Der (Pro)Renin Rezeptor (PRR) ist ein hoch konservierter Transmembranrezeptor, der ursprünglich beschrieben wurde Renin und Prorenin zu binden. Durch Bindung an Renin und Prorenin beeinflusst der PRR das Renin-Angiotensin-Systems und induziert eine MAP-Kinase-Signaltransduktion. Teile des PRR sind assoziiert mit der vakuolären H+-ATPase (vATPase), welche wichtig für die Azidifizierung zellulärer Organellen ist. Kürzlich wurde eine neue Funktion des PRR für den WNT/β-catenin Signalweg beschrieben. Hier dient der PRR als Verbindungsglied zwischen den WNT Rezeptoren und der vATPase. Die Mechanismen der Funktionen des PRR sind noch nicht verstanden, aber es wird angenommen, dass der PRR in die Regulation verschiedenster zellulärer Mechanismen involviert ist. Es gibt bis jetzt keine biochemische und strukturelle Charakterisierung des PRR. In der vorliegenden Arbeit wurden strukturelle Studien mit verschiedenen Konstrukten des extrazellulären Teils des PRR durchgeführt. Alle PRR Konstrukte (hsPRR (170-303), hsPRR (101-257) und hsPRR (166-257)) zeigten eine alpha-helikale Faltung und konnten nicht an Renin oder Prorenin binden. Der hsPRR (101-257) liegt in einem Konzentrations- und pH-abhängigen Monomer-/Oligomerequilibrium vor, während der hsPRR (166-257) als Monomer/Dimerequilibrium vorkommt. Diese Daten bilden die Grundlage für weitere strukturelle und funktionelle Untersuchungen. Konditionelle KO Mäuse sind eine exzellente Methode, um die physiologische Rolle des PRR in vivo zu untersuchen. Eines der wichtigsten Proteine des Wnt/β-catenin Signaltransduktionsweges, β-catenin, ist fundamental für die T-Zell Entwicklung. Aus diesem Grund wurde untersucht, ob die Deletion des PRR in T-Zellen ebenfalls zu einem Verlust von T-Zellen und zu einer Entwicklungsstörung führt. Die Ergebnisse zeigen, dass der PRR wichtig für eine vollständige T-Zellentwicklung ist und unterstützen die Hypothese, dass der PRR eine Rolle für Wnt/β-catenin Singaltransduktion in T-Zellen spielt. / The (pro)renin receptor (PRR) is an evolutionary conserved transmembrane receptor that was first discovered to bind renin and prorenin. Upon binding, PRR was shown to influence the activity of the renin-angiotensin-system (RAS) and to induce MAP kinase signalling. It was previously shown that a truncated, transmembrane part of PRR was associated to vacuolar H+-ATPase (vATPase), a proton pump which is important for acidification. Recently, a new function of PRR in the WNT/β-catenin signalling pathway was described. Here, the PRR was shown to be an adaptor between WNT receptors and the vATPase. The precise mechanisms by which PRR functions, are still elucidative but the PRR is supposed to regulate various cellular processes. Currently, no biochemical characterization or structural analysis is available for PRR. In order to gain understanding of the function of the PRR, structural studies were performed with several truncated proteins of the extracellular part of the PRR. All PRR proteins (hsPRR170-303, hsPRR 101-257 or hsPRR 166-257) showed an overall alpha helical folding and did not bind renin or prorenin. The oligomeric assembly of the proteins was investigated. The hsPRR (101-257) was shown to be in a concentration and pH dependent monomer/oligomer equilibrium, whereas hsPRR (166-257) is only present in a monomer/dimer equililibrium. These data are the basics for further structural and functional studies. Additionally, conditional KO animals are an excellent tool to investigate the physiological role of the PRR in vivo. As the major mediator of the Wnt/β-catenin signaling pathway, β-catenin, is crucial for T cell maturation, a conditionel deletion of PRR in T cells was analyzed. PRR deletion resulted in a loss of mature T cells. Moreover, a defect in T cell maturation in the thymus was determined. Our data showed that PRR is critical for proper T cell development and support the hypothesis that PRR contributes to Wnt/β-catenin signaling in T cells.

S100A4 spielt eine zentrale Rolle für die Metastasierung des Dickdarmkrebses. Die Hemmung der S100A4 Expression stellt damit einen vielversprechenden therapeutischen Ansatz dar. Die vorliegende Arbeit präsentiert Niklosamid und Calcimycin als neue Inhibitoren der S100A4 Transkription. In Kolonkarzinomzellen, die mit einem der beiden Inhibitoren behandelt wurden, wurde die S100A4 Expression konzentrations- und zeitabhängig unterdrückt. Des Weiteren war die Zellmigration und -invasion in Abhängigkeit von S100A4 in behandelten Zellen vermindert. Niklosamid und Calcimycin Behandlung verhinderten die Zellproliferation und die Koloniebildung von Kolonkarzinomzellen. Beide Inhibitoren hemmten den konstitutiv aktiven Wnt Pathway von Kolonkarzinomzellen. Calcimycin Behandlung verminderte die Expression von beta-catenin. Niklosamid hemmte die Bildung des beta-catenin/TCF Komplexes und unterband damit die Expression von Wnt Pathway Genen, wie z.B. S100A4. Im Rahmen dieser Arbeit wurde ein in vivo Tiermodell entwickelt, mit dem die S100A4-induzierte Metastasierung mit Hilfe von nicht-invasivem Biolumineszenz Imaging visualisiert werden konnte. In diesem Model konnte gezeigt werden, dass Niklosamid signifikant die S100A4 Expression im Tumor vermindert und damit die Metastasierung hemmt. Des Weiteren zeigt diese Arbeit, dass S100A4 die Expression des Wnt Pathway Antagonisten DKK-1 in Kolonkarzinomzellen hemmt. DKK-1 selbst konnte als endogener Inhibitor der S100A4 Expression identifiziert werden. Zusammenfassend beschreibt die vorliegende Arbeit einen neuen regulativen Mechanismus im Wnt Pathway, der die S100A4 Expression im Kolonkarzinom fördert. Diese Beobachtung verdeutlicht die Notwendigkeit für wirksame S100A4 Inhibitoren, wie Niklosamid und Calcimycin, die das Potenzial haben, in einer klinischen Anwendung die Metastasierung von Kolonkarzinompatienten mit erhöhter S100A4 Expression zu hemmen und damit deren Überlebenschance wesentlich zu verbessern. / S100A4 promotes metastasis in colon cancer patients thereby reducing their five-year survival chances to less than 10%. Consequently, inhibition of S100A4 expression is a promising strategy for anti-metastatic treatment of colon cancer patients. The present study characterizes the small molecules niclosamide and calcimycin as transcriptional inhibitors of S100A4 which reduced S100A4 expression concentration- and time-dependently. Niclosamide and calcimycin treatment restricted cell migration, invasion and wound healing capabilities in a S100A4-specific manner, and inhibited cell proliferation and colony formation of colon cancer cells. Both small molecule inhibitors interfere with the constitutively active Wnt pathway. Targeting β-catenin expression by calcimycin or interfering with the β-catenin/TCF transcription activating complex by niclosamide resulted in reduced Wnt target gene transcription, among them S100A4. The study further presents a human colon cancer xenograft mouse model for monitoring S100A4-induced metastasis formation via non-invasive bioluminescence imaging. Treatment of xenograft mice with niclosamide resulted in a significant reduction of the S100A4 mRNA level in the tumor accompanied by inhibition of metastasis formation. Moreover, this study presents evidence that S100A4 is an inhibitor of DKK-1 expression. In colon cancer cells DKK-1 and S100A4 expression was negatively correlated. Ectopic S100A4 overexpression inhibited DKK-1 expression. Targeting S100A4 via shRNA recovered the repressed DKK-1 expression and vice versa. In summary, the study describes a novel positive feedback loop in the Wnt pathway regulation formed by S100A4 repressing its antagonist DKK-1. This novel mechanism further strengthens the need for S100A4 inhibitors such as niclosamide or calcimycin. Consequently, such small molecules provide immense potential for the treatment of colon cancer patients who are at high risk for S100A4-induced colon cancer metastasis.

Wnt/beta-Catenin-Signalgebung hat große Bedeutung für die Initiation und Progression verschiedener Krebsarten. Unser Labor hat kürzlich ein Mausmodell für Squamöse Speicheldrüsen-Karzinome etabliert, das menschliche Hals-Nasen-Ohren-Karzinome reflektiert, durch kombinierte Mutationen von beta-Catenin und dem Bmp-Rezeptor 1a. Diese Tumore enthielten hohen Level von sich selbst-erneuernden Krebs-Stammzellen. Behandlung mit den Wnt-Inhibitoren ICG-001 blockierte die Selbsterneuerung und induzierte die Differenzierung der Krebs-Stammzellen. In den Krebs-Stammzellen der Maus wurde eine globale Aufregulierung des Histonmarkers H3K4me3 beobachtet, was durch Wnt-Inhibition gehemmt werden konnte. Um die molekularen Mechnismen aufzuklären, wurden die Histon-Methyltransferasen für H3K4me3, d.h., Mitglieder der Mll-Proteinfamilie, in sphären-kultivierten Krebs-Stammzellen durch RT-PCR analysiert: Mll1 war hoch transkribiert, zusammen mit den Hoxa9- und Meis1-Zielgenen. Interessanterweise aktivierte die Expression von Mll1 durch Wnt-Signalgebung die distale Enhancer-Region von Mll1, was durch Luciferase-Reporter-Assays gemessen wurde. Immunopräzipitation zeigte weiter, dass Mll1 im beta-Catenin-Transcriptionsfaktor-Komplex involviert ist: shRNA-Behandlung von Mll1 reduzierte die Sphären-Bildung der Speicheldrüsen-Krebs-Stammzellen der Maus. In doppelt-mutanten Mäusen hat die zusätzliche genetische Ablation von Mll1 die Tumorbildung verhindert und die Selbsterneuerung der Krebs-Stammzellen reduziert. Diese Daten zeigen dass die beta-Catenin-Mll1-Achse die Selbsterneuerung der Stammzellen antreibt und deren Differenzierung verhindert, und zwar via epigenetische Mechanismen. Deshalb wird durch das Targeting von Mll1 und dessen Interaktion mit beta-Catenin und andern Komponenten den gesunden epigenetischen Zustand in den Stammzellen wieder herstellt, was eine neue und vielversprechende Möglichkeit für die Behandlung von Patienten mit Hals-Nasen-Ohren-Tumoren darstellt. / Wnt/beta-catenin signaling has been implicated in the initiation and progression of various human cancers. Our lab has recently established a mouse model of salivary gland squamous cell carcinomas (SCCs), which resembles human head and neck cancer, by combined gain- and loss-of-function mutations of beta-catenin and the Bmp receptor 1a (double mutant tumors). These tumors contained highly self-renewing cancer stem cells (CSCs) that were Wnt-dependent. Treatment with the Wnt inhibitor ICG-001 (interferes with beta-catenin-CBP-Mll1 interaction) blocked the self-renewal and induced differentiation of CSCs. In the mouse salivary gland CSCs, a global up-regulation of the histone mark H3K4me3 was observed, which could be suppressed by Wnt inhibition. To study the potential molecular mechanisms, the H3K4me3 histone methyl-transferases, i.e., members of the Mll protein family were analyzed in freshly isolated, sphere-cultured CSCs by RT-PCR: Mll1 was highly transcribed, together with its target genes Hoxa9 and Meis1. Interestingly, the expression of Mll1 was upregulated by Wnt signaling by activating its distal enhancer regions, which was seen with Luciferase reporter assays. Immuno-precipitation further showed that Mll1 is involved in the beta-catenin/Tcf4 transcription factor complex: shRNA treatment against Mll1 reduced sphere formation of mouse salivary gland CSCs. In double mutant mice, additional genetic ablation of Mll1 (triple mutant tumors) abrogated tumor formation and affected the self-renewal ability of CSCs. Collectively, the data presented in this study show that the beta-catenin-Mll1 axis drives self‐renewal and fends off differentiation of CSCs via epigenetic mechanisms. Therefore, targeting Mll1 or its interaction with beta-catenin and other components may help to restore a healthy epigenetic state in the stem cells, which represent a novel and promising therapeutic approach for the treatment of head and neck SCCs.

Das Herz ist das erste Organ, das sich während der Embryonalentwicklung bildet und durch die Verteilung von Nährstoffen und Sauerstoff für die Lebenserhaltung von Geweben und Organen verantwortlich ist. Die Herzentwicklung benötigt die koordinierte Rekrutierung von zwei Herzvorläufer-Populationen, dem ersten und zweiten Herzfeld, welche sich aus einer gemeinsamen Vorläuferzellpopulation während der Gastrulation bilden. In der vorliegenden Arbeit wurde der Einfluss der Bmp- und Wnt-Signalwege auf die frühe Herzentwicklung in Mäusen untersucht. Dafür wurden mit Hilfe der Cre/LoxP-Technik inaktivierende und aktivierende Mutationen im Bmp-Rezeptor Ia (BmpRIa) und im zentralen Modulator des Wnt-Signalweges, beta-Catenin, in Zellen des Mesoderms eingeführt, aus dem beide Herzfelder hervorgehen. Inaktivierende Mutationen im BmpRIa führen zum Verlust von erster Herzfeldderivate und zum Expressionsverlust von Genen, welche für die Aufrechterhaltung und Spezialisierung des ersten Herzfeldes in den späteren linken Ventrikel wichtig sind. In Mäusen mit inaktivierenden Mutationen in beta-Catenin bildet sich das erste Herzfeld korrekt, während die Entwicklung des zweiten Herzfeldes, z.B. die rechtsgerichtete Windung des linearen Herzrohres sowie Bildung des Ausflusstrakts und rechten Ventrikels, gestört ist. Die Genexpression von Bmp4 und Islet1 in Vorläufern des zweiten Herzfeldes ist stark reduziert, während aktivierende Mutationen in beta-Catenin diese verstärken und die Bildung des linearen Herzrohres stören. Diese Ergebnisse zeigen, dass beta-Catenin für die Entwicklung des zweiten Herzfeldes entscheidend ist, und dass die Aktivierung des Wnt/beta-Catenin-Signalweges zeitlich und räumlich präzise reguliert werden muss, damit sich ein windendes lineares Herzrohr entwickeln kann. Zusammenfassend konnte in dieser Arbeit gezeigt werden, dass die BmpRIa- und Wnt/beta-Catenin-Signalwege unterschiedliche Rollen während der Musterbildung in der frühen Herzentwicklung spielen. / The vertebrate heart is the first organ that forms during embryonic development. Heart formation requires the coordinated recruitment of multiple cardiac progenitor cell populations derived from both the first and second heart fields, which arise from a common progenitor at gastrulation. In this study we have ablated the Bmp receptor 1a (BmpRIa) and the Wnt effector beta-Catenin in the developing heart of mice using MesP1-cre, which acts in early mesoderm progenitors that contribute to both first and second heart fields. Remarkably, the entire cardiac crescent and later the primitive ventricle were absent in MesP1-cre; BmpR1a loss-of-function mutants. While myocardial progenitor and differentiation markers were detected in the small, remaining cardiac field in these mutants, first heart field markers, which are required for the maintenance and specification of first heart field derivatives, were not expressed. We conclude from these results that Bmp receptor signaling is crucial for the specification of the first heart field. In MesP1-cre; beta-Catenin loss-of-function mutants, cardiac crescent formation as well as first heart field markers were not affected, although cardiac looping and right ventricle formation were blocked. Expression of Isl1 and Bmp4 in second heart field progenitors was strongly reduced. In contrast, in gain-of-function mutation of beta-Catenin using MesP1-cre we revealed an expansion of Isl1 and Bmp4 expressing cells, although the heart tube was not formed. We conclude from these results that Wnt/beta-Catenin signaling regulates second heart field development, and that a precise amount and/or timing of Wnt/beta-Catenin signaling is required for proper heart tube formation and cardiac looping. In conclusion, we have shown that Bmp and canonical Wnt signaling have distinct roles during early cardiogenesis in mice.

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Cirka 300 000 individer drabbas årligen i världen av oral cancer och mer än nittio procent av alla orala cancerformer utgörs av skivepitelcancer. Den femåriga prognosen är generellt 50 % och den 5-åriga relativa överlevnaden har under en tioårsperiod förblivit densamma. Detta motiverar utvecklingen av bättre prognostiska markörer och diagnostiska metoder för att tidigt identifiera de patienter som har risk att utveckla oral skivepitelcancer för att förbättra prognosen och minska lidandet genom tidig insatt behandling. β-catenin är en adhesionsmolekyl som är viktig för bibehållandet av cellulär integration och avvikelser i celladhesionsmolekyler tros spela en central roll när tumörceller invaderar närliggande vävnad det vill säga metastaserar till andra organ.Syftet med studien är att med hjälp av immunohistokemi undersöka om β-catenin kan fungera som en prognostisk markör för utvecklingen av oral skivepitelcancer. Detta görs genom att jämföra förekomsten av β-catenin med hjälp av monoklonala antikroppar i normalt skivepitel, dysplasi och cancer från 18 patienter som har diagnostiserats med oral skivepitelcancer. Infärgningen av Beta catenin jämfördes i normalt oralt skivepitel med cancer och dysplasi för alla biopsier för att undersöka om det förekommer någon skillnad av infärgningen. Förutom detta skedde även en jämförelse av normalt skivepitel med dysplasi och cancer inom varje enskild biopsi.Resultaten visade att det finns en skillnad i uttrycket av β-catenin i normalt skivepitel jämfört med dysplasi och cancer i denna patientgrupp. I denna studie visade mer än 70 % av biopsierna en stark eller måttlig och stark infärgning av β-catenin i normalt skivepitel, mer än 60 % av biopsierna visade en måttlig eller måttlig och svag infärgning av dysplasi och 58,8 % av alla biopsier visade svag infärgning eller ingen och svag infärgning av skivepitelcancer. Då studien visar att mängden av β-catenin är starkast i normalt oralt skivepitel, måttligt i dysplasi och svagast i cancer tyder detta på att β-catenin skulle kunna vara en viktig faktor i utvecklingen av skivepitelcancer i munhålan vilket stämmer väl överens med resultat från andra studier. / Approximately 300,000 individuals are affected every year in the world of oral cancer and more than ninety percent of all oral cancers consists of squamous cell carcinoma. The five-year prognosis is generally 50 % and the 5-year relative survival has over ten years remained the same. This motivates the development of better prognostic markers and diagnostic methods for the early identification of patients at risk of developing oral squamous cell carcinoma to improve prognosis and reduce the suffering of these patients with early treatment.β-catenin is an adhesion molecule that is important for the maintenance of cellular integration and abnormalities of cell adhesion molecules is thought to play a central role in tumorigenesis. The abnormalites is though to enhance tumour cells to break loose from neighbouring cells and invade nearby tissues and organs, however the exact mechanisms are unknown. The purpose of the study is that using immunohistochemistry to examine whether β-catenin may serve as a prognostic marker for the development of oral squamous cell carcinoma. This is done by examining the presence of β-catenin with monoclonal antibodies in 18 biopsies with normal squamous epithelia, dysplasia and cancer from 18 patients diagnosed with oral squamous cell carcinoma from the department of Oral Pathology at Malmö Högskola, Malmö. The staining of beta catenin was compared in normal oral squamous cancer and dysplasia for all biopsies to see whether there is any difference of dyeing. Besides this, there was also a comparison of normal squamous epithelium with dysplasia and cancer in each biopsy.The results showed that there is a difference in the expression of β-catenin in normal squamous epithelium, dysplasia and cancer in this population. In this study, more than 70 % of the biopsies expressed a strong or moderate and strong staining of β -catenin in normal oral squamous epithelium, more than 60 % of the biopsies showed a moderate or moderate and weak staining of dysplasia and 58.8 % of all biopsies showed weak or no staining and weak staining of squamous cell carcinoma.As the study shows that the amount of β -catenin is strongest in normal oral squamous epithelium, moderate in dysplasia and weakest in cancer, this suggests that β -catenin could be an important factor in the development of squamous cell carcinoma of the oral cavity which is in line with results from other studies.

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This thesis provides evidence for the presence of multiple RNAs in the axons and growth cones of developing thalamic cells, particularly the mRNA for the cell adhesion and Wnt-signalling-related molecule b-catenin. After many decades of effort, mRNAs have been shown to be present in the axons of many different systems in recent years. Furthermore, these mRNAs have been shown to be locally translated at the growth cone, and this local translation is required for axons to turn in response to multiple guidance cues. As studies accumulate, it is becoming clear that different axonal systems contain different complements of mRNAs and have different requirements for local translation. One axonal system which has not been investigated to date is the thalamocortical tract. The nuclei of the thalamus are connected to the areas of the cortex via bundles of axons which travel from the thalamus to the cortex via the ventral telencephalon during embyronic development. These axons make a number of turns and are guided by many cues and other axonal tracts before innervating their cortical target. In this thesis, a quantitative real-time polymerase chain reaction (qRT-PCR) approach is developed to isolate multiple mRNAs from developing thalamic axons in vitro, including b-catenin mRNA, b-actin mRNA, 18S ribosomal RNA and ten other mRNAs. The method used should be suitable for use with other axonal systems and also for testing the effect of guidance cues on mRNA expression in axons. The qRT-PCR results for b-catenin, b-actin and 18S have been validated using in situ hybridisation. Analysis of in situ hybridisation results indicates that b-catenin and 18S, but not b-actin, are upregulated in the growth cone compared to the axon. As b-catenin has been shown to be involved in axon guidance via Slit and ephrin guidance cues in other axonal systems, and these guidance cues act upon thalamocortical axons, the identification of b-catenin mRNA in thalamic axons is an important step towards a full understanding of the thalamocortical system. The results presented here indicate that local protein synthesis is likely to occur in thalamic axons as it does in other axonal systems, and that local translation is likely to be important for thalamic axonal responses to guidance cues and other axonal tracts.