mit bis zu 5 ppm MeNP. Das Aminoglycosid-Antibiotikum Gentamicin löste in den 1990er Jahren Todesfälle in den USA aus. Die verantwortliche Verunreinigung wurde nie eindeutig aufgeklärt, doch die verwandte Substanz Sisomicin wurde durch den Arbeitskreis Holzgrabe an der Universität Würzburg als Leitverunreinigung identifiziert: Sisomicin ging mit einer Vielzahl von weiteren Verunreinigungen einher und Sisomicin-reiche Chargen hatten die Todesfälle ausgelöst. 2016 traten anaphylaktische Reaktionen nach Gentamicin-Anwendung auf. Histamin war als Verunreinigung von Fischpepton, einem Ausgangsmaterial der Produktion, in den Wirkstoff gelangt. Um zu überprüfen, ob Histamin auch für die Todesfälle in den 1990er Jahren verantwortlich war, wurden seit den früheren Untersuchungen gelagerte Gentamicin-Chargen bezüglich ihrer Verunreinigung mit Histamin untersucht. Außerdem wurde überprüft, ob es einen Zusammenhang mit dem Sisomicin-Gehalt gibt. In allen untersuchten Proben wurde Histamin gefunden, allerdings in einer geringeren Konzentration als in Chargen, die anaphylaktische Reaktionen ausgelöst hatten. Des Weiteren konnte kein Zusammenhang mit der Leitverunreinigung Sisomicin erkannt werden. Der Auslöser der Todesfälle in den 1990er Jahren war somit nicht Histamin, sondern bleibt weiterhin unbekannt. Ein weiterer Ursprung von Verunreinigungen ist die Reaktion des Wirkstoffs mit Hilfsstoff(en), z.B. die Veresterung von Naproxen mit PEG in Weichkapseln. Der Einfluss von Veränderungen der Formulierung auf diese Reaktion wurde mittels LC-UV untersucht. Die Verunreinigung Naproxen-PEG-Ester (NPEG) wurde synthetisiert und zur Entwicklung einer Methode zur Analyse von Weichkapsel-Formulierungen verwendet. Verschiedene Formulierungen wurden für 7 Tage bei 60 °C gestresst und deren relative Gehalte an NPEG bestimmt. Dabei war die Bildung von NPEG von der Wasser- und der Milchsäure-Konzentration, dem pH und dem Wirkstoffgehalt der Formulierung abhängig. Sämtliche Einflüsse konnten durch die Art der Reaktion (Veresterung) erklärt werden. Vor dem Hintergrund der vielfältigen Quellen für Verunreinigungen erscheint es unmöglich, alle potenziellen Verunreinigungen eines Wirkstoffs/Arzneimittels vorherzusagen. Gerichtete und ungerichtete Ansätze wurden daher für die Erstellung eines Verunreinigungsprofils von Bisoprololfumarat kombiniert. Um eine möglichst große Anzahl von möglichen Substanzen zu detektieren, wurden 8 LC-MS/HRMS-Methoden entwickelt: je eine saure und eine basische mobile Phase der LC wurde mit massenspektrometrischer Detektion mittels ESI und APCI, jeweils im positiv- und negativ-Modus kombiniert. MS- und MS/MS-Daten wurden simultan durch information dependent acquisition aufgenommen. Für den gerichteten Ansatz wurde eine Reaktionsmatrix auf Basis der Synthese des Wirkstoffs angefertigt und ausgehend davon potenzielle Verunreinigungen abgeleitet. Im ungerichteten Ansatz wurden mittels general unknown comparative screening zusätzliche Signale identifiziert. Der gerichtete Ansatz zeigte die Anwesenheit von 18, der ungerichtete von 17 Verunreinigungen. Summenformeln wurden anhand der exakten Masse und des Isotopenmusters der Signale bewertet. Die Plausibilität von Strukturformeln wurde mittels In-silico-Fragmentierung abgeschätzt, wobei experimentelle und theoretische Fragmentspektren in Einklang gebracht wurden. Außerdem wurden alle detektierten Verunreinigungen mittels eines externen Standards quantifiziert.

The objective of this project was to develop a DNA hybridization sensor that can detect the presence of E. coli and reveal its resistance to the drug gentamicin. This probe will enable rapid and user-friendly diagnostics of E. coli infections and analysis of bacterial gentamicin-susceptibility profile by interrogation of a fragment of E. coli 16S rRNA bearing a substitution in the gentamicin-resistant cells. The sensor is promising for the point-of-care use to provide a timely UTI diagnostic solution. A quick diagnosis of E. coli infection and antibiotic resistance is crucial for treatment. To design a hybridization probe, we proposed a split approach for target interrogation and catalytic activity of a peroxidase-like deoxyribozyme (PDz) as a signal reporter. PDz contains a series of guanine residues in a strand and has been shown to form a parallel guanine-quadruplex (G4). This G4, with the addition of a hemin cofactor, catalyzes the reaction similar to that of horseradish peroxidase. If a colorless organic indicator is added to the G4-PDz-hemin containing solution and mixed H2O2, a colored oxidation product is formed (e.g., a dark blue/green). The color change reports the presence of the catalytically active G4, which occurs only when the nucleotide sequence of the target is a perfect match. When the target is not a perfect match, for example, in the case of the drug-causing nucleotide substitution, the G4 does not form, and there is no color change. The probes tested in this paper show promising results of such a sensor by being able to catalyze the described colorimetric reaction to generate a strong signal in the presence of a "gentamicin-susceptible" target and show selectivity against the "gentamicin-resistant" target.

Autoregulation of renal blood flow is partly mediated by antagonistic vasodilating and vasoconstricting effects of products of the arachidonic acid cascade. Vasodilatory prostaglandins have been evaluated in experimental models of acute renal failure and clinical human medicine, with variable results. This study assessed potential protective effects of an oral prostaglandin E₁ analogue, misoprostol, in gentamicin-induced nephrotoxicosis in dogs. Twelve dogs were initially assessed to be clinically healthy and to have normal renal function. Each received gentamicin (10 mg/kg intravenously, every 8 hours) for 8 days. Six dogs received oral placebo and 6 received misoprostol (3 µg/kg by mouth, every 8 hours) for the duration of study. Serum biochemical profiles, urinalyses, and exogenous creatinine clearances were monitored every 2 to 3 days. Three dogs receiving misoprostol were withdrawn early because of severity of clinical signs. Changes in serum urea nitrogen, creatinine, potassium, chloride, total protein, and urine protein-to-creatinine ratio appeared more severe in dogs receiving misoprostol, but were not significantly different between groups over time. Exogenous creatinine clearances were significantly decreased in dogs receiving misoprostol. Histopathological changes included patchy necrosis of renal proximal and were not significantly different between groups. Administration of misoprostol appeared to adversely affect glomerular filtration rates in this model of acute nephrotoxicosis in dogs. In previous studies, supplementing vasodilatory prostaglandins in experimental acute renal failure had beneficial effects or there were no changes in renal function. Additional study is needed to assess effects of manipulating vasoactive products of the arachidonic acid cascade in renal failure. / Master of Science

Postoperative Wundheilungsstörungen nach herzchirurgischen Eingriffen sind seltene, jedoch gefürchtete und ernstzunehmende Komplikationen, die zu schwerwiegenden Konsequenzen bis hinzu einer Poststernotomie-Mediastinitis mit möglicherweise letalen Ausgang führen können. In einer prospektiven, monozentrisch angelegten Studie wird angestrebt, ein infektionspräventives Behandlungskonzept herauszuarbeiten, mit dem das Risiko für thorakale Wundinfektionen verringert werden kann. Ob mit der Anwendung eines vor operativen Thoraxverschlusses retrosternal eingelegten Gentamicin-Kollagenschwammes eine Reduktion der Inzidenz von Wundheilungsstörungen nach medianer Sternotomie erreicht werden kann, wird in der vorliegenden Studie geprüft. Dazu kommt eine Kombination aus dem Desinfektionsmittel ChloraPrep® und dem Resorbaschwamm Genta-Coll resorb® zum Einsatz.

Die Technik der intravitrealen Gentamicin Injektion darzulegen, die Auswirkungen dieser auf die klinischen Symptome von Uveitiden, sowie die möglichen unmittelbaren Komplikationen (innerhalb von 24 Stunden) und längerfristigen Komplikationen (30 bis 780 Tage) die mit dieser Technik verbunden sein können, zu beschreiben. Zusätzlich wurde der okuläre und systemische Leptospiren- Status ermittelt und der Einfluss dieser auf das Behandlungsergebnis untersucht.:Table of Contents 1 INTRODUCTION 1 2 LITERATURE OVERVIEW 2 2.1 Etiology and pathogenesis 2 2.1.1 Proposed etiologies 2 2.1.2 ERU: an immune mediated disease 3 2.2 Leptospirosis and ERU 4 2.2.1 Genetic predisposition for ERU 6 2.3 Definition of ERU 7 2.3.1 Classification and syndromes 7 2.3.2 Clinical symptoms 8 2.4 Diagnostic testing for ERU (Leptospira) 8 2.4.1 Sample collection (aqueous humor, vitreous humor, serum) 8 2.4.2 Methodology 9 2.4.2.1 Microagglutination test (MAT) 9 2.4.2.2 Polymerase chain reaction (PCR) 10 2.4.2.3 Cultures 10 2.5 Treatment of ERU 10 2.5.1 Medical management 10 2.5.2 Intravitreal and suprachoroidal injections 11 2.5.2.1 Intravitreal rapamycin injections 11 2.5.2.2 Intravitreal triamcinolone injections 11 2.5.2.3 Suprachoroidal triamcinolone injections 12 2.5.2.4 Low-dose intravitreal gentamicin injections 12 2.5.3 Surgical procedures 13 2.5.3.1 Suprachoroidal cyclosporine implants 13 2.5.3.2 Pars plana vitrectomy 14 3 PUBLICATIONS 16 3.1 Intravitreal injection of low-dose gentamicin for the treatment of recurrent or persistent uveitis in horses: Preliminary results 16 3.2 Medical and Surgical Management of Equine Recurrent Uveitis 29 4 DISCUSSION 47 5 ZUSAMMENFASSUNG 51 6 SUMMARY 52 7 REFERENCES 53 / To describe the intravitreal gentamicin injection technique, report the effects of the injection on the clinical signs of uveitis and to describe the associated peri-injection (within 24 hours) and post-injection complications (30 to 780 days). Additionally, evaluation of the systemic and ocular Leptospira status and its effects on the treatment outcome was performed.:Table of Contents 1 INTRODUCTION 1 2 LITERATURE OVERVIEW 2 2.1 Etiology and pathogenesis 2 2.1.1 Proposed etiologies 2 2.1.2 ERU: an immune mediated disease 3 2.2 Leptospirosis and ERU 4 2.2.1 Genetic predisposition for ERU 6 2.3 Definition of ERU 7 2.3.1 Classification and syndromes 7 2.3.2 Clinical symptoms 8 2.4 Diagnostic testing for ERU (Leptospira) 8 2.4.1 Sample collection (aqueous humor, vitreous humor, serum) 8 2.4.2 Methodology 9 2.4.2.1 Microagglutination test (MAT) 9 2.4.2.2 Polymerase chain reaction (PCR) 10 2.4.2.3 Cultures 10 2.5 Treatment of ERU 10 2.5.1 Medical management 10 2.5.2 Intravitreal and suprachoroidal injections 11 2.5.2.1 Intravitreal rapamycin injections 11 2.5.2.2 Intravitreal triamcinolone injections 11 2.5.2.3 Suprachoroidal triamcinolone injections 12 2.5.2.4 Low-dose intravitreal gentamicin injections 12 2.5.3 Surgical procedures 13 2.5.3.1 Suprachoroidal cyclosporine implants 13 2.5.3.2 Pars plana vitrectomy 14 3 PUBLICATIONS 16 3.1 Intravitreal injection of low-dose gentamicin for the treatment of recurrent or persistent uveitis in horses: Preliminary results 16 3.2 Medical and Surgical Management of Equine Recurrent Uveitis 29 4 DISCUSSION 47 5 ZUSAMMENFASSUNG 51 6 SUMMARY 52 7 REFERENCES 53

Salmonella enterica gehört zu den gramnegativen Bakterien und ist der Erreger von verschiedenen Darmerkrankungen, von Gastroenteritis bis systemische Infektionen, und jährlich die Ursache für hunderttausende Todesfälle. In den letzten 30 Jahren wurden grundlegende Mechanismen der Invasion und des intrazellulären Wachstums von Salmonella gelöst: Salmonella verfügt über eine Reihe von Virulenzfaktoren (Effektorproteine), die mittels Typ-III-Sekretionssystemen (T3SS) zur molekularen Manipulation der Wirtszelle ausgeschüttet werden. Allerdings sind die Funktionen einiger dieser Effektorproteine nur unzureichend charakterisiert. Darüber hinaus hat die Rolle von RNA-Protein-Wechselwirkungen in bakteriellen Prozessen, einschließlich Infektionen, an Bedeutung gewonnen. Eine der am häufigsten verwendeten Techniken zur Untersuchung von Effektorproteinen ist der Gentamicin Protection Assay (GPA), eine einfache Methode, die den Salmonella-Infektionsprozess in vitro nachbildet. Da der GPA jedoch starken Schwankungen unterliegt und eine Endpunktmessungen darstellt, ist dieser unzureichend, wenn gleichzeitig mehrere Bedingungen oder zeitabhängige Dynamiken untersucht werden müssen. Um diese Einschränkungen zu umgeben, wurde InFluence entwickelt, eine Hochdurchsatz-Fluoreszenz-Mikroskopiemethode. Diese Methode ermöglicht Einblicke in die von Salmonellen besiedelten intrazellulären Nischen, und erwies sich als nützliches Instrument zur Charakterisierung von nicht nur von Effektorproteinen, sondern auch von Wirtsproteinen im Infektionsprozess. Darüber hinaus haben wir zur Entwicklung von TriPepSVM, einer Support Vector Machine (SVM), beigetragen. Dieser Algorithmus, der zusammen mit der AG Marsico (ICB - Helmholtz Zentrum München) entwickelt wurde, sagt RNA-Bindeproteine voraus, mithilfe von Tripeptiden in intrinsisch ungefalteten Regionen (IDR). 66 RBPs hat TriPepSVM in Salmonella vorausgesagt, wovon drei im Rahmen dieser Arbeit experimentell validiert wurden. / Salmonella enterica is a species of Gram-negative bacteria and the causative agent of enteric diseases, ranging from gastroenteritis to systemic infections, causing hundreds of thousands of deaths every year. In the last 30 years the basic mechanisms underpinning invasion and intracellular growth have been unravelled: Salmonella produces tens of virulence factors - termed “effectors” - which are secreted by two distinct Type III Secretion Systems (T3SS) for the hijacking of the host cell molecular machinery via protein-protein interactions. Although the biochemical activities of many effectors have been characterised, the functions of some have remained elusive. In addition, post-transcriptional regulation has emerged to prominence in bacteria, with RNA-protein interactions playing a pivotal role in many bacterial functions, including infection. One of the most frequently used techniques to study Salmonella effectors is the Gentamicin Protection Assay (GPA), a simple method which replicates the infection process in vitro; however, as GPA is subject to high levels of variation and only generates end-point measurements, the method can be inadequate when studying multiple conditions at once or following time-dependent dynamics. InFluence, a high-throughput, fluorescence microscopy-based analysis pipeline, was designed to address these issues. InFluence offered insights into the intracellular niches occupied by Salmonella, and proved to be a useful tool in assessing not only the contribution to the infection process of effectors, but that of host proteins too. In addition, we contributed to the development of TriPepSVM, a support vector machine-based (SVM) method developed with the Marsico group (Institute of Computational Biology (ICB) - Helmholtz Zentrum Munchen) for predicting RNA-binding proteins (RBPs) using tripeptides that are frequent in Intrinsic Disordered Regions (IDRs). TriPepSVM predicted 66 new RBPs in Salmonella, and three were experimentally validated.

Im Rahmen dieser Arbeit wurden kapillarelektrophoretische Methoden entwickelt, mit denen es möglich ist, Gentamicinsulfat in Haupt- und Nebenkomponenten zu trennen. Ausgelöst wurden die Untersuchungen im Jahr 2000, da in den USA über 60 Patienten durch Gentamicin starben. Es wurde vermutet, dass dies auf Verunreinigungen in gewissen Chargen zurückzuführen ist. Gentamicin wird fermentativ aus Micromonospora purpurea gewonnen. Durch leichte Abweichungen im Herstellungsprozess können Produkte entstehen, die mit den bisher angewendeten Analysenmethoden nicht nachzuweisen sind. In der momentanen Arzneibuch-Monographie von Gentamicinsulfat wird zur Prüfung der verwandten Substanzen eine HPLC-Methode beschrieben, die Gentamicin ohne Derivatisierung mit einem gepulsten amperometrischen Detektor detektiert. Vorteil dieser Methode ist, dass Gentamicin nicht derivatisiert werden muss. Der große Nachteil dieser Methode ist aber, dass die einzelnen Peaks sehr lange Migrationszeiten haben (bis über 10 Minuten) und somit Verunreinigungen überdeckt werden können. Außerdem sind viele Bestandteile nicht von den Hauptkomponenten abgetrennt. Weiterhin ist diese Methode nicht sehr robust, da der Detektor sehr empfindlich ist. Eigene HPLC-Messungen an mehreren Gentamicin-Chargen zeigten die Probleme auf. Da Gentamicin kein chromophores System hat, kann es nicht mit einem UV/VIS-Detektor detektiert werden. Um dies dennoch zu ermöglichen, kann Gentamicin mit verschiedenen Reagenzien derivatisiert werden. In der vorliegenden Arbeit wurden alle Aminoglykoside mit ortho-Phthaldialdehyd und 2-Mercaptoessigsäure derivatisiert. Somit war eine Detektion bei 330 nm bzw. 340 nm möglich. Zur Trennung von Gentamicinsulfat wurde eine spezielle kapillarelektrophoretische Methode entwickelt. Die mizellare elektrokinetische Chromatographie (MEKC) ist nach Derivatisierung in der Lage, nahezu alle in der Monographie beschriebenen aber auch einige nicht aufgeführte Verunreinigungen zu trennen. Die Trennung erfolgt in einer Kieselgelkapillare mit einer Gesamtlänge von 33.0 cm, einer effektiven Länge von 24.5 cm und einem Innendurchmesser von 50 µm. Als Hintergrundelektrolyt wird ein Natriumtetraborat-Puffer verwendet (100 mM, pH 10.0), zu dem Desoxycholsäure-Natrium als mizellbildendes Reagenz in einer Konzentration von 20 mM und weiterhin beta-Cyclodextrin in einer Konzentration von 15 mM zugegeben wird. Die Proben werden hydrodynamisch bei 5000 Pa innerhalb 5 Sekunden auf der Anodenseite injiziert. Die Trennung erfolgt bei einer Kapillartemperatur von 25 °C und einer Trennspannung von +12 kV. Pikrinsäure wird als Interner Standard benutzt. Die Detektion erfolgt UV-spektroskopisch bei 340 nm. Die Hauptpeaks konnten durch „spiken“ mit den Einzelkomponenten, die u.a. säulenchromatographisch gewonnen wurden, identifiziert werden. Die vier Hauptkomponenten Gentamicin-C1, C1a, C2 und C2a sind basisliniengetrennt ebenso wie Gentamicin-C2b, die Verunreinigungen Garamin, Desoxystreptamin und Sisomicin. Bei den Untersuchungen von über 40 Gentamicin-Chargen verschiedener Hersteller und Händler fielen sowohl deutliche Unterschiede bezüglich der einzelnen Gehalte der Hauptkomponenten auf, als auch verschiedene Grade der Verunreinigungen. Anhand der Menge der Verunreinigungen konnten die Chargen in verschiedene Gruppen eingeteilt werden. Die Verunreinigung Sisomicin kann als Leitsubstanz der Verunreinigungen bezeichnet werden, da bei allen stärker verunreinigten Chargen Sisomicin in beträchtlichen Mengen vorhanden ist. Unter den untersuchten Proben befanden sich auch die Proben, die in den USA die eingangs erwähnten Todesfälle verursacht haben. Diese Proben konnten der Gruppe der stärker verunreinigten Gentamicin-Chargen eindeutig zugewiesen werden. Die Richtigkeit aller Messungen wurde durch 1H-NMR-Messungen bestätigt. Die Anwendbarkeit der entwickelten MEKC-Methode wurde auch an weiteren Aminoglykosiden untersucht. Die Methode ist ohne Änderung auf Sisomicin übertragbar. Der Sisomicin-Peak ist deutlich abgetrennt vom OPA-Reagenzpeak. Selbst kleine Verunreinigungen der CRS-Substanz können mit dieser Methode erkannt werden. Netilmicin und Amikacin können nicht ohne Änderungen mit der Methode vermessen werden, da sie unter diesen Bedingungen mit dem OPA-Peak komigrieren. Eine Anhebung der Trennspannung von +12 kV auf +14 kV lassen die Peaks hervortreten. Eine Unterscheidung der beiden Substanzen ist im Elektropherogramm nicht möglich, allerdings können sie durch 1H-NMR-spektroskopische Messungen identifiziert und unterschieden werden. Netilmicin wurde in vielen Gentamicin-Proben nachgewiesen. Bei Kanamycin liegen mit dieser Methode im Elektropherogramm sehr viele kleine Peaks sehr nahe beieinander. Durch Absenkung der Kapillartemperatur auf 20 °C können diese Peaks etwas besser getrennt werden... / The aim of this study was to separate gentamicin sulfate into its major and minor components by means of capillary electrophoresis. In May 2000 the death of 17 people and 60 people, respectively, was reported, following the administration of the commonly used broad spectrum antibiotic gentamicin sulfate. In addition hundreds of patients suffering from severe side effects were reported. Since this could not be explained by the pharmacological and toxicological properties of gentamicin, it was assumed that the side effects were related to impurities. Due to the fact that gentamicin is a fermentation product of Micromonospora purpurea, minor variations in the fermentation procedure may cause products, that cannot be detected by the analytical methods applied thus far. The current European Pharmacopoeia limits for related substance of gentamicin by means of an HPLC-method in combination with a pulsed amperometric detector. The advantage of this method is the fact, that it is not necessary to derivatize gentamicin. However, a major disadvantage of the method is the broadness of the main peaks (>10 minutes/peak). Hence, minor products could be covered by the main peaks. Furthermore, various peaks are not baseline separated and the method is not very robust owing to the highly sensitive detector. Due to the lack of a chromophore, gentamicin needs to be derivatized to allow detection by means of an UV-detector. In this study all aminoglycosides were labeled with orthophthaldialdehyde (OPA) in combination with 2-mercaptoacetic acid, which enabled detection at a wavelength of 340 nm. To separate gentamicin as OPA derivative, a method based on micellar electrokinetic chromatography (MEKC) was developed. This technique makes it possible to separate most of the impurities specified in the gentamicin monograph (garamine, deoxystreptamine, and sisomicin) and some additional, not further specified impurities such as paromamine and unknown products. The separation is carried out in a fused-silica capillary with a total length of 33.0 cm, an effective length of 24.5 cm and an inner diameter of 50 µm. Using sodium tetraborate buffer (100 mM, pH 10.0) as background electrolyte (BGE), deoxycholic acid sodium in a concentration of 20 mM as micelle forming agent and beta-cyclodextrin in a concentration of 15 mM are added. The samples are loaded hydrodynamically at 5000 Pa for 5 seconds on the anode side of the capillary and the separation is carried out at +12 kV and 25 °C. Picric acid is used as an internal standard and UV-detection is performed at 340 nm. Spiking experiments were performed using reference substances, obtained by column chromatography and commercially purchased reference substances for the impurities. The four major components gentamicin C1, C1a, C2, and C2a as well as the minor component C2b and the impurities garamine, deoxystreptamine, and sisomicin are baseline separated. Over 40 gentamicin batches of different pharmaceutical companies and producers were analyzed with respect to the content of the major components as well as the amount of the impurities. Varying levels of the major compounds as well as the impurities were identified, which allowed the grouping of the samples. All samples exhibiting a high amount of impurities were found to a high sisomicin concentration. Hence, sisomicin can be referred to as an impurity indicator. Some of the batches under scrutiny were responsible for the deaths found in the US. All these samples could be unambiguously assigned to the group which is characterized by a high number and a relatively high quantity of most unspecified impurities. All CE-measurements were verified by 1H NMR measurements. To investigate the applicability of the developed MEKC method, other aminoglycosides were also investigated. For sisomicin the standard method can be used without modification, since the sisomicin peak is separated from the OPA reagent peak and even small amounts of impurities of the CRS-substance can be detected with this method. For netilmicin and amikacin the developed method has to be modified. Under standard conditions the peaks of both substances co-migrates with the OPA reagent peak. Raising the voltage from +12 kV to +14 kV both peaks are separated. All Gentamicin samples were measured again using these new conditions. Netilmicin was often found in gentamicin samples. However, for these new conditions the migration time of netilmicin and amikacin are similar. Hence, they cannot be differentiated from each other in the same sample. Nevertheless, this differentiation can be carried out with 1H NMR measurements. Kanamycin samples show many peaks in a small zone of the electropherogram using the MEKC standard method. A slightly better separation can be obtained by using a lower temperature of the capillary of 20 °C instead of 25 °C...