Resumo: Um novo gene que codifica uma lipase LipA com 283 aminoacidos e massa molecular de 32 KDa foi isolado e caracterizado a partir de uma biblioteca metagenomica construida a partir de solo de manguezal da costa sul do Brasil. LipA possui identidade de 52% com uma lipase de uma bacteria nao-cultivada e baixa identidade (. 31%) com lipases e esterases de microrganismos cultivaveis. Analise filogenetica mostrou que LipA forma juntamente com sua proteina ortologa um ramo unico dentro da familia I das lipases verdadeiras, formando assim uma nova subfamilia de lipases. Determinacao da atividade utilizando extrato bruto de celulas de E. coli com o gene lipA mostraram que a nova enzima tem preferencia para acidos graxos de cadeia carbonica curta (C . 10) e atividade maxima frente ao p-nitrofenol caprato (comprimento da cadeia carbonica: C10, 0,87 U/mg protein). O pH otimo de LipA foi 8,0 e a enzima foi ativa numa faixa de temperatura de 20 a 35 oC, com atividade maxima frente ao p-nitrofenol butirato a 35 oC e pH 8,0.

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:27:23Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2012-04-19Bitstream added on 2014-06-13T20:35:50Z : No. of bitstreams: 1 coradi_gv_me_rcla.pdf: 718212 bytes, checksum: 5b51c35f0ce0bd29710b23ecbf1d579e (MD5) / Agência Nacional do Petróleo, Gás Natural e Biocombustíveis (ANP) / Lipases (E.C. 3.1.1.3) são enzimas que catalisam a hidrólise de ligações éster em meio aquoso, ou reações sintéticas quando em ambientes aquo-restritos, o que as tornam interessantes para aplicações em diferentes segmentos industriais como tratamento de efluentes, indústria alimentícia, e mais recentemente, na indústria de biocombustíveis, para produção de biodiesel por processos de esterificação e transesterificação. Essas enzimas normalmente são produzidas por micro-organismos por dois tipos de fermentação: a submersa ou em estado sólido. A fermentação em estado sólido (FES) apresenta vantagens interessantes como o baixo custo dos substratos utilizados para o crescimento microbiano (bagaços, tortas de origem agroindustrial ou farelos), economia de energia e água e produto final concentrado. Este trabalho teve como objetivos estudar parâmetros para produção de lipase pelo fungo filamentoso Fusarium oxysporum em FES, seguido da caracterização enzimática, e posterior aplicação em reações de síntese. O cultivo microbiano procedeu-se durante 120h a 28°C, e a atividade enzimática quantificada pela hidrólise do palmitato de p-nitrofenila. Foram testados diferentes substratos para a produção enzimática, bem como adição de sais e óleos. O extrato bruto com maior atividade lipolítica (5,08 U/gss) foi obtido após 120h de fermentação em torta de crambe umedecida com tampão fosfato pH 7,0. O extrato enzimático bruto apresentou maior atividade à 40°C e em tampão fosfato pH 8,0; foi pouco estável em temperaturas acima de 37°C, porém manteve-se estável em amplo intervalo de pH. Em relação a solventes polares, foi estável em baixas concentrações destes; em solventes apolares a atividade foi aumentada para até 130%. Mostrou-se estável, ainda, em diferentes tensoativos. A hidrólise dos diferentes... / Lipases (EC 3.1.1.3) are enzymes that catalyze the hydrolysis of ester in aqueous system, or synthetic reactions when in non-aqueous system, which makes them interesting for many industries as wastewater treatment, food industry, and more recently, in the biofuels industry for biodiesel production by esterification and transesterification. These enzymes are usually produced by microorganisms by two types of fermentation: submerged or solid. The solidstate fermentation (SSF) offers interesting advantages as the low cost of substrates for microbial growth (bagasses, agroindustrial cakes or sharps), economy of energy and water and more concentrate final product. This study aimed to study parameters for lipase production by filamentous fungus Fusarium oxysporum in SSF, followed by enzymatic characterization, and subsequent application in synthesis reactions. The microbial cultivation proceeded for 120 hours at 28°C, and enzymatic activity measured by the hydrolysis of pnitrophenyl- palmitate. Different substrate were tested for the enzyme production, and addition of salts and oils. The crude extract with highest lipase activity (5.08 U/gds) was obtained after 120 hours of fermentation in cake crambe moistened by phosphate buffer pH 7.0. The crude enzyme extract showed higher activity at 40°C in phosphate buffer pH 8.0; and was unstable at temperatures above 37°C, but remained stable in a wide pH range. It was stable at low concentrations of polar solvents, however in non-polar solvents, the activity was increased up to 130%, and it was also stable in different surfactants. The hydrolysis of various substrates, both synthetic and natural, confirmed that it was a true lipase. The use of fermented solid in esterification reactions proved to be efficient, having high conversion rates (around 90%)... (Complete abstract click electronic access below)

Orientador: Valéria Marta Gomes de Lima / Banca: Cintia Duarte de Freitas Milagre / Banca: Mario Lucio Lopes / Resumo: Lipases (E.C. 3.1.1.3) são enzimas que catalisam a hidrólise de ligações éster em meio aquoso, ou reações sintéticas quando em ambientes aquo-restritos, o que as tornam interessantes para aplicações em diferentes segmentos industriais como tratamento de efluentes, indústria alimentícia, e mais recentemente, na indústria de biocombustíveis, para produção de biodiesel por processos de esterificação e transesterificação. Essas enzimas normalmente são produzidas por micro-organismos por dois tipos de fermentação: a submersa ou em estado sólido. A fermentação em estado sólido (FES) apresenta vantagens interessantes como o baixo custo dos substratos utilizados para o crescimento microbiano (bagaços, tortas de origem agroindustrial ou farelos), economia de energia e água e produto final concentrado. Este trabalho teve como objetivos estudar parâmetros para produção de lipase pelo fungo filamentoso Fusarium oxysporum em FES, seguido da caracterização enzimática, e posterior aplicação em reações de síntese. O cultivo microbiano procedeu-se durante 120h a 28°C, e a atividade enzimática quantificada pela hidrólise do palmitato de p-nitrofenila. Foram testados diferentes substratos para a produção enzimática, bem como adição de sais e óleos. O extrato bruto com maior atividade lipolítica (5,08 U/gss) foi obtido após 120h de fermentação em torta de crambe umedecida com tampão fosfato pH 7,0. O extrato enzimático bruto apresentou maior atividade à 40°C e em tampão fosfato pH 8,0; foi pouco estável em temperaturas acima de 37°C, porém manteve-se estável em amplo intervalo de pH. Em relação a solventes polares, foi estável em baixas concentrações destes; em solventes apolares a atividade foi aumentada para até 130%. Mostrou-se estável, ainda, em diferentes tensoativos. A hidrólise dos diferentes... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Lipases (EC 3.1.1.3) are enzymes that catalyze the hydrolysis of ester in aqueous system, or synthetic reactions when in non-aqueous system, which makes them interesting for many industries as wastewater treatment, food industry, and more recently, in the biofuels industry for biodiesel production by esterification and transesterification. These enzymes are usually produced by microorganisms by two types of fermentation: submerged or solid. The solidstate fermentation (SSF) offers interesting advantages as the low cost of substrates for microbial growth (bagasses, agroindustrial cakes or sharps), economy of energy and water and more concentrate final product. This study aimed to study parameters for lipase production by filamentous fungus Fusarium oxysporum in SSF, followed by enzymatic characterization, and subsequent application in synthesis reactions. The microbial cultivation proceeded for 120 hours at 28°C, and enzymatic activity measured by the hydrolysis of pnitrophenyl- palmitate. Different substrate were tested for the enzyme production, and addition of salts and oils. The crude extract with highest lipase activity (5.08 U/gds) was obtained after 120 hours of fermentation in cake crambe moistened by phosphate buffer pH 7.0. The crude enzyme extract showed higher activity at 40°C in phosphate buffer pH 8.0; and was unstable at temperatures above 37°C, but remained stable in a wide pH range. It was stable at low concentrations of polar solvents, however in non-polar solvents, the activity was increased up to 130%, and it was also stable in different surfactants. The hydrolysis of various substrates, both synthetic and natural, confirmed that it was a true lipase. The use of fermented solid in esterification reactions proved to be efficient, having high conversion rates (around 90%)... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre

Enzimas microbianas, quando produzidas a um custo acessível e preservadas suas propriedades catalíticas, são ferramentas determinantes para a sustentabilidade das indústrias química e energética. Buscando aprimorar a produção de lipases pela cepa de Staphylococcus warneri EX17, diferentes estratégias de cultivo em biorreatores submersos foram aplicadas para analisar a influência de algumas variáveis na produção da enzima e então foi proposto o cultivo em batelada alimentada. Paralelamente, lipases de S. warneri EX17 (SWL) foram imobilizadas por adsorção hidrofóbica em Octyl-Sepharose, Immobead 150 e MCI GEL CHP20P. Os resultados indicaram que a interação entre enzima e suporte interfere nas propriedades da enzima imobilizada. Os preparados Octyl-SWL e MCI-SWL preservaram sua atividade lipolítica quando expostos a 50 % (v/v) de Butanol, Etanol, n-Hexano, Isopropanol e Metanol. Na síntese do éster aromático butirato de etila, Octyl-SWL e MCI-SWL exibiram desempenho promissor, alcançando em 24 h de reação 28 % e 35,6 % de rendimento, respectivamente. Lipases de S. warneri EX17 purificadas e imobilizadas em suportes hidrofóbicos preservaram propriedades que apontam seu potencial como biocatalisador industrial. / Microbial enzymes, when produced at affordable costs and preserving their catalytic properties, are crucial tools for sustainable chemical and energy industries. To enhance lipase production by Staphylococcus warneri EX17 strain, different cultivation strategies were applied to investigate the influence of some variables on enzyme production and then fed-batch cultivation was proposed. Additionally, three hydrophobic supports, Octyl-Sepharose, Immobead 150 and MCI GEL CHP20P have been assayed to purify and immobilize the lipase from S. warneri EX17 (SWL) via interfacial adsorption. Results indicated that the intensity of the interaction between the lipase and the support surface interferes in properties of the immobilized enzyme. The immobilized preparations Octyl-SWL and MCI-SWL preserved their lipolytic activity in the presence of 50 % (v/v) Butanol, Ethanol, n-Hexane, Isopropanol and Methanol. Octyl-SWL and MCI-SWL catalyzed the ester synthesis reaction giving 28 % and 35.6 % of conversion in 24 h. These enzyme preparations may be promising alternatives as industrial biocatalysts.

Lipases (E.C. 3.1.1.3) são serina-hidrolases e agem em sobre ésteres de ácidos graxos de cadeia curta. Elas exibem atividade específica e enantiosseletiva, e sendo assim, há vasto interesse comercial, em pesquisa e indústria de biotecnologia. Lipases microbianas são interessantes para indústria, devido à facilidade de purificação e alta produção que permitem. Muitas leveduras possuem capacidade de produzir naturalmente estas enzimas, permitindo a obtenção de lipases não-transgênicas e com maior rapidez. Este trabalho teve como objetivo avaliar a produção de lipase em leveduras selvagens e otimizar a sua produção em uma linhagem selecionada, bem como caracterizar esta enzima. Uma varredura inicial foi realizada em placas de Tween 80 e Ágar-óleo. Leveduras com crescimento positivo foram então cultivadas em meio mínimo sob agitação, suplementado com óleo de soja, e o sobrenadante teve a sua atividade enzimática testada sobre p-nitrofenil palmitato (pNPP). Foram testadas 133 linhagens provenientes de diferentes substratos, e treze apresentaram uma atividade lipolítica significativamente alta em comparação com as demais (p <0,001). Otimizações preliminares mostram condições ótimas de secreção da enzima produzida pela levedura selecionada, Candida parapsilosis QU110, em meios de cultura com pH inicial em torno de 6,0, contendo triptona e óleo de oliva como fontes de nitrogênio e carbono, respectivamente. O extrato bruto (sobrenadante livre de células) apresenta estabilidade a surfactantes não-iônicos e n-hexano, mas não a etanol ou metanol. Condições ótimas de atividade da enzima, avaliadas pela metodologia de superfície de resposta, foram observadas a 36 °C e pH 8,0. / Lipases (E.C. 3.1.1.3) are serine-hydrolases, and act on long chain fatty acid ester bonds. They exhibit specific and enantioselective activities, and as such there is plenty of interest for industry. Microbial lipases are interesting for industry, because its ease of purification and high yelds it permits. Several yeasts possess the ability of naturallly produce these enzymes, allowing the fast production of non-transgenic lipases. This work aimed at evaluating lipase production in wild yeast strains and optimizing its production, as well as characterizing this enzyme. An initial screening was made on Tween 80 and oil-agar plates. Growing yeasts were then cultivated under agitation in oil-supplemented minimum medium, and the supernatant had its enzymatic activity tested over p-nitrophenyl palmitate (pNPP). One-hundred and thirty-three strains isolated from different substrates were tested, and thirteen showed significantly high lipolytic activity when compared to the others (p<0,05). Preliminary optimization of lipase production by the selected yeast, Candida parapsilosis QU110, showed optimal enzyme secretion in media with initial pH 6.0, containing olive oil and tryptone as carbon and nitrogen sources, respectively. The crude extract (cell-free supernatant) showed stability against surfactants and n-hexan, but not against ethanol or methanol. Optimal enzyme activity conditions, evaluated through surface response methodology, were observed at 36 °C and pH 8.0.

Neste trabalho foi realizado o estudo da imobilização da enzima Lipolase® em argila montmorilonita K10 através das metodologias de adsorção e ligação covalente. Os sistemas suporte-enzima foram caracterizados pelas técnicas de DRIFTS, UV-Vis, MEV-EDS, BET/BJH, DRX e TGA. A atividade catalítica dos biocatalisadores foi testada nas reações de hidrólise do azeite de oliva e do óleo de soja e na alcoólise do óleo de soja. Em todas as reações avaliadas, os melhores resultados foram obtidos empregando o biocatalisador MMT-APTES-Glu-Enz20 e assim, a quantidade de enzima utilizada para os experimentos foi de 20 μL. Na reação de hidrólise do azeite de oliva, o rendimento atingiu 18% em 48 horas de reação, na presença da razão óleo:água igual a 2:1 (m/m). Para o óleo de soja, o percentual de hidrólise chegou a 9% em 24 horas de reação, utilizando óleo:água na proporção de 3:1 (m/m). Nas reações de alcoólise do óleo de soja, o maior rendimento em ésteres obtido foi de 7% em 24 horas de reação, na presença da razão molar óleo:metanol igual a 1:3. A reusabilidade dos sistemas foi investigada nas reações de hidrólise. Nas reações com o azeite de oliva, o sistema MMT-Enz20 mostrou estabilidade até o quarto ciclo, enquanto o sistema MMT-APTES-Glu-Enz20 apresentou uma perda gradativa a partir do segundo ciclo de reação. Nas reações empregando o óleo de soja, o sistema MMT-Enz20 mostrou uma perda gradual desde o primeiro ciclo de reação, ao passo que o sistema MMT-APTES-Glu-Enz20 foi estável até o terceiro ciclo. A reusabilidade utilizando p-NPP mostrou estabilidade pelo menos por 10 ciclos. Para avaliar a estabilidade no armazenamento, os sistemas foram acondicionados em tampão fosfato e sob refrigeração, mantendo cerca de 50% da atividade catalítica após 60 dias de armazenamento. / In this work was carried out the study of enzyme Lipolase® immobilization on montmorillonite K10 clay, using the adsorption and covalent bonding methods. The enzyme-support systems were characterized with the techniques: DRIFTS, UV-Vis, SEM-EDS, BET/BJH, XRD and TGA. The catalytic activity of the biocatalysts was done for hydrolysis of olive and soybean oils and for soybean oil alcoholysis. In all reactions evaluated the best results were obtained employing the biocatalyst MMT-APTES-Glu-Enz20 therefore the amount of enzyme used for immobilization was 20 μL. For olive oil hydrolysis the yield was 18% at 48 hours reaction with the ratio oil to water of 2:1 (w/w). For soybean oil, the percentage of hydrolysis reached 9% in 24 hours of reaction using the oil:water ratio of 3:1 (w/w). For the alcoholysis of soybean oil, the higher yield of the esters obtained was 7% at 24 hours of reaction with oil:methanol ratio equal to 1:3. The reusability of systems was investigated for hydrolysis reactions. In the case of olive oil reactions, MMT-Enz20 system was stable until the fourth cycle, while the system MMT-APTES-Glu-Enz20 showed a gradual loss from the second reaction cycle. In the case of soybean oil hydrolysis, the MMT-Enz20 system showed a gradual loss from the first reaction cycle, while the system MMT-APTES-Glu-Enz20 was stable until the third cycle. Reusability on p-NPP showed stability for at least 10 cycles. To evaluate the storage stability, the systems were placed in phosphate buffer under refrigeration, catalytic activity of c. a. 50% remain after 60 days of storage.

Neste trabalho foi realizado o estudo da imobilização da enzima Lipolase® em argila montmorilonita K10 através das metodologias de adsorção e ligação covalente. Os sistemas suporte-enzima foram caracterizados pelas técnicas de DRIFTS, UV-Vis, MEV-EDS, BET/BJH, DRX e TGA. A atividade catalítica dos biocatalisadores foi testada nas reações de hidrólise do azeite de oliva e do óleo de soja e na alcoólise do óleo de soja. Em todas as reações avaliadas, os melhores resultados foram obtidos empregando o biocatalisador MMT-APTES-Glu-Enz20 e assim, a quantidade de enzima utilizada para os experimentos foi de 20 μL. Na reação de hidrólise do azeite de oliva, o rendimento atingiu 18% em 48 horas de reação, na presença da razão óleo:água igual a 2:1 (m/m). Para o óleo de soja, o percentual de hidrólise chegou a 9% em 24 horas de reação, utilizando óleo:água na proporção de 3:1 (m/m). Nas reações de alcoólise do óleo de soja, o maior rendimento em ésteres obtido foi de 7% em 24 horas de reação, na presença da razão molar óleo:metanol igual a 1:3. A reusabilidade dos sistemas foi investigada nas reações de hidrólise. Nas reações com o azeite de oliva, o sistema MMT-Enz20 mostrou estabilidade até o quarto ciclo, enquanto o sistema MMT-APTES-Glu-Enz20 apresentou uma perda gradativa a partir do segundo ciclo de reação. Nas reações empregando o óleo de soja, o sistema MMT-Enz20 mostrou uma perda gradual desde o primeiro ciclo de reação, ao passo que o sistema MMT-APTES-Glu-Enz20 foi estável até o terceiro ciclo. A reusabilidade utilizando p-NPP mostrou estabilidade pelo menos por 10 ciclos. Para avaliar a estabilidade no armazenamento, os sistemas foram acondicionados em tampão fosfato e sob refrigeração, mantendo cerca de 50% da atividade catalítica após 60 dias de armazenamento. / In this work was carried out the study of enzyme Lipolase® immobilization on montmorillonite K10 clay, using the adsorption and covalent bonding methods. The enzyme-support systems were characterized with the techniques: DRIFTS, UV-Vis, SEM-EDS, BET/BJH, XRD and TGA. The catalytic activity of the biocatalysts was done for hydrolysis of olive and soybean oils and for soybean oil alcoholysis. In all reactions evaluated the best results were obtained employing the biocatalyst MMT-APTES-Glu-Enz20 therefore the amount of enzyme used for immobilization was 20 μL. For olive oil hydrolysis the yield was 18% at 48 hours reaction with the ratio oil to water of 2:1 (w/w). For soybean oil, the percentage of hydrolysis reached 9% in 24 hours of reaction using the oil:water ratio of 3:1 (w/w). For the alcoholysis of soybean oil, the higher yield of the esters obtained was 7% at 24 hours of reaction with oil:methanol ratio equal to 1:3. The reusability of systems was investigated for hydrolysis reactions. In the case of olive oil reactions, MMT-Enz20 system was stable until the fourth cycle, while the system MMT-APTES-Glu-Enz20 showed a gradual loss from the second reaction cycle. In the case of soybean oil hydrolysis, the MMT-Enz20 system showed a gradual loss from the first reaction cycle, while the system MMT-APTES-Glu-Enz20 was stable until the third cycle. Reusability on p-NPP showed stability for at least 10 cycles. To evaluate the storage stability, the systems were placed in phosphate buffer under refrigeration, catalytic activity of c. a. 50% remain after 60 days of storage.

Enzimas microbianas, quando produzidas a um custo acessível e preservadas suas propriedades catalíticas, são ferramentas determinantes para a sustentabilidade das indústrias química e energética. Buscando aprimorar a produção de lipases pela cepa de Staphylococcus warneri EX17, diferentes estratégias de cultivo em biorreatores submersos foram aplicadas para analisar a influência de algumas variáveis na produção da enzima e então foi proposto o cultivo em batelada alimentada. Paralelamente, lipases de S. warneri EX17 (SWL) foram imobilizadas por adsorção hidrofóbica em Octyl-Sepharose, Immobead 150 e MCI GEL CHP20P. Os resultados indicaram que a interação entre enzima e suporte interfere nas propriedades da enzima imobilizada. Os preparados Octyl-SWL e MCI-SWL preservaram sua atividade lipolítica quando expostos a 50 % (v/v) de Butanol, Etanol, n-Hexano, Isopropanol e Metanol. Na síntese do éster aromático butirato de etila, Octyl-SWL e MCI-SWL exibiram desempenho promissor, alcançando em 24 h de reação 28 % e 35,6 % de rendimento, respectivamente. Lipases de S. warneri EX17 purificadas e imobilizadas em suportes hidrofóbicos preservaram propriedades que apontam seu potencial como biocatalisador industrial. / Microbial enzymes, when produced at affordable costs and preserving their catalytic properties, are crucial tools for sustainable chemical and energy industries. To enhance lipase production by Staphylococcus warneri EX17 strain, different cultivation strategies were applied to investigate the influence of some variables on enzyme production and then fed-batch cultivation was proposed. Additionally, three hydrophobic supports, Octyl-Sepharose, Immobead 150 and MCI GEL CHP20P have been assayed to purify and immobilize the lipase from S. warneri EX17 (SWL) via interfacial adsorption. Results indicated that the intensity of the interaction between the lipase and the support surface interferes in properties of the immobilized enzyme. The immobilized preparations Octyl-SWL and MCI-SWL preserved their lipolytic activity in the presence of 50 % (v/v) Butanol, Ethanol, n-Hexane, Isopropanol and Methanol. Octyl-SWL and MCI-SWL catalyzed the ester synthesis reaction giving 28 % and 35.6 % of conversion in 24 h. These enzyme preparations may be promising alternatives as industrial biocatalysts.

Lipases (E.C. 3.1.1.3) são serina-hidrolases e agem em sobre ésteres de ácidos graxos de cadeia curta. Elas exibem atividade específica e enantiosseletiva, e sendo assim, há vasto interesse comercial, em pesquisa e indústria de biotecnologia. Lipases microbianas são interessantes para indústria, devido à facilidade de purificação e alta produção que permitem. Muitas leveduras possuem capacidade de produzir naturalmente estas enzimas, permitindo a obtenção de lipases não-transgênicas e com maior rapidez. Este trabalho teve como objetivo avaliar a produção de lipase em leveduras selvagens e otimizar a sua produção em uma linhagem selecionada, bem como caracterizar esta enzima. Uma varredura inicial foi realizada em placas de Tween 80 e Ágar-óleo. Leveduras com crescimento positivo foram então cultivadas em meio mínimo sob agitação, suplementado com óleo de soja, e o sobrenadante teve a sua atividade enzimática testada sobre p-nitrofenil palmitato (pNPP). Foram testadas 133 linhagens provenientes de diferentes substratos, e treze apresentaram uma atividade lipolítica significativamente alta em comparação com as demais (p <0,001). Otimizações preliminares mostram condições ótimas de secreção da enzima produzida pela levedura selecionada, Candida parapsilosis QU110, em meios de cultura com pH inicial em torno de 6,0, contendo triptona e óleo de oliva como fontes de nitrogênio e carbono, respectivamente. O extrato bruto (sobrenadante livre de células) apresenta estabilidade a surfactantes não-iônicos e n-hexano, mas não a etanol ou metanol. Condições ótimas de atividade da enzima, avaliadas pela metodologia de superfície de resposta, foram observadas a 36 °C e pH 8,0. / Lipases (E.C. 3.1.1.3) are serine-hydrolases, and act on long chain fatty acid ester bonds. They exhibit specific and enantioselective activities, and as such there is plenty of interest for industry. Microbial lipases are interesting for industry, because its ease of purification and high yelds it permits. Several yeasts possess the ability of naturallly produce these enzymes, allowing the fast production of non-transgenic lipases. This work aimed at evaluating lipase production in wild yeast strains and optimizing its production, as well as characterizing this enzyme. An initial screening was made on Tween 80 and oil-agar plates. Growing yeasts were then cultivated under agitation in oil-supplemented minimum medium, and the supernatant had its enzymatic activity tested over p-nitrophenyl palmitate (pNPP). One-hundred and thirty-three strains isolated from different substrates were tested, and thirteen showed significantly high lipolytic activity when compared to the others (p<0,05). Preliminary optimization of lipase production by the selected yeast, Candida parapsilosis QU110, showed optimal enzyme secretion in media with initial pH 6.0, containing olive oil and tryptone as carbon and nitrogen sources, respectively. The crude extract (cell-free supernatant) showed stability against surfactants and n-hexan, but not against ethanol or methanol. Optimal enzyme activity conditions, evaluated through surface response methodology, were observed at 36 °C and pH 8.0.

Submitted by Pedro Barros (pedro.silvabarros@ufpe.br) on 2018-09-10T21:37:38Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 811 bytes, checksum: e39d27027a6cc9cb039ad269a5db8e34 (MD5) TESE Odacy Camilo de Souza.pdf: 2425125 bytes, checksum: 7bb72fbb05058f53be027a8e54ba439c (MD5) / Approved for entry into archive by Alice Araujo (alice.caraujo@ufpe.br) on 2018-09-17T18:12:14Z (GMT) No. of bitstreams: 2 license_rdf: 811 bytes, checksum: e39d27027a6cc9cb039ad269a5db8e34 (MD5) TESE Odacy Camilo de Souza.pdf: 2425125 bytes, checksum: 7bb72fbb05058f53be027a8e54ba439c (MD5) / Made available in DSpace on 2018-09-17T18:12:14Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 811 bytes, checksum: e39d27027a6cc9cb039ad269a5db8e34 (MD5) TESE Odacy Camilo de Souza.pdf: 2425125 bytes, checksum: 7bb72fbb05058f53be027a8e54ba439c (MD5) Previous issue date: 2015-06-30 / CAPES / Trichosporon são leveduras pertencentes ao filo Basidiomycota, que se destacam na produção de lipases, dentre outras enzimas. Os objetivos deste estudo foram Selecionar, culturas de Trichosporon mantidas na Micoteca URM, quanto à produção de lipases, através de avaliação qualitativa e quantitativa, otimizar a produção da enzima, caracterizar, pré-purificar e aplicar avaliando a capacidade de degradar efluentes de abatedouros de bovinos. Foram realizadas a reativação e autenticação das culturas através das características morfofisiológicas. Para degradação do meio rico em lipídeos, foram retirados fragmentos das culturas mantidas em SYE contidos em tubo de ensaio e transferidos para o centro da placa de Petri contendo o mesmo meio. Após sete dias de crescimento, fragmentos da cultura foram transferidos para o centro da placa de Petri com meio de cultura. As culturas foram incubadas a 28ºC e 37ºC, observadas durante 24, 48, 72 e 96 horas, para evidenciar a presença de halo opaco ao redor da colônia. Para determinação da capacidade lipolítica em fermentação submersa O experimento foi realizado utilizando Erlenmeyers de 250 mL contendo 50mL dos seguintes meios; I composto por 1% (v/v) de óleo de oliva, meio II contendo 1% (v/v) de óleo de mamona, e meio III composto por 1% (v/v) de óleo de licuri, adicionados de 0,5% (p/v) extrato de levedura e pH ajustado para 6,5. Esterilizados e inoculados e incubados a 160 rpm a 37ºC por 96 horas. Foi utilizado o método espectrofotométrico para determinar a atividade da lipase. Otimização do meio de produção de lipases por estatística de aproximação, o meio foi preparado utilizando diferentes concentrações de nutrientes testados de acordo com os experimentos do planejamento estatístico. Os inóculos foram adicionados a cada 50 mL de meio em Erlenmeyer de 250 mL de acordo com a concepção da matriz. Os frascos foram incubados por até cinco dias em diferentes temperaturas, sob agitação em diferentes rotações. Identificação e seleção das variáveis significativas para a produção de lipases foi realizada com base no design PB. Foram testados 11 variáveis. Para a Metodologia de superfície de resposta foram usadas as variáveis selecionadas para maior produção de lipase. Para caracterização enzimática foi avaliado o efeito e a estabilidade do pH, temperatura, íons, solventes e detergentes sobre a atividade enzimática. Na purificação foi utilizado o sistema de duas fases aquosas, com planejamento estatístico 2³, assim como a aplicação do estrato bruto. Em meio sólido, todas as culturas apresentaram crescimento, sem presença de halo de degradação, em cultivo submerso, todas as culturas apresentaram atividade. Trichosporon sporotrichoides URM 6630, produziu 104,07 UmL. O melhor pH e temperatura para produção da enzima foram pH 10.0 e 40 ˚C. A purificação teve coeficiente de partição 76 e recuperação da atividade 164,71%, e o fator de purificação de 0,96. Para a aplicação a melhor de taxa de degradação foi obtida com a menor concentração do extrato bruto. Primeiro relato de produção de lipases por essa espécie, e da utilização de óleo de licuri como substrato. Este micro-organismo torna-se bastante promissor para a produção de lipases produz altos níveis destas enzimas, em condições que minimizando os custos da produção. / Trichosporon yeasts are belonging to the phylum Basidiomycota, they are highlighted in lipase activity among other enzymes. The objectives of this study were to select, Trichosporon cultures kept in the URM Culture Collection, as lipase production, optimize production of the enzyme, characterize, purify and apply evaluating the ability to degrade cattle slaughterhouses wastewater. They were held reactivation and authentication of cultures through the morphological and physiological characteristics. Degradation of the lipase fragments were removed from cultures maintained in SYE contained in a test tube and transferred to the center of the petri dish containing said medium. After seven days of growth, the culture pieces were transferred to the center of the petri dish with culture medium. Cultures were incubated at 28 ° C and 37 ° C, observed for 24, 48, 72 and 96 hours, demonstrating an opaque halo around the colony. To determine the lipolytic capacity in submerged fermentation The experiment was conducted using 250 mL Erlenmeyer flasks containing 50ml of the following means; I consists of 1% (v / v) olive oil, medium II containing 1% (v / v) castor oil, and medium III consists of 1% (v / v) licuri oil added 0 5% (w / v) yeast extract and pH adjusted to 6.5. Sterilized and inoculated and incubated at 160 rpm at 37 ° C for 96 hours. The spectrophotometric method was used to determine the lipase activity. Optimization of lipase production medium by statistical approach, the medium was prepared using different concentrations of nutrients tested according to the statistical design of experiments. The inocula were added to each 50 ml of medium in 250 ml Erlenmeyer according to the design of the array. The flasks were incubated for five days at different temperatures under stirring at different speeds. Identification and selection of the variables significant for lipase production was based on the design PB. 11 variables were tested. For response surface methodology were used the variables selected for increased production of lipase. For enzyme characterization, the effects and stability on pH, temperature, ions, solvents and detergents on the enzymatic activity. Purification was used in the aqueous two-phase system with statistical design 2³, as well as the application of the crude stratum. In a solid medium, all cultures grew without the presence of degradation halo, in submerged cultures, all cultures showed activity. Trichosporon sporotrichoides URM 6630, produced 104.07 UML. The best pH and temperature for enzyme production were pH 10.0 and 40 ° C. Purification was 76 and partition coefficient 164.71% activity recovery, and purification factor of 0.96. To implement the best degradation rate was obtained with the lowest concentration of the crude extract. First report of lipase production by this species, and use of licuri oil as substrate. This micro-organism becomes quite promising for lipase production produces high levels of these enzymes under conditions which minimize production.