Background: The Wnt/β-catenin signalling pathway is activated in arrhythmogenic heart diseases such as myocardial infarction and heart failure, but it is unclear if the pathway regulates cardiac ion channels and thus may play a role in arrhythmogenesis. Previous PCR array screening from our lab showed that the transcript level of the T-type calcium channel gene Cacna1g was reduced in primary culture of neonatal rat ventricular myocytes (NRVMs) after activation of Wnt/β-catenin signalling with Wnt3a protein (100 ng/ml) or a small molecule activator of the pathway, CHIR (3 µM) (n=3, p<0.01). In this study, we examined the effects of Wnt/β-catenin signalling on T-type calcium channels (Caᴠ3.1), which play a key role in the pacemaker function of the sinoatrial node (SAN). Results: RT-qPCR and western blot demonstrated dose-dependent reductions in Cacna1g mRNA (n=7, p<0.01) and Cav3.1 protein (n=4, p<0.01) in NRVMs after treatment with CHIR (3 μM). There was also a decrease in Cacna1g mRNA in human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes (hiPSC-CMs) after treatment with CHIR (5 μM) (n=4; p<0.001). Patch-clamp recording demonstrated reduced T-type calcium current (ICa,T) in NRVMs after Wnt3a treatment (3 μg/ml) (n=5, p<0.05). In isolated mouse SAN tissue, perfusion with an ICa,T blocker, ML-218 (30 µM), led to dose-dependent reductions in spontaneous beating rate (n=4, p<0.0001) indicating a critical role of ICa,T in SAN pacemaking. In adult rats, activation of Wnt/β-catenin signalling through the application of CHIR in a poloxamer gel to the SAN region did not alter the in vivo heart rate in electrocardiogram (ECG) (n=8, p=0.12). However, ex vivo culture of SAN tissue from the in vivo experiments revealed a reduction intrinsic beating rate in the CHIR treated group (n=7) compared to the control (DMSO) (n=8) (p<0.05). Summary: Wnt/β-catenin signalling inhibits T-type Ca²⁺ current in cardiomyocytes by, at least partly, reduced Cacna1g mRNA and Cav3.1 protein. Activation of Wnt/β-catenin signalling reduces the intrinsic heart rate likely by inhibition of T-type Ca²⁺ current in SAN pacemaker cells.

One of the most common plasticizers used in the production of plastic are phthalates. These chemicals have been associated with many adverse effects including developmental and reproductive anomalies. Early developmental processes targeted by chemicals can have long-lasting effects on individuals. The focus of this study was on investigating the effects of a phthalate monoester mixture on two evolutionarily conserved processes, Wnt/β-catenin signaling and apoptosis, both of which play an important role during development. Focus was also given on the mixture’s effect in metabolic rate. The phthalate mixture used is part of mixture G, a mixture which additionally contains triclosan and three perfluoroalkyl acids. The components of Mixture G were identified in a Swedish pregnancy cohort (SELMA) and were inversely associated with birth weight. The experiments were conducted in zebrafish embryos. Wnt signaling was analyzed in a transgenic zebrafish line, which had the EGFP gene linked to β-catenin regulated promoters, by measuring the fluorescence in the caudal fin. Apoptosis was analyzed through the acridine orange assay and metabolic rate through the transformation of resazurin to resorufin in presence of NADH/NADPH. The results showed a downregulation of Wnt signaling in zebrafish at two days post-fertilization (2 dpf), at a water concentration 100 times higher than the geometric mean serum concentration (100x hsc) of the mothers in the SELMA cohort. An upregulation of apoptosis was found at 1 dpf, at 60x hsc and 100x hsc. An effect on metabolic rate was observed at 100x hsc at 5 dpf. The results indicate that phthalates can disrupt Wnt signaling, induce apoptosis and influence metabolic rate, which along with the various reproductive effects they can induce warrants cause for concern not only for zebrafish embryos but for human fetuses as well.

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Resident cardiac Sca-1-positive (+) stem cells may differentiate into cardiomyocytes to improve the function of damaged hearts. However, little is known about the inducers and molecular mechanisms underlying the myogenic conversion of Sca-1+ stem cells. Here we report that sphingosylphosphorylcholine (SPC), a naturally occurring bioactive lipid, induces the myogenic conversion of Sca-1+ stem cells, as evidenced by the increased expression of cardiac transcription factors (Nkx2.5 and GATA4), structural proteins (cardiac Troponin T), transcriptional enhancer (Mef2c) and GATA4 nucleus translocation. First, SPC activated JNK and STAT3, and the JNK inhibitor SP600125 or STAT3 inhibitor stattic impaired the SPC-induced expression of cardiac transcription factors and GATA4 nucleus translocation, which suggests that JNK and STAT3 participated in SPC-promoted cardiac differentiation. Moreover, STAT3 activation was inhibited by SP600125, whereas JNK was inhibited by β-cyclodextrin as a lipid raft breaker, which indicates a lipid raft/JNK/STAT3 pathway involved in SPC-induced myogenic transition. β-Catenin, degraded by activated GSK3β, was inhibited by SPC. Furthermore, GSK3β inhibitors weakened but the β-catenin inhibitor promoted SPC-induced differentiation. We found no crosstalk between the lipid raft/JNK/STAT3 and β-catenin pathway. Our study describes a lipid, SPC, as an endogenic inducer of myogenic conversion in Sca-1+ stem cells with low toxicity and high efficiency for uptake.

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CD97 ist ein G protein-coupled receptor der zu der Gruppe der Adhäsions-GPCRs zuzuordnen ist. CD97 ist im normalen humanen Darmepithel in lateralen Zellkontakten lokalisiert. In transgenen Mäusen, die CD97 selektiv in normalen intestinalen Epithelzellen überexprimieren, werden die adherens junctions durch Stabilisierung des nicht-phosphorylierten membran-gebundenen β-catenins verstärkt. Neben der Epithelzellverband-stabilisierenden Funktion von β-catenin in adherens junctions spielt β-catenin im Zellkern als Aktivator von Transkriptionsfaktoren eine entscheidende Rolle in der kolorektalen Karzinogenese. Diese unterschiedliche zelluläre Verteilung wird über den kanonischen Wnt-Signalweg reguliert. CD97 wird in kolorektalen Karzinomen hochreguliert. Steinert et al. beschrieben, dass insbesondere sogenannte scattered Tumorzellen an der Invasionsfront des kolorektalen Karzinoms CD97 im Vergleich zu Zellen im Tumorzentrum höher exprimieren. Dieses Phänomen geht mit einem höheren Tumorstadium und verstärkter Lymphgefäßinvasion einher. In diesen Zellen wird β-catenin verstärkt im Zytoplasma und im Zellkern exprimiert. Die histologische Lokalisation von CD97 im kolorektalen Normal- und Karzinomgewebe ließ zunächst vermuten, dass CD97 ein direktes β-catenin/Tcf-Zielgen im fehlregulierten Wnt-Signalweg ist. Es konnte jedoch gezeigt werden, dass CD97 kein Zielgen des kanonischen Wnt-Signalweges ist. In dieser Arbeit wird zum ersten Mal eine immunhistochemische Studie durchgeführt, die die Lokalisation von CD97 und β-catenin in normalem und malignem kolorektalem Gewebe parallel vergleichend analysiert. Bisher konnte CD97 nur im Kryostat-Schnitt immunhistochemisch dargestellt werden. Die immunhistochemische Darstellung der nukleären Expression von β-catenin ist jedoch nur in Paraffin-eingebetteten Geweben möglich. Somit etablierten wir erstmals eine immunhistochemische Färbemethode, die es erlaubt CD97 in Paraffin-eingebetteten humanen kolorektalen Geweben darzustellen. CD97 wird in allen Schnitten des kolorektalen Normalgewebes exprimiert. Sowohl CD97 als auch β-catenin sind dabei vorwiegend in den lateralen Zellkontakten aber auch im Zytoplasma der Zellen lokalisiert. Die Färbescores von CD97 und β-catenin in den lateralen Zellkontakten der normalen Enterozyten korrelieren signifikant miteinander. In kolorektalen Karzinomen verschwinden dann beide Moleküle simultan aus diesen lateralen Zellkontakten. Während β-catenin daraufhin im Zytoplasma und den Zellkernen der Karzinomzellen erscheint, ist die neu auftretende verstärkte Expression von CD97 auf das Zytoplasma der Karzinomzellen beschränkt. Dieses simultane Auftreten von CD97 im Zytoplasma und von β-catenin im Zellkern maligner kolorektaler Zellen korreliert mit dem Auftreten von scattered Tumorzellen. Die scattered Tumorzellen, auch als tumor buds bezeichnet, besitzen hypo-proliferative und apoptotische Eigenschaften. Diese scattered Tumorzellen an der Invasionsfront der kolorektalen Karzinome unseres Kollektivs exprimieren CD97 jedoch nicht stärker als Zellen im Karzinomzentrum. β-catenin hingegen wird in diesen scattered Tumorzellen vermehrt im Zytoplasma und in den Zellkernen exprimiert. Die Unterschiede der Färbeergebnisse im Vergleich zur Arbeit von Steinert et al. sind zum einen auf die Verwendung von Paraffin- statt Kryostat-Schnitten in unserer Studie und zum anderen auf die Nutzung verschiedener Antikörper gegen CD97, die unterschiedliche Epitope erkennen, zurückzuführen. Wir konnten einen Expressionsgradienten von CD97 entlang der Krypt-Villus-Achse, mit starker Expression im Kryptenbereich und schwächerer Expression in apikalen Bereichen, zeigen. Passend dazu wird nicht-phosphoryliertes membrangebundenes β-catenin in Kryptengrund-nahen Enterozyten stärker exprimiert. Dies ist ein weiterer Hinweis auf eine wahrscheinliche Interaktion von CD97 und nicht-phosphoryliertem membrangebundenem β-catenin. Ebenfalls passend zum hier gezeigten Expressionsgradienten von CD97 entlang der Krypt-Villus-Achse und der Regeneration der Enterozyten aus Kryptengrund-nahen undifferenzierten intestinalen Stammzellen konnte zuletzt gezeigt werden, dass der Vorgang der Apoptose durch CD97 inhibiert wird. Hier konnten wir nachweisen, dass in weiter luminal gelegenen Enterozyten die Expression von CD97 abnimmt. Diese Beobachtung harmoniert mit der Tatsache, dass apoptotische Zelluntergänge, im Sinne der Homöostase der intestinalen Selbsterneuerung, in diesen Enterozyten zunehmen. Dieses apoptotische Verhalten von CD97 könnte eine wichtige Rolle beim Überleben von Tumorzellen spielen. Kürzlich konnten wir in unserer Arbeitsgruppe zeigen, dass CD97 und β-catenin in den lateralen Zell-Zellkontakten miteinander interagieren. Passend dazu ko-immunpräzipitiert CD97 β-catenin in DLD-1-Zellen und transgenen (Tg-villin-CD97) Zellen und umgekehrt. Obwohl sich wie hier gezeigt die Expression von CD97 und β-catenin in den lateralen Zell-Zellkontakten simultan vermindert und es sich gleichzeitig eine parallele Zunahme der Expression von CD97 und β-catenin im Zytoplasma zeigt, kommt es zu keiner nachweisbaren Interaktion beider Moleküle im Zytoplasma. Passend dazu konnte auch nur in den lateralen Zellkontakten eine Kolokalisation beider Moleküle in der Immunfluoreszens gezeigt werden. Es konnte ebenfalls gezeigt werden, dass CD97 weder die Lokalisation noch die Expression von β-catenin beeinflusst. Wie beschrieben stabilisiert CD97 die lateralen Zell-Zellkontakte im normalen Epithelgewebe. Im Gegensatz dazu steht die Funktion von CD97 in malignen Geweben. Die Expression von CD97 korreliert mit dem Vermögen von kolorektalen Tumorzelllinien zur Serum-induzierten Migration und Invasion. Die Serumkomponente Lysophosphatidsäure (LPS) induziert Zellmigration durch eine Dämpfung der LPS-Rezeptor Signaltransduktion über Gα12/13 und RhoA auf das Zytoskelett durch eine Interaktion mit CD97. Für diese durch CD97 verstärkte Zellmigration ist das vollständige CD97-Molekül notwendig. Wie unlängst gezeigt, verhindert die Verkürzung des CTF von CD97 ebenfalls die Interaktion von CD97 und β-catenin. Noch ist unklar, ob die beiden Funktionen von CD97, Zelladhäsion und Regulation der Migration von Tumorzellen, miteinander im Zusammenhang stehen. Die Reduktion von CD97 in den lateralen Zell-Zellkontakten führt zum Auftreten von CD97 im Zytoplasma. Interessanterweise konnte zuletzt in unserer Arbeitsgruppe gezeigt werden, dass CD97 nach Zerstörung dieser Zell-Zellkontakte schneller im Zytoplasma erscheint als β-catenin. Dieser Fakt spricht mehr für eine Translokation als für eine Akkumulation bzw. Hinderung des Transports von CD97 zur Zellmembran in Tumorzellen. Es konnte gezeigt werden, dass nach dem Erscheinen von CD97 im Zytoplasma die Kolokalisation und somit auch die Interaktion mit β-catenin nicht mehr nachweisbar ist. Somit stimuliert CD97 nicht die β-catenin-abhängige TCF-vermittelte Aktivität von Transkriptionsfaktoren und es kommt nicht zur Aktivierung von Genen, die Proteine kodieren, welche u.a. die kolorektale Karzinogenese stimulieren. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass CD97 ein multifunktionales Protein ist, dass über eine Interaktion mit β-catenin in adherens junctions in normalen Epithelzellen die Zell-Zelladhäsion reguliert und andererseits über eine Interaktion mit dem LPS-Rezeptor eine wichtige Rolle in Signaltransduktionswegen in Karzinomzellen spielt.

京都大学 / 0048 / 新制・課程博士 / 博士(医学) / 甲第18141号 / 医博第3861号 / 新制||医||1002(附属図書館) / 30999 / 京都大学大学院医学研究科医学専攻 / (主査)教授 坂井 義治, 教授 髙田 穣, 教授 武藤 学 / 学位規則第4条第1項該当 / Doctor of Medical Science / Kyoto University / DFAM

京都大学 / 0048 / 新制・課程博士 / 博士(工学) / 甲第20361号 / 工博第4298号 / 新制||工||1666(附属図書館) / 京都大学大学院工学研究科マイクロエンジニアリング専攻 / (主査)教授 安達 泰治, 教授 小寺 秀俊, 教授 田畑 修 / 学位規則第4条第1項該当 / Doctor of Philosophy (Engineering) / Kyoto University / DFAM

京都大学 / 0048 / 新制・課程博士 / 博士(医科学) / 甲第21029号 / 医科博第90号 / 新制||医科||6(附属図書館) / 京都大学大学院医学研究科医科学専攻 / (主査)教授 山下 潤, 教授 湊谷 謙司, 教授 原田 浩 / 学位規則第4条第1項該当 / Doctor of Medical Science / Kyoto University / DFAM

京都大学 / 0048 / 新制・課程博士 / 博士(医学) / 甲第21642号 / 医博第4448号 / 新制||医||1034(附属図書館) / 京都大学大学院医学研究科医学専攻 / (主査)教授 妹尾 浩, 教授 小川 誠司, 教授 坂井 義治 / 学位規則第4条第1項該当 / Doctor of Medical Science / Kyoto University / DFAM