Innerhalb des letzten Jahrzehnts wurde immer deutlicher, dass einwärts-gleichrichtende Kaliumkanäle (Kir) neben ihrer klassischen Rolle im Aufbau und der Konstanthaltung des Ruhemembranpotentials weitere zellspezifische Aufgaben erfüllen.In der vorliegenden Arbeit konnte mittels transgener Maustechnologie gezeigt werden, dass Kir4.1 früh postnatal zunächst Zellkörper-assoziiert auf Oligodendrozyten in der weißen Substanz des Rückenmarks exprimiert wird. Im weiteren Verlauf der Entwicklung kommt es zu einer Hochregulation der Proteinexpression auf perivaskulären und perineuralen astrozytären Fortsätzen in der grauen Substanz. Hier konnte die Kolokalisation von Kir4.1 und einem Wasserkanal (AQP4) auf astroglialen Endfüßen nachgewiesen werden. Das Kir4.1-Expressionsmuster im Rückenmark legt eine Rolle des Kanals in der Kaliumpufferung und möglicherweise in der Kalium-gesteuerten Volumenregulation nahe.Basierend auf den Ergebnissen der Expressionsstudie dieser Arbeit wurde die konkrete Hypothese aufgestellt, dass Kir4.1-Kanäle mittels Kontrolle des transmembranösen Kaliumtransports einen Einfluss auf die osmotische Volumenregulation von Astrozyten haben. Anhand eines Modellsystems konnte unter Verwendung konfokaler 2-Photonen-Lasermikroskopie gezeigt werden, dass die genetische Inaktivierung von Kir4.1 im Knock-Out-Mausmodell zu einer Beeinträchtigung der Wassersekretion aus astrozytären Fortsätzen mit nachfolgender Schwellung führt. Dies zeigt, dass Kir4.1-Kanäle wesentlich zur Volumenregulation in Astrozyten beitragen und dass der Kalium-sekretorische Volumenausgleich über astrogliale Endfüße vermittelt wird. Eine Beeinträchtigung von Expression oder Funktion astroglialer Kir4.1-Kanäle könnte unter pathophysiologischen Bedingungen zu einer Anschwellung von Astrozyten und Verringerung des extrazellulären Raumes beitragen.Eine mögliche pathogenetische Bedeutung von glialen Kir4.1-Kanälen bei neurodegenerativen Erkrankungen wurde anhand eines etablierten Tiermodells für die Motoneuronerkrankung Amyotrophe Lateralsklerose (ALS) untersucht. Erstmals konnte eine Krankheits-assoziierte, fortschreitende Reduktion der Kir4.1-Expression im Ventralhorn des Rückenmarks im SOD1-vermittelten ALS-Mausmodell nachgewiesen werden. Die daraus resultierende extrazelluläre Akkumulation von Kalium könnte durch chronische Depolarisation der Membran der Motoneurone zu deren Tod beitragen. Diese Schlussfolgerung unterstützend konnte in einem in vitro Modellsystem gezeigt werden, dass eine erhöhte extrazelluläre Kaliumkonzentration neurotoxisch wirkt. Die differentielle Expression von Kir4.1 im Rückenmark und die daraus abgeleitete Bedeutung für die Neuron-Glia Interaktion unter physiologischen und pathophysiologischen Aspekten unterstützt die Sichtweise einer dynamischen Interaktion von neuronalen und glialen Zellen im gesunden und kranken Gewebe.

De nombreux exemples de matériaux composites obtenus par l’association de fibres végétales et de polymères ont permis des allègements conséquents de structures dans divers domaines d’application. Cependant, la question demeure quant de la durabilité de ces pièces en service, essentiellement par manque de connaissances sur le vieillissement des fibres végétales, sur leurs interactions avec la matrice polymère et sur le comportement hydrothermique des composites biosourcés au cours du temps. Dans cette étude, nous avons étudié les cinétiques et mécanismes de sorption du matériau composite afin d’appréhender son comportement hydrique lors des vieillissements hydrothermiques par immersion dans l’eau à 23°C et 70°C. Cette étude a mis en évidence l’influence des fibres végétales sur les grandeurs caractéristiques de l’absorption en eau du matériau composite : forte prise en eau, gonflement anisotrope. Elle a également permis l’identification des mécanismes de dégradation des fibres de lin ; le rôle très nocif des résidus d’écorce rappelle l’importance du rouissage et du défibrage sur les performances de ces fibres. L’étude du comportement des constituants et du composite confrontés à des vieillissements hydrothermiques a ensuite été entreprise afin d’identifier et quantifier l’influence de chacun des matériaux constitutifs, ainsi que leur synergie. Il en ressort que la détérioration des fibres de lin est la principale cause de l’abattement des propriétés mécaniques du matériau composite. Si une immersion à 23°C pendant 70 jours n’a que peu d’effet sur les propriétés mécaniques, l’élévation de la température à 70°C induit des endommagements importants dès 14 jours d’immersion. La destruction des parois cellulaires et la dégradation des interfaces fibre/matrice sous l’effet de la présence d’eau détériorent le transfert de charge matrice/fibre. La corrélation entre les vieillissements accélérés et naturel a fait ressortir une similitude entre le maintien pendant 70 jours dans l’eau à 23°C et l’exposition aux conditions naturelles pendant 24 mois ; l’immersion à 70°C s’avère trop sévère. Une solution d’amélioration serait d’accentuer le rouissage des fibres afin de supprimer davantage les composés pectiques de la lamelle mitoyenne et de la paroi primaire. L’élimination de ces composés facilement hydrolysables par l’eau permettrait de prétendre à une meilleure qualité de l’interface fibres/matrice tout au long du vieillissement. / A great number of plant fiber – reinforced polymer composites allowed substantial lightening of structures in various fields of application. However, the question remains about the durability of these parts in service, mainly for lack of knowledge about the aging of plant fibers, their interactions with the polymer matrix and the hydrothermal behavior of biosourced composites over time. In this work, water absorption mechanisms and kinetics by the composite material are studied in order to understand the hydric behavior during hydrothermal aging by immersion in deionized water at 23°C or 70°C. The results show that water absorption by the composite is characterized by a high water uptake and an anisotropic swelling. It also allowed the identification of the degradation mechanisms of flax fibers; the very harmful role of bark residues recalls the importance of retting and decortication on the performance of these fibers.The investigation of the behaviors of the constituents and the composite under hydrothermal aging was then undertaken with the aim to identify and quantify the influence of each on the constituent materials, as well as their synergy. It shows that the deterioration of the flax fibers is the main cause of the reduction of the mechanical properties of the composite. If immersion at 23 ° C for 70 days has little effect on the mechanical properties, raising the temperature to 70 ° C induces significant damage from 14 days of immersion. The destruction of the cell walls and the degradation of the fiber/matrix interfaces due to water deteriorate the load transfer efficiency by the fiber/matrix interface. The correlation between accelerated and natural aging showed a similarity between holding for 70 days in water at 23 ° C and exposure to natural conditions for 24 months; immersion at 70 ° C is too severe. An improvement solution would be to increase the retting of the fibers in order to further remove the pectic compounds from the middle lamella and the primary wall. The elimination of these compounds easily hydrolysable by water would claim to a better quality of the fiber / matrix interface throughout aging.

(EN) The formation of brain oedema, which accompanies ischemic or traumatic brain injuries, originates from a disruption of ionic/neurotransmitter homeostasis that leads to extracellular K+ elevation and neurotransmitter accumulation in the extracellular space. An increased uptake of these osmotically active substances, predominantly provided by astrocytes, is accompanied by intracellular water accumulation via aquaporin-4 (AQP4). Since it has been shown that the removal of perivascular AQP4 via the deletion of α- syntrophin, which is the protein responsible for anchoring AQP4 on the astrocytic membrane (Neely et al. 2001), delays oedema formation and K+ clearance (Amiry-Moghaddam et al. 2003), we aimed to elucidate how the alpha-syntrophin deletion affects astrocyte volume changes in the cortex during pathological states, such as hypoosmotic stress or oxygen- glucose deprivation (OGD), using three-dimensional (3D) confocal morphometry in situ. In order to visualize individual astrocytes that lack alpha-syntrophin, double transgenic mice (GFAP/EGFP/α-Syn-/- ) were generated by crossbreeding GFAP-EGFP mice with α- syntrophin knockout mice. 3D-confocal morphometry revealed that alpha-syntrophin deletion did not alter astrocyte swelling during hypoosmotic stress or their recovery in isotonic solution;...

Im Rahmen dieser Arbeit wurden für die Herstellung neuartiger funktioneller Oberflächenbeschichtungen Polymerbürstensysteme basierend auf linearen, thermoresponsiven Poly-2-oxazolinen (POX) entwickelt und ausführlich charakterisiert. Als Grundbaustein für die Herstellung von POX-Bürsten wurden drei endfunktionalisierte thermoresponsive POX mittels kationisch ringöffnender Polymerisation synthetisiert, wobei jeweils 2-Cyclopropyl-2-oxazolin (cPrOX) als thermoresponsive Wiederholungseinheit und 2-Methyl-2-oxazolin (MeOX) als hydrophiles Comonomer zu verschiedenen Anteilen verwendet wurden. Mittels VIS-spektroskopischen Trübungsmessungen wurde für alle POX in Wasser ein LCST-Entmischungsverhalten mit einem reversiblen und scharfen Phasenübergang nachgewiesen, wobei die Trübungstemperaturen stark von der Polymerhydrophilie sowie der Molmasse und der Polymerkonzentration in Lösung abhingen. Die Herstellung der POX-Polymerbürsten auf der Basis der synthetisierten POX erfolgte über einen „grafting to“-Ansatz, bei welchem die Polymere in einem thermisch initiierten Prozess über ein funktionalisiertes Kettenende kovalent an ein Substrat angebunden wurden. Als Hauptmethode zur Charakterisierung der physikochemischen Eigenschaften der hergestellten Schichten, insbesondere deren temperaturabhängiges Schaltverhalten in Wasser, wurde spektroskopische Ellipsometrie verwendet. Zusätzlich kamen Rasterkraftmikroskopie, Kontaktwinkel und Quarzkristallmikrowaage mit Dissipationsaufzeichnung zum Einsatz. Im Gegensatz zum sehr scharfen, diskontinuierlichen Phasenübergang der POX in Lösung konnte für alle POX-Bürsten ein kontinuierlicher Übergang von einem gestreckten Bürstenzustand bei niedrigen Temperaturen in einen kollabierten Zustand bei hohen Temperaturen bestimmt werden, wobei das Quellvermögen und die temperaturabhängigen Quellkurvenverläufe durch die Polymereigenschaften und die Bürstenparameter beeinflussbar waren. Durch die Kombination eines POX mit Polyacrylsäure (PAA) als zweite Komponente konnten zudem neuartige binäre Polymerbürstensysteme hergestellt werden, welche ein komplexes pH- und temperaturabhängiges Schaltverhalten sowie ein steuerbares Proteinadsorptionsvermögen in Abhängigkeit von der Bürstenpräparationsmethodik, der POX-PAA-Zusammensetzung sowie der Temperatur und dem pH-Wert der umgebenden Pufferlösung aufwiesen. Zur ausführlichen Charakterisierung der Schichteigenschaften wurde neben den bereits benannten Methoden der spektroskopischen Ellipsometrie, Rasterkraftmikroskopie und der Kontaktwinkelmessung auch Röntgenphotoelektronenspektroskopie genutzt. Abschließende Zelladhäsionsexperimente mit humanen mesenchymalen Stammzellen auf den bürstenmodifizierte Oberflächen unter physiologischen Bedingungen offenbarten deutliche Unterschiede in der Affinität der Zellen zur Adhäsion auf POX-Homopolymerbürsten in Abhängigkeit der Bürstenhydrophilie. Darüber hinaus konnte die Zelladhäsion auch auf POX-PAA-Mischbürstensystemen gesteuert werden.

Es wird der Eigenschaftsbereich von thermisch modififizierter Kartoffelstärke erweitert und durch viele Proben sowie eine große Probenmenge verififiziert. Ziel ist es neue Möglichkeiten zur Optimierung der Stärke-Prozesskette zu erschließen und somit das industrielle Anwendungsspektrum für den Ausgangsstoff Stärke zu vergrößern. Native und konditionierte Kartoffelstärke werden auf neuartige Weise durch eine (Vakuum-)Mikrowellenbehandlung und durch eine konvektive Ofenbehandlung im Labormaßstab thermisch modififiziert. Um Einflussparameter auf die resultierende Eigenschaftsänderung zu identififizieren, werden das Quellungs- und Lösungsverhalten der Stärkeproben in wässriger Umgebung charakterisiert sowie das Stärkegel mikroskopisch untersucht. Eine Steigerung der variierten Behandlungsparameter (Behandlungsdauer und -temperatur bzw. -leistung) bewirkt unabhängig vom Behandlungsverfahren eine Zunahme der Quellung und der Löslichkeit. Die schlüssige grafifische Darstellung der Ergebnisse offenbart die Unterschiede zwischen den thermischen Verfahren. Bei der Mikrowellenbehandlung verursacht der ungehinderte Eintrag der Feldenergie in die Stärke eine erheblich schnellere Modififikation gegenüber der Ofenbehandlung. Bei der Vakuum-Mikrowellenbehandlung bewirkt der große Dampfdruck-Gradient eine intensivere Behandlung gegenüber der Mikrowellenbehandlung bei Atmosphärendruck. Mit den Verfahren können vorbestimmte Eigenschaften der Kartoffelstärke bewirkt werden, bspw. verursacht die Mikrowellenbehandlung eine geringere Löslichkeit als die Ofenbehandlung. Bei der Ofenbehandlung verringert eine Befeuchtung die Quellung und die Löslichkeit, was ähnlich dem Heat-Moisture-Effekt auf eine Modififikation der Stärkestruktur bei erhöhter Feuchte zusammen mit hoher Temperatur hindeutet. Die mikroskopische Geluntersuchung zeigt Unterschiede des Stärkegels für die verschiedenen Verfahren. Nach der Vakuum-Mikrowellenbehandlung brechen bei der Quellung einzelne Körner im Glasübergangsstadium auf und die Kornfragmente sind als Schlieren sichtbar.:1 Einleitung 1.1 Hintergrund - Marktrelevanz von Stärke 1.2 Motivation - Verfahrensrelevanz von Stärke 1.3 Zielsetzung und Lösungsansatz 2 Stand des Wissens über Stärke 2.1 Thermodynamische Modellvorstellung für hygroskopische, kapillarporöse Materialien 2.2 Aufbau 2.3 Eigenschaften in wässriger Umgebung 2.4 Thermische Behandlungsverfahren und Charakterisierungsmethoden 3 Material und Methoden 3.1 Ausgangsmaterial Kartoffelstärke 3.2 Bestimmung der Feuchte im Stärkepulver 3.3 Konditionierung zur Variation der Anfangsfeuchte im Stärkepulver 3.4 Thermische Behandlung der Stärke im Ofen 3.5 Thermische Behandlung der Stärke in der Mikrowelle 3.6 Labortechnische Charakterisierung der Quellung und der Löslichkeit 3.7 Mikroskopische Untersuchung des Stärkegels 4 Durchführung 4.1 Experimenteller Ablauf 4.2 Versuchsplanung 4.3 Ergebnisdarstellung 5 Ergebnisse und Diskussion 5.1 Einfluss der Wasserbadtemperatur auf Charakterisierungsparameter 5.2 Charakterisierung nativer Stärke mit variierter Anfangsfeuchte 5.3 Charakterisierung der im Ofen behandelten Stärke 5.4 Charakterisierung der Vakuum-Mikrowellen behandelten Stärke 5.5 Charakterisierung der Mikrowellen behandelten Stärke 5.6 Gegenüberstellung der untersuchten Behandlungsverfahren 6 Zusammenfassung und Ausblick

Membranes act as smart structures in respect to their permeation abilities. Control of particle and fluid permeation through a synthetic membrane can be achieved by using different effects like size-exclusion or electromagnetic interactions that occur between the particles and membrane pores. The simulation of controlled permeability provides an insight into the smart behavior of membranes for chemical signal processing, sensing interfaces or lab-on-a-chip devices. In the current work, we model the underlying physical processes on a microfluidic level using the engineer’s approach of laminar flow through pipes. Different pore geometries inside a composite membrane system consisting of a polyethylene terephthalate support membrane and a poly(N-isopropylacrylamide) hydrogel-layer are investigated. Simulations for different states of thermally induced pore opening are performed for free and blocked states. From the results we derive paradigms for the design of a membrane system for microfluidic cell-size profiling considering stimulus-range, pore shape and measurement setup.

Einleitung: Die Ausbildung eines Netzhautödems ist eine Hauptursache für die Verschlechterung des Sehvermögens bei ischämisch-hypoxischen und inflammatorischen Netzhauterkrankungen. Neben der erhöhten Permeabilität der Blut-Retina-Schranke trägt eine Wasserakkumulation in Netzhautzellen zur Ausbildung eines Netzhautödems bei. Müllerzellen regulieren die retinale Ionen- und Osmohomöostase, indem sie einen transzellulären Ionen- und Wassertransport vermitteln. Zudem kontrollieren Müllerzellen die Größe des Extrazellularraumes, indem sie bei neuronaler Aktivität eine Zellkörperschwellung – ausgelöst durch eine Verkleinerung der extrazellulären Osmolarität – verhindern. Unter pathologischen Bedingungen ist die Volumenregulation gestört, sodass Müllerzellen bei Hypoosmolarität anschwellen. Diese Müllerzellschwellung und eine Glutamat-induzierte Schwellung retinaler Neurone tragen zur Ausbildung eines zytotoxischen Netzhautödems bei. Neuroprotektive Faktoren wie BDNF (brain-derived neurotrophic factor) und bFGF (basic fibroblast growth factor) stimulieren das Überleben retinaler Neurone und verzögern so die retinale Degeneration. Zielstellung: Es war zu zu ermitteln, ob BDNF die zytotoxische Schwellung von Müller- und Bipolarzellen der Rattennetzhaut verhindert. Material und Methoden: Es wurden Netzhautschnitte und isolierte Müller- und Bipolarzellen von 55 adulten Long-Evans-Ratten (durchschnittlich 8-15 Zellen pro Versuchsreihe) verwendet. Eine osmotische Schwellung von Müller- und Bipolarzellen wurde durch eine Superfusion der Schnitte oder der Zellen mit einer 60%igen hypoosmolaren Lösung in Ab- oder Anwesenheit von Bariumchlorid induziert. Die maximale Querschnittsfläche von Müller- und Bipolarzellsomata wurde vor und nach einer vierminütigen Superfusion mit einem konfokalen Laserscanningmikroskop aufgezeichnet. Die nach der Superfusion ermittelte Querschnittsfläche wurde zu den anfänglich gemittelten Kontrollwerten in Beziehung gesetzt und prozentual als Mittelwert mit Standardfehler bestimmt. Mit Hilfe des Prism-Statistikprogramms (Graphpad) wurden die Ergebnisse mittels einem one-way ANOVA Test und einem nachfolgenden Bonferroni\''s multiple comparison Test sowie durch einen Mann-Whitney U Test statistisch analysiert. Ergebnisse: Bei Anwesenheit von BDNF wurde die osmotische Schwellung von Müllerzellen konzentrationsabhängig sowohl in Netzhautschnitten als auch in isolierten Zellen inhibiert. Ebenso inhibierte BDNF konzentrationsabhängig die Schwellung von Bipolarzellen in Netzhautschnitten, jedoch nicht in isolierten Zellen. In Schnitten von postischämischen Netzhäuten bewirkte BDNF eine Schwellungsinhibition von Müllerzellen, nicht aber von Bipolarzellen. Mit pharmakologischen Blockern wurde die durch BDNF induzierte Signalkaskade untersucht. Die BDNF-Schwellungsinhibition von Müllerzellen wurde durch eine Aktivierung von TrkB bewirkt. Die TrkB-Aktivierung führte in Müllerzellen zu einer Transaktivierung von FGF-Rezeptoren sowie zu einer Aktivierung einer glutamatergen-purinergen Signalkaskade, von der bekannt ist, dass sie die osmotische Müllerzellschwellung unterdrückt. Da bFGF die osmotische Müllerzellschwellung inhibiert, wird die Transaktivierung der FGF-Rezeptoren wahrscheinlich durch eine BDNF-induzierte Freisetzung von bFGF aus Müllerzellen vermittelt. Die Ergebnisse lassen vermuten, dass BDNF indirekt auf Bipolarzellen wirkt, indem es eine Freisetzung von Faktoren wie bFGF aus Müllerzellen induziert. Schlussfolgerungen: Die Schwellungsinhibition von Müller- und Bipolarzellen könnte ein neuroprotektiver Mechanismus von BDNF in der Netzhaut darstellen. Während BDNF direkt TrkB auf Müllerzellen aktiviert, ist die Inhibition der Bipolarzellschwellung indirekt und durch die Ausschüttung von glialen Faktoren wie bFGF vermittelt. Der Verlust des Effektes von BDNF auf die Bipolarzellschwellung in ischämischen Netzhäuten könnte darauf zurückzuführen sein, dass gliotische Müllerzellen keine glialen Faktoren mehr in Reaktion auf BDNF freisetzen. Der Verlust des glialen Einflusses auf die Bipolarzellvolumenhomöostase könnte zur Neurodegeneration in der ischämischen Netzhaut beitragen.:Inhaltsverzeichnis ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS IX ABBILDUNGSVERZEICHNIS XI TABELLENVERZEICHNIS XIV 1 EINLEITUNG 1 2 LITERATURÜBERSICHT 3 2.1 Sehorgan - Das Auge 3 2.2 Retina beim Mensch und Tier – Aufbau und Funktionalitäten 4 2.2.1 Bildprozessor der Tierwelt – Die Retina 10 2.2.2 Die Sehbahn – Visuelle Verarbeitung 10 2.2.3 Die Müllerzelle – Vorkommen und Funktion 13 2.2.4 Tierartlicher Vergleich der Müllerzelle 14 2.2.5 Netzhaut als Modellgewebe 16 2.3 Ödembildung: Netzhautödem – Hirnödem 17 2.3.1 Allgemein: Die Pathogenese des Ödems 17 2.3.2 Das Gehirnödem – Ursachen und Folge 17 2.3.3 Das Netzhautödem – Ursachen und Folge 18 2.3.4 Volumen- und Osmohomöostase der Retina 19 2.3.5 Osmotische Schwellung und Osmoregulation der Müllerzelle 19 2.4 Neuroprotektion durch Neurotrophine und Wachstumsfaktoren 21 2.4.1 Brain-derived neurotrophic factor (BDNF) 21 2.4.2 Basic Fibroblastic Growth Factor (bFGF) 22 2.4.3 Neuroprotektive Effekte von BDNF und bFGF in der Retina 23 2.5 Zielstellung 24 2.6 Veterinärmedizinische Relevanz 25 2.6.1 Augenerkrankungen in der Klein- und Großtiermedizin 25 2.6.2 Schlussfolgerung für die Tiermedizin 31 3 TIERE, MATERIAL UND METHODEN 32 3.1 Versuchstiere 32 3.2 Material 32 3.2.1 Chemikalien und Reagenzien 32 3.2.2 Lösungen 33 3.2.3 Testsubstanzen 33 3.2.4 Pharmakologische Blocker 33 3.2.5 Antikörper 35 3.3 Verwendete Materialien und Geräte 36 3.4 Versuchsaufbau und Durchführung von Schwellungsversuchen 37 3.4.1 Gewebspräparation: Retina 37 3.4.2 Zellschwellungsversuche 39 3.4.3 Aufnahmetechnik 40 3.4.4 Superfusion von Retinaschnitten 40 3.4.5 Superfusion von isolierten retinalen Zellen 41 3.4.6 Das Physiologie-Modell: Isoosmolarität – Hypoosmolarität 42 3.4.7 Das Pathologie-Modell mit Barium 42 3.4.8 Tiermodell der retinalen Ischämie – Reperfusion 43 3.5 Auswertungsverfahren 43 3.5.1 Morphometrie der Somata 44 3.5.2 Statistische Analyse 44 3.6 Immunozytochemische Färbungen 45 4 ERGEBNISSE 46 4.1 Zellidentifikation in Retinaschnitten 46 4.1.1 Färbemethodik – MitoTracker Orange 47 4.1.2 Morphologie der Müllerzelle 47 4.1.3 Morphologie der Bipolarzelle 48 4.1.4 Identifikation von Müller- und Bipolarzellen 48 4.1.5 Morphologie isolierter Müller – und Bipolarzellen 49 4.2 Kontrollversuche 50 4.3 Untersuchung des Schwellungsverhaltens mit Testsubstanzen 51 4.4 Untersuchung des Schwellungsverhalten unter BDNF 52 4.4.1 Morphologie der Müllerzellen in Retinaschnitte unter BDNF 52 4.4.2 Wirkung von BDNF auf Müllerzellen in Retinaschnitten 53 4.4.3 Wirkung von BDNF auf die Schwellung von isolierten Müllerzellen 57 4.4.4 Wirkung von BDNF auf die osmotische Schwellung von Bipolarzellen in Retinaschnitten 58 4.4.5 Konzentrationsabhängigkeit der Wirkung von BDNF auf die osmotische Schwellung von Bipolarzellen in Retinaschnitten 59 4.4.6 Wirkung von BDNF auf die Schwellung von isolierten Bipolarzellen 61 4.4.7 Wirkung von BDNF auf die osmotische Müller- und Bipolarzellschwellung in der postischämischen Retina 62 4.5 Untersuchung der osmotischen Schwellung von retinalen Zellen unter bFGF 63 4.5.1 Wirkung von bFGF auf Müllerzellen in Retinaschnitten 63 4.5.2 bFGF-induzierte Transaktivierung metabotroper Glutamatrezeptoren in Müllerzellen 65 4.5.3 Wirkung von bFGF auf die Schwellung von Bipolarzellen in Retinaschnitten 65 4.6 Immunozytochemischer Nachweis von BDNF und TrkB in Müller- und Bipolarzellen 66 4.6.1 Kontrollaufnahmen 66 4.6.2 Immunzytochemischer Nachweis von BDNF und TrkB in isolierten Müllerzellen 67 4.6.3 Immunzytochemischer Nachweis von BDNF und TrkB in isolierten Bipolarzellen 69 5 DISKUSSION 71 5.1 Osmotische Volumenregulation bei Müller- und Bipolarzellen 71 5.2 Immunozytochemische Lokalisation von BDNF und TrkB 73 5.3 Inhibition der osmotischen Schwellung von Müller- und Bipolarzellen durch BDNF 75 5.4 TrkB-Aktivierung in Müllerzellen durch BDNF 77 5.5 Abhängigkeit des BDNF-Effekts von einer Transaktivierung von FGF-Rezeptoren 78 5.6 Indirekte Wirkung von BDNF auf die Bipolarzellschwellung durch gliale Faktoren 79 5.7 Abhängigkeit der BDNF-Wirkung von der Transaktivierung weiterer Rezeptoren 80 5.8 BDNF-induzierte Aktivierung von Ionenkanälen in Müllerzellen 81 5.9 BDNF-induzierte Signalkaskade der Inhibition der retinalen Zellschwellung 82 5.10 Neuroprotektive Wirkung von BDNF 84 6 ZUSAMMENFASSUNG 86 7 SUMMARY 88 8 BILDQUELLENVERZEICHNIS 90 9 LITERATURVERZEICHNIS 91 DANKSAGUNG 109 / Introduction: Tissue edema is a major blinding complication of ischemic-hypoxic and inflammatory retinal diseases. In addition to the hyperpemeability of the blood-retinal barrier, water accumulation in retinal cells resulting in cellular swelling may contribute to the development of retinal edema. Müller glial cells regulate the retinal ion and water homeostasis by allowing transcellular ion and water fluxes. During neuronal activity Müller cells control the extracellular space volume by autocrine inhibition of cellular swelling caused by the reduction of extracellular osmolarity. However, under pathological conditions, Müller cells are not capable to regulate their volume so that they swell rapidly under hypoosmolarity. The osmotic swelling of Müller glial cells and the glutamate induced swelling of retinal neurons contribute to the development of cytotoxic retinal edema. Various neuroprotective factors including brain-derived neurotrophic factor (BDNF) and basic fibroblast growth factor (bFGF) stimulate the survival of retinal neurons and thus delay the retinal degeneration. Objective: The objective of the study is to determine whether BDNF inhibits the osmotic swelling of Müller and bipolar cells of the rat retina. Material and Methods: Retinal slices and freshly isolated Müller and bipolar cells of 55 adult Long-Evans rats (in average 8-15 cells per trial) were used. Osmotic swelling of Müller and bipolar cells was induced by superfusion of retinal slices or isolated cells with a 60% hypoosmotic extracellular solution in the absence or presence of barium chloride. The maximal cross-sectional area of Müller and bipolar cell somata was recorded before and after a four minute-long superfusion by using a laser scanning microscope. To determine the extent of cell soma swelling, the cross-sectional area of the cell body extent after superfusion was related to the former averaged cross-sectional area. Results were given as means with standard error as percent values. Statistical analysis was made with Prism (Graphpad) and the significance was determined by the One-way ANOVA test followed by Bonferroni\''s multiple comparison test and the Mann-Whitney U test, respectively. Results: We found that BDNF inhibits dose-depending the osmotic swelling of Müller cells in retinal slices and of isolated cells. BDNF also inhibited dose-depending the osmotic swelling of bipolar cells in retinal slices; however, it did not inhibit the osmotic swelling in isolated bipolar cells. In slices of postischemic retinas, BDNF inhibited the swelling of Müller cells but not the swelling of bipolar cells. The BDNF induced signal transduction cascade was examined by simultaneous administration of blocking agents with the receptor agonists in the hypoosmotic solution. The BDNF-induced inhibition of the osmotic Müller cell swelling was mediated by activation of TrkB. Activation of TrkB in Müller cells results in transactivation of FGF receptors and in an activation of a glutamatergic-purinergic signal transduction cascade which is known to inhibit the osmotic swelling of the cells. Since bFGF also inhibits the osmotic swelling of Müller cells, it can be assumed that the transactivation of FGF receptors is mediated by a BDNF-induced release of bFGF from Müller cells. The results suggest that the effect of BDNF on bipolar cells is indirect by inducing a subsequent release of glial factor from Müller cells such as bFGF. Conclusion: The results show that BDNF inhibits the osmotic swelling of Müller and bipolar cells. The inhibition of cytotoxic cell swelling may contribute to the neuroprotective action of BDNF in the retina. While BDNF acts directly in Müller cells, the BDNF-induced inhibition of the bipolar cell swelling is indirect and mediated by the release of glial factors such as bFGF from Müller cells. The abrogation of the BDNF-induced inhibition of the osmotic bipolar cell swelling in the postischemic retina could be explained with the impairment of the release of glial factors by Müller cells. The abrogation of the Müller cell-mediated regulation of the bipolar cell volume could contribute to the neuronal degeneration in the ischemic retina.:Inhaltsverzeichnis ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS IX ABBILDUNGSVERZEICHNIS XI TABELLENVERZEICHNIS XIV 1 EINLEITUNG 1 2 LITERATURÜBERSICHT 3 2.1 Sehorgan - Das Auge 3 2.2 Retina beim Mensch und Tier – Aufbau und Funktionalitäten 4 2.2.1 Bildprozessor der Tierwelt – Die Retina 10 2.2.2 Die Sehbahn – Visuelle Verarbeitung 10 2.2.3 Die Müllerzelle – Vorkommen und Funktion 13 2.2.4 Tierartlicher Vergleich der Müllerzelle 14 2.2.5 Netzhaut als Modellgewebe 16 2.3 Ödembildung: Netzhautödem – Hirnödem 17 2.3.1 Allgemein: Die Pathogenese des Ödems 17 2.3.2 Das Gehirnödem – Ursachen und Folge 17 2.3.3 Das Netzhautödem – Ursachen und Folge 18 2.3.4 Volumen- und Osmohomöostase der Retina 19 2.3.5 Osmotische Schwellung und Osmoregulation der Müllerzelle 19 2.4 Neuroprotektion durch Neurotrophine und Wachstumsfaktoren 21 2.4.1 Brain-derived neurotrophic factor (BDNF) 21 2.4.2 Basic Fibroblastic Growth Factor (bFGF) 22 2.4.3 Neuroprotektive Effekte von BDNF und bFGF in der Retina 23 2.5 Zielstellung 24 2.6 Veterinärmedizinische Relevanz 25 2.6.1 Augenerkrankungen in der Klein- und Großtiermedizin 25 2.6.2 Schlussfolgerung für die Tiermedizin 31 3 TIERE, MATERIAL UND METHODEN 32 3.1 Versuchstiere 32 3.2 Material 32 3.2.1 Chemikalien und Reagenzien 32 3.2.2 Lösungen 33 3.2.3 Testsubstanzen 33 3.2.4 Pharmakologische Blocker 33 3.2.5 Antikörper 35 3.3 Verwendete Materialien und Geräte 36 3.4 Versuchsaufbau und Durchführung von Schwellungsversuchen 37 3.4.1 Gewebspräparation: Retina 37 3.4.2 Zellschwellungsversuche 39 3.4.3 Aufnahmetechnik 40 3.4.4 Superfusion von Retinaschnitten 40 3.4.5 Superfusion von isolierten retinalen Zellen 41 3.4.6 Das Physiologie-Modell: Isoosmolarität – Hypoosmolarität 42 3.4.7 Das Pathologie-Modell mit Barium 42 3.4.8 Tiermodell der retinalen Ischämie – Reperfusion 43 3.5 Auswertungsverfahren 43 3.5.1 Morphometrie der Somata 44 3.5.2 Statistische Analyse 44 3.6 Immunozytochemische Färbungen 45 4 ERGEBNISSE 46 4.1 Zellidentifikation in Retinaschnitten 46 4.1.1 Färbemethodik – MitoTracker Orange 47 4.1.2 Morphologie der Müllerzelle 47 4.1.3 Morphologie der Bipolarzelle 48 4.1.4 Identifikation von Müller- und Bipolarzellen 48 4.1.5 Morphologie isolierter Müller – und Bipolarzellen 49 4.2 Kontrollversuche 50 4.3 Untersuchung des Schwellungsverhaltens mit Testsubstanzen 51 4.4 Untersuchung des Schwellungsverhalten unter BDNF 52 4.4.1 Morphologie der Müllerzellen in Retinaschnitte unter BDNF 52 4.4.2 Wirkung von BDNF auf Müllerzellen in Retinaschnitten 53 4.4.3 Wirkung von BDNF auf die Schwellung von isolierten Müllerzellen 57 4.4.4 Wirkung von BDNF auf die osmotische Schwellung von Bipolarzellen in Retinaschnitten 58 4.4.5 Konzentrationsabhängigkeit der Wirkung von BDNF auf die osmotische Schwellung von Bipolarzellen in Retinaschnitten 59 4.4.6 Wirkung von BDNF auf die Schwellung von isolierten Bipolarzellen 61 4.4.7 Wirkung von BDNF auf die osmotische Müller- und Bipolarzellschwellung in der postischämischen Retina 62 4.5 Untersuchung der osmotischen Schwellung von retinalen Zellen unter bFGF 63 4.5.1 Wirkung von bFGF auf Müllerzellen in Retinaschnitten 63 4.5.2 bFGF-induzierte Transaktivierung metabotroper Glutamatrezeptoren in Müllerzellen 65 4.5.3 Wirkung von bFGF auf die Schwellung von Bipolarzellen in Retinaschnitten 65 4.6 Immunozytochemischer Nachweis von BDNF und TrkB in Müller- und Bipolarzellen 66 4.6.1 Kontrollaufnahmen 66 4.6.2 Immunzytochemischer Nachweis von BDNF und TrkB in isolierten Müllerzellen 67 4.6.3 Immunzytochemischer Nachweis von BDNF und TrkB in isolierten Bipolarzellen 69 5 DISKUSSION 71 5.1 Osmotische Volumenregulation bei Müller- und Bipolarzellen 71 5.2 Immunozytochemische Lokalisation von BDNF und TrkB 73 5.3 Inhibition der osmotischen Schwellung von Müller- und Bipolarzellen durch BDNF 75 5.4 TrkB-Aktivierung in Müllerzellen durch BDNF 77 5.5 Abhängigkeit des BDNF-Effekts von einer Transaktivierung von FGF-Rezeptoren 78 5.6 Indirekte Wirkung von BDNF auf die Bipolarzellschwellung durch gliale Faktoren 79 5.7 Abhängigkeit der BDNF-Wirkung von der Transaktivierung weiterer Rezeptoren 80 5.8 BDNF-induzierte Aktivierung von Ionenkanälen in Müllerzellen 81 5.9 BDNF-induzierte Signalkaskade der Inhibition der retinalen Zellschwellung 82 5.10 Neuroprotektive Wirkung von BDNF 84 6 ZUSAMMENFASSUNG 86 7 SUMMARY 88 8 BILDQUELLENVERZEICHNIS 90 9 LITERATURVERZEICHNIS 91 DANKSAGUNG 109

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One of prominent issues related to failures in nuclear power components is attributed to material degradation due the aggressive environment conditions, and mechanical stresses. For instance, reactor core support components, such as fuel claddings, are under prolonged exposure to an intense neutron field from the fission of fuel and operate at elevated temperature under fatigue loadings caused by start up, shut down, and unscheduled emergency shut down. Additionally, exposure to highluence neutron radiation can lead to microscopic defects that result in material hardening and embrittlement, which significantly affects the physical and mechanical properties of the materials, resulting in further reduction in fatigue life of reactor structural components. The effects of fatigue damage on material deterioration can be further exacerbated by the presence of thermal loading, hold-time, and high-temperature water coolant environments. In this study, uniaxial fatigue models were used to predict fatigue behavior based only on simple monotonic properties including ultimate tensile strength and Brinell hardness. Two existing models, the Bäumel Seeger uniform material law and the Roessle Fatemi hardness method, were employed and extended to include the effects of test temperature, neutron irradiation fluence, irradiation induced helium and irradiation induced swellings on fatigue life of austenitic stainless steels. Furthermore, a methodology to estimate fatigue crack length using a strip-yield based model is presented. This methodology is also extended to address the effect of creep deformation in a presence of hold- times, and expanded to include the effects of irradiation and water environment. Reasonable fatigue life predictions and crack growth estimations are obtained for irradiated austenitic stainless steels types 304, 304L, and 316, when compared to the experimental data available in the literature. Lastly, a failure analysis methodology of a mixer unit shaft made of AISI 304 stainless steel is also presented using a conventional 14-step failure analysis approach. The primary mode of failure is identified to be intergranular stress cracking at the heat affected zones. A means of circumventing this type of failure in the future is presented.

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