Les lésions tumorales cortico-surrénaliennes sont majoritairement des adénomes bénins et très rarement des carcinomes. Les altérations génétiques impliquées dans le développement des tumeurs cortico-surrénaliennes sporadiques, plus particulièrement au stade malin, demeurent à ce jour très peu connues. Lors de travaux récents menant à l’identification d’altérations génétiques de β-CATÉNINE nous avons constaté que plusieurs tumeurs présentaient une accumulation nucléo/cytoplasmique de la protéine β-CATÉNINE sans toutefois contenir de mutations pour ce gène. Nous avons donc émis l’hypothèse que, comme pour d’autres types de cancers, d’autres composants de la voie de signalisation Wnt/β-CATÉNINE, tel qu’AXIN2, pourrait être impliqués dans le développement des tumeurs du cortex surrénalien. De plus, plusieurs aberrations dans l’expression d’AXIN2 et de β-CATÉNINE sont associées à des tumeurs présentant de l’instabilité microsatellite dans d’autres types de cancer, notamment le cancer gastrique et colorectal. Nous avons donc étudié une cohorte de 30 adénomes, 6 carcinomes, 5 AIMAH, 3 hyperplasies ACTH-dépendante et 5 PPNAD ainsi que les lignées cellulaires de carcinomes cortico-surrénaliens humains H295R et SW13. Une étude préliminaire du statut MSI a également été réalisée sur 10 tumeurs contenant une mutation pour AXIN2 et/ou β-CATÉNINE. Nous avons trouvé des mutations d’AXIN2 dans 7% des adénomes (2/30) et 17% des carcinomes (1/6) cortico-surrénaliens. L’analyse fonctionnelle des mutations par immunohistochimie, analyse western blot et analyse de RT-PCR en temps réel a révélé une diminution de l’expression d’AXIN2 associée à cette mutation. L’analyse préliminaire MSI a démontré 1 échantillon AIMAH MSI-H, c’est-à-dire instable pour le locus BAT-25 et BAT-26 et 3 autres adénomes sécrétant de l’aldostérone instables seulement pour le locus BAT-26. Ainsi, ces travaux permirent d’identifier une nouvelle altération génétique associée au développement des tumeurs du cortex surrénalien en plus de rapporter pour la première fois la présence de MSI-H dans ce type de tumeurs. / Adrenocortical lesions are mostly benign tumors and rarely carcinomas. From now on, genetic alterations implicated in sporadic adrecocortical tumour development remains largely unknown. In our previous work leading to identification of genetic alterations in β-catenin, we observed that many tumors presented a nucleo/cytoplasmic accumulation of β-catenin protein without β-catenin mutations. Thus, we hypothesised that, as for many others cancers, others components of the Wnt/ β-catenin signalling pathway, as AXIN2, are implicated in development of adrenocortical tumors. Also, many aberrations in AXIN2 and β-catenin expression have been reported in association with microsatellite instability in other types of cancers like gastroinstestinal and colorectal cancer. We have studied 30 adenomas, 6 carcinomas, 5 AIMAH, 3 ACTH-dependant hyperplasias and 5 PPNAD as well as the human carcinoma cancer cells lines H295R and SW13. Preliminary study for MSI was also realised on 10 tumors harbouring AXIN2 and/or Β-CATENIN mutations. We have found AXIN2 mutations in 7% of adrenocortical adenomas (2/30) and 17% of adrenocortiocal carcinomas. Functional analysis of this mutation by immunohistochemical, western blot and real-time RT-PCR analysis revealed a down-regulation of AXIN2 expression associated with this mutation. Preliminary analysis of MSI results in 1 AIMAH sample MSI-H, which means instable for BAT-25 and BAT-26 locus, and 2 aldosterone adenomas were unstable for BAT-26 locus. This work identified a new genetic alteration involved in adrenocortical tumour development and report for the first time MSI-H in this type of tumor.

4 Abstract The Wnt pathway is one of the major signaling cascades contributing to multiple cellular processes during embryogenesis, and adult tissue homeostasis and regeneration. Moreover, aberrant activation of the Wnt signaling pathway is connected with development of neoplasia, notably colorectal cancer. The aim of the thesis was to identify new ways of the Wnt pathway regulation to understand better physiological as well as non-physiological mechanisms of Wnt signaling. The results are summarized in four publications. The first article deals with TROY, a member of tumor necrosis factor receptor family. We identified TROY as a Wnt target gene during our search for Wnt responsive genes in colorectal cancer cell lines. Additionally, we detected expression of Troy in tumors of two mouse models of intestinal cancer. In the healthy gut, Troy is produced in fast cycling intestinal stem cells where negatively regulates the Wnt pathway. The second study focuses on processing and posttranslational modification of murine Wnt1 and Wnt3a. Wnts are glycosylated and double acetylated by lipid adducts and our results revealed that O-linked acylation of serine is required for the subsequent S-palmitoylation of cysteine. Moreover, acylation of Wnts is connected with their signaling activity which is related to Wnt1 and...

Neoplasias malignas das glândulas salivares são lesões raras e o mecanismo pelo qual esses tumores progridem ainda não está completamente esclarecido na literatura. A galectina-3 é uma proteína multifuncional expressa em uma grande quantidade de tecidos normais, mas que também tem sido associada à progressão tumoral de neoplasias malignas da tireóide, próstata e neoplasias gástricas. Estudos prévios demonstraram que a galectina-3 está também expressa em algumas neoplasias malignas das glândulas salivares como carcinoma adenóide cístico e adenocarcinoma polimorfo de baixo grau de malignidade. Recentemente foi sugerido que a superexpressão da galectina-3 controla alterações nos níveis de expressão de alguns reguladores do ciclo celular, dentre eles a ciclina D1. Além disso, outros estudos revelaram que a ciclina D1 é ativada pela -catenina de uma maneira dependente da galectina-3. O objetivo desse trabalho foi comparar a marcação imunoistoquímica nuclear e / ou citoplasmática da galectina-3 no carcinoma adenóide cístico e adenocarcinoma polimorfo de baixo grau tentando relacioná-la à marcação da -catenina e ciclina D1. Foram realizadas reações de imunoistoquímica para as três proteínas em 15 casos de carcinoma adenóide cístico e em 15 casos de adenocarcinoma polimorfo de baixo grau utilizando-se material parafinado. Para a galectina-3 os carcinomas adenóides císticos apresentaram marcação imunoistoquímica apenas nas células luminais, predominantemente no núcleo. Todos os casos de adenocarcinoma polimorfo de baixo grau revelaram uma marcação predominantemente citoplasmática para essa proteína. Ambos os tumores exibiram intensa marcação citoplasmática e/ou nuclear para a -catenina na maioria dos casos. Não houve imunorreatividade para a ciclina D1 em 14/15 casos de adenocarcinoma polimorfo de baixo grau. Em contraste, os carcinomas adenóides císticos revelaram marcação nuclear específica para a ciclina D1 em 10 de 15 casos estudados em mais de 5% das células neoplásicas e essa marcação estava associada à marcação citoplasmática e nuclear da galectina-3 (p<0,05). Esses resultados sugerem que nos carcinomas adenóides císticos a expressão da galectina-3 pode exercer uma função de proliferação celular e parece estar relacionada à diferenciação celular no adenocarcinoma polimorfo de baixo grau. Além disso, a perda de expressão da galectina-3 no carcinoma adenóide cístico pode estar associada a um comportamento clínico mais agressivo dessa lesão. Embora a -catenina pareça exercer algum papel no mecanismo de carcinogênese dessas duas lesões, ela não parece se ligar à galectina-3 para ativar a ciclina D1. / Salivary gland tumors are uncommon and the mechanism by which malignant tumors progresses is still undefined. In a previous study it was shown that galectin-3 is expressed in malignant salivary gland neoplasms as adenoid cystic carcinoma and polymorphous low-grade adenocarcinoma. Galectin-3 is a multifunctional protein of a group of galactoside-binding lectins expressed in a variety of normal cells, but also has been implicated in tumor progression of some malignancies as thyroid, prostate and gastric cancers. Recently, it has been suggested that galectin-3 may be an important mediator of the -catenin/Wnt pathway. Moreover, nuclear galectin-3 expression has been implicated in cell proliferation, promoting cyclin D1 activation. Thus, in the present study we aimed to correlate galectin-3 expression, either nuclear or cytoplasmic, with the expression of -catenin (nuclear/cytoplasmic) and cyclin D1 (nuclear) in 15 cases of adenoid cystic carcinoma and in 15 cases of polymorphous low-grade adenocarcinoma. For galectin-3, adenoid cystic carcinomas showed specific staining only in luminal cells, mainly in the nuclei. In the cases of polymorphous low-grade adenocarcinoma, all tumor cells revealed a positive, mostly cytoplasmic, reaction to galectin-3. Both tumors showed intense cytoplasmic/nuclear staining for -catenin in the majority of cases. Cyclin D1 immunoreactivity was not detected in 14 of the 15 polymorphous low-grade adenocarcinomas studied. In contrast, adenoid cystic carcinomas showed specific nuclear staining for cyclin D1 in 10 of 15 cases studied in more than 5% of the neoplastic cells. Cyclin D1 expression was correlated with cytoplasmic and nuclear galectin-3 expression in adenoid cystic carcinomas (p<0,05). These results suggest that in adenoid cystic carcinoma galectin-3 may play a role in cellular proliferation through cyclin D1 activation. In polymorphous low-grade adenocarcinoma gal-3 expression seems to be associated with cellular differentiation. In addition, loss of cytoplasmic expression of galectin-3 in adenoid cystic carcinomas may be related to a more aggressive behavior of these lesions. Although -catenin seems to play a role in carcinogenesis, in both lesions, it seems that it does not bind to galectin-3 for cyclin D1 stimulation.

Introdução: A endometriose é uma doença ginecológica comum caracterizada pela presença de estroma e/ou glândula endometrial fora da cavidade uterina, e que não possui sua etiopatogenia bem estabelecida. A transição epitélio-mesênquima (TEM) é um processo que consiste em uma série de mudanças no fenótipo de células epiteliais que fazem com que estas células assumam características de células mesenquimais. Assim como observado na TEM, as células endometriais no contexto da endometriose apresentam capacidade migratória, invasibilidade e elevada resistência à apoptose. As moléculas de adesão têm adquirido crescente relevância na TEM, pois relacionam-se à perda de adesão célula-célula com o aumento da invasão e metástase. O objetivo deste estudo foi investigar a expressão de marcadores relacionados com a TEM na endometriose superficial, ovariana e profunda. Pacientes e Métodos: Foram selecionadas 103 mulheres que preenchiam os critérios de inclusão estabelecidos, constituindo 2 grupos de estudo independentes entre si: 18 mulheres com endometriose peritoneal, ovariana e profunda concomitantes; 85 mulheres com endometriose ovariana e/ou profunda, dividido em 44 mulheres com endometriose ovariana e 41 com endometriose intestinal. Através de reações de imunoistoquímica, a expressão proteica dos marcadores e-caderina, n-caderina, betacatenina, receptor de estrogênio e receptor de progesterona foram avaliados nos tecidos de interesse em cada grupo de estudo. Além dos locais de doença, as mulheres foram avaliadas quanto à relação com a fase do ciclo e à classificação histológica da doença. Resultados: As lesões de endometriose de ovário mostraram uma menor expressão de n-caderina em comparação às lesões de intestino e peritônio (p=0,032). O receptor de estrogênio e receptor de progesterona se mostraram significativamente menos expressos no componente epitelial da doença de ovário do que no epitélio da endometriose de peritônio e intestino (p=0,002; p=0,48). A expressão da n-caderina apresentou uma correlação direta com a expressão do receptor de estrogênio no estroma da endometriose de intestino (p=0,036). Conclusão: Estes resultados sugerem que a transição epitélio-mesênquima esteja envolvida na etiopatogenia da endometriose, demonstrando que a doença de ovário se comporta de maneira diferente da doença superficial e da doença infiltrativa profunda, sendo a n-caderina um importante fator envolvido neste processo possivelmente influenciada pela ação do estrogênio / Background: Endometriosis is a common gynecological disease defined as the presence of ectopic endometrial glands and stroma outside the uterine cavity, and its pathogenesis is not well established. The epithelial to mesenchymal transition (EMT) is a process consisting of a series of changes in the phenotype of epithelial cells that make these cells assume the characteristics of mesenchymal cells. As observed in the EMT, endometrial cells in the context of endometriosis have the capacity of migration, invasiveness and high resistance to apoptosis. . The adhesion molecules have become progressively relevant in EMT, in view of the cell-to-cell adhesion loss, with increased invasion and metastasis. The goal of this study was to investigate the expression of markers related to EMT in superficial, ovarian and deep endometriosis. Patients and Methods: 103 women were selected who met the inclusion criteria, constituting two independent study groups: 18 women with peritoneal, ovarian and deep concomitant endometriosis, 85 women with ovarian and / or deep endometriosis, divided in 44 women with ovarian endometriosis and 41 with intestinal endometriosis. Through immunohistochemical reactions, the protein expression of e-cadherin, ncadherin, beta-catenin, estrogen receptor and progesterone receptor markers were evaluated in tissues of interest in each study group. In addition to the sites of the disease, menstrual phase and histological classification (well-differentiated, undifferentiated, mixed pattern and stromal) of the disease were recorded. Results: The ovarian endometrisis showed less n-cadherin marker than lesions of the peritoneum and bowel (p=0,032). Ovarian endometriosis also showed markedly decreased expression of estrogen and progesterone receptors in epithelial cells, compared with peritoneal and deep endometriosis (p=0,002; p=0,48). The expression of N-cadherin showed a direct correlation with estrogen receptor expression in the stroma of bowel endometriosis (p = 0.036). Conclusion: These results suggest that epithelial to mesenchymal transition involved in the pathogenesis of endometriosis, demonstrating that the ovary disease behaves differently disease than peritoneal and deep disease, so that the n-cadherin is an important factor involved in this process, possibly influenced by the action of estrogen

Les carcinomes de la cortico-surrénale (CCS) sont des tumeurs de mauvais pronostic et les thérapies sont encore limitées. La chirurgie reste à ce jour le seul traitement efficace. La compréhension des mécanismes de la tumorigenèse cortico-surrénalienne et l'identification des gènes et des voies de signalisation impliquées sont nécessaires pour identifier de nouvelles cibles thérapeutiques. Ces dernières années, plusieurs études de génomique ont été réalisées sur des cohortes indépendantes de CCS et ont mis en évidence l'existence de deux groupes de CCS ayant des profils d’expression génique particuliers et associés à des pronostics de survie différents. Il a aussi été identifié de fréquentes mutations touchant les gènes TP53 et CTNNB1 (β-caténine). De plus, l'activation aberrante de la voie WNT/β-caténine est associée au groupe des CCS agressifs. Enfin, des analyses des altérations génomiques par puce SNP et le séquençage de l’exome de cohortes de CCS a permis de préciser les fréquences des mutations de TP53 (~18%) et CTNNB1 (~14%) mais a aussi mis en évidence des mutations et des délétions homozygotes au niveau du gène ZNRF3 (Zinc And Ring Finger 3) dans environs 20% des CCS. ZNRF3 a été montré comme jouant un rôle de régulateur négatif de la voie WNT/β-caténine. Par conséquent, la voie de signalisation WNT/β-caténine est la voie la plus fréquemment altérée dans les CCS (~40%). L’objectif de mon projet était d’étudier comment l’activation constitutive de la voie WNT/β-caténine pouvait participer à la tumorigenèse cortico-surrénalienne, puis d'essayer de comprendre plus spécifiquement le rôle des altérations de ZNRF3 dans le développement et/ou l'agressivité des CCS. En combinant des analyses de transcriptomes de modèles cellulaires et de cohortes de CCS, nous avons établi une signature robuste cortico-surrénalienne de l'activation de la voie WNT/β-caténine. Parmi les gènes de cette signature, nous avons montré que AFF3 était une cible transcriptionnelle de la β-caténine et qu'il était capable de transmettre en partie les effets oncogèniques de la voie WNT/β-caténine dans les cellules cortico-surrénaliennes. En effet, son invalidation entraîne l'apoptose et diminue la prolifération des cellules cortico-surrénaliennes à l'image de l'invalidation de la β-caténine. La surexpression d’AFF3 altère l’organisation des speckles nucléaires et la localisation de CDK9/CyclinT1 impliqués respectivement dans l'épissage des ARNm et la transcription des gènes. ZNRF3 est le gène le plus fréquemment altéré dans les CCS alors qu'il l'est très peu dans les autres types de cancers. ZNRF3 est une E3 ubiquitin ligase qui entraîne l'internalisation et la dégradation des récepteurs Frizzleds de la voie WNT. Nous avons montré que ZNRF3 agit bien comme un gène suppresseur de tumeur dans les cellules cortico-surénaliennes humaines H295R. En effet la surexpression de ZNRF3 diminue la prolifération et augmente l’apoptose cellulaire de ces cellules. Nous avons aussi montré qu'à l'image d'autres régulateurs négatifs de la voie WNT comme AXIN2, ZNRF3 est un gène cible de la voie WNT/β-caténine dans la corticosurrénale. De manière intéressante, les altérations du gène ZNRF3 ne sont pas retrouvées dans des tumeurs présentant une forte activation de la voie de signalisation WNT/β-caténine, suggérant l'implication d'autres voies de signalisation. Nous avons identifié des partenaires protéiques de ZNRF3 par des expériences d'immunoprécipitation / spectrométrie de masse. Nous avons montré que ZNRF3 interagit avec la sous unité catalytique de la pompe NA+/K+, ATP1A1. Cette interaction altère le fonctionnement de la pompe NA+/K+ conduisant à des modifications du flux de Ca2+ intracellulaire. L'ensemble de ces travaux a permis de mieux comprendre comment la voie WNT/β-caténine participe à l'agressivité des cancers de la corticosurrénale et de montrer qu'AFF3 est essentiel pour les effets oncogéniques de cette voie. (...) / Adrenocortical carcinomas are rare tumors with poor prognostic and limited therapy. Up to now, surgery remains the only curative therapy. A better understanding of tumor biology and molecular prognostic factors would help to select relevant therapeutic targets and to develop innovative therapeutic strategies. In the last years, different genomic studies on independent cohorts of ACC have identified two subgroups of cancers with two distinguished profiles of genes expression and two different survival rates. Frequents alterations of CTNNB1 and TP53 are identified in ACC. Moreover, aberrant activation of WNT/β-catenin pathway in ACC is associated with lower overall survival. Using a combination of genomic approaches, we and others have recently analyzed independent cohorts of ACC. These works confirmed recurrent alterations in CTNNB1 (~14%) and TP53 (~18%), but also revealed new loci not previously reported to be altered in ACC. Strikingly, ZNRF3 (zinc and ring finger 3) was the most frequently altered gene (~20%). ZNRF3 encodes a protein that acts as a negative regulator of Wnt/β-catenin pathway. The Wnt/β-catenin pathway represents the most frequently altered pathway in ACC (~40%). The aim of my project was to study how the aberrant activation of WNT/β-catenin pathway could participate to adrenal tumorigenesis and then to identify more specifically the role of ZNRF3 alterations in development/aggressiness of ACC. By a combination of transcriptomic analysis on two cohorts of ACC and on H295R adrenocortical cells, we identified a list of genes whose expression is correlated to the WNT/β-catenin activation. Among these genes, we show that AFF3 is essential to mediate the effect of activation the WNT/β-catenin pathway in adrenocortical cancer. Indeed, AFF3 is a direct target gene of β-catenin and its silencing in H295R adrenocortical cells induces a decreased cell proliferation and an increased apoptosis similar to that induced by β-catenin silencing. Moreover, AFF3 overexpression altered the structure of nuclear speckles and the localization of CDK9/CyclinT1, which are respectively involved in mRNA splicing and transcription. ZNRF3 (zinc and ring finger 3) was the most frequently altered gene (20%) in ACC. ZNRF3 had never been frequently associated with other tumour types. ZNRF3 encodes a protein that had been described as cell-surface transmembrane E3 ubiquitin ligases, acting as negative regulators of Wnt/β-catenin signaling, by promoting the degradation of Wnt ligand receptors (Frizzled receptors). We show that ZNRF3 act as a tumor suppressor gene in adrenocortical cell line H295R. Indeed the overexpression of ZNRF3 decreases cell proliferation and increases apoptosis. We demonstrate also that ZNRF3 is a target gene of WNT/β-catenin pathway. ZNRF3 alterations have less effect on expression of WNT/β-catenin target genes than CTNNB1 mutations in ACC. Moreover, our results with ZNRF3 overexpression in H295R adrenocortical cells suggest that ZNRF3 is also involved in βcatenin independant-pathway(s) to mediate its effects on apoptosis. Using mass spectrometry analysis, we identified that ZNRF3 interacts with ATP1A1 (ATPase Na+/K+ Transporting Subunit Alpha 1), affecting the activity of the Na+/K+ ATPase pump in adrenocortical cells. These results provide a better understanding of the biological process of WNT/βcatenin pathway activation in ACC with AFF3 as new target of this pathway. Moreover, our data provide insight into the tumor suppressor role of ZNRF3 in ACC and uncovers an additional role of ZNRF3 on Na+/K+ ATPase pump activity.

Introdução: Em crianças das regiões Sul e Sudeste do Brasil há uma incidência elevada de tumores adrenocorticais (TAC). Anormalidades da ?-catenina tem sido encontradas em TAC em adultos e sugerem a ativação da via Wnt/ -catenina nestes tumores. No entanto, não há estudos avaliando o papel desta via em casuísticas de TAC pediátricos. Objetivos: Avaliar o papel da via Wnt/catenina e mutações do gene CTNNB1 na tumorigênese adrenocortical pediátrica. Indivíduos, Material e Métodos: Foram avaliados 62 pacientes pediátricos com TAC oriundos de dois centros de referência. Controles: córtex adrenal de indivíduos jovens com morte acidental. Avaliou-se a presença de mutação nos genes TP53 e CTNNB1. A expressão de genes da via Wnt (CTNNB1, o ligante WNT4, os inibidores SFRP1, DKK3 e AXIN1, o fator de transcrição TCF7 e os genes-alvo MYC e WISP2) foi avaliada por qPCR, utilizando-se o método de 2-Ct. Adicionalmente, a expressão de proteínas da via Wnt/-catenina e P53 foi avaliada por imunoistoquímica. Avaliou-se a relação entre possíveis anormalidades moleculares com o fenótipo clínico e o desfecho. Resultados: A sobrevida geral foi maior em pacientes menores que 5 anos de idade (p<0.0001) e em pacientes com estágios tumorais menos avançados (p<0.0001). A mutação P53 p.R337H foi encontrada em 87% dos pacientes e não se associou com características clinicopatológicas ou desfecho. Mutações do gene CTNNB1 foram encontradas em 4/62 (6%) TAC, todos carreadores da mutação P53 p.R337H. Houve associação entre óbito e presença de mutações do gene CTNNB1 (p=0,02). Acúmulo difuso da -catenina foi observado em 71% dos TAC, a maioria sem mutações do CTNNB1. Comparados a adrenais normais, os TAC apresentaram aumento da expressão do RNAm de CTNNB1 (p=0.008) e diminuição da expressão de genes inibidores da via Wnt: DKK3 (p<0.0001), SFRP1 (p=0.05) e AXIN1 (p=0.04). Com relação aos genes-alvo da via Wnt/-catenina, TAC apresentaram expressão aumentada de WISP2 e baixa expressão de MYC. Maior sobrevida geral foi associada à expressão baixa de SFRP1 (p=0.01), WNT4 (p=0.004) e TCF7 (p<0.01). Conclusões: Em TAC pediátricos, mutações somáticas ativadoras do gene CTNNB1 são pouco freqüentes e parecem estar associadas à maior ocorrência de óbito. Mesmo na ausência de mutações do gene CTNNB1, estes tumores apresentaram acúmulo de -catenina e do gene-alvo WISP2 e expressão reduzida de inibidores da via Wnt (DKK3, SFRP1 e AXIN1). Estes dados demonstram evidências de anormalidades na via Wnt/-catenina em TAC pediátricos, mesmo na ausência de mutações do gene CTNNB1. É provável que outros eventos genéticos afetando a via Wnt/-catenina estejam envolvidos na tumorigênese adrenocortical pediátrica / Context: CTNNB1 mutations and activation of Wnt/-catenin pathway are frequent in adult adrenocortical tumors (ACTs) but data on childhood ACTs are lacking. Objective: To investigate Wnt/-catenin pathway abnormalities and CTNNB1 mutations in childhood ACTs. Patients and Methods: Clinicopathological findings and outcome of 62 childhood ACTs patients were analyzed regarding to CTNNB1/ -catenin mutations and to the expression of Wnt-related genes (CTNNB1, a Wnt ligand: WNT4, Wnt inhibitors: SFRP1, DKK3 and AXIN1, a transcription factor: TCF7, and target genes: MYC and WISP2) by qPCR and immunohistochemistry. Results: Overall survival (OS) was higher in patients younger than 5 years (p<0.0001) and associated with less advanced tumoral stage (p<0.0001). The p.R337H P53 mutation, found in 87% of the patients, was not associated with clinicopathological findings or outcome. CTNNB1 activating mutations were found in only 4/62 ACTs (6%), all of them harboring TP53 mutation. There was association between the presence of CTNNB1 mutation and death (p=0.02). Diffuse -catenin accumulation was found in 71% of ACTs, most of them without CTNNB1 mutation. CTNNB1 mutated ACTs presented weak/moderate -catenin accumulation. Compared to normal adrenals, ACTs presented increased expression of CTNNB1 (p=0.008) and underexpression of Wnt inhibitor genes: DKK3 (p<0.0001), SFRP1 (p=0.05) and AXIN1 (p=0.04). With regards to Wnt/-catenin target genes, ACTs presented lower expression of MYC but increased expression of WISP2. Higher overall survival was associated with underexpression of SFRP1 (p=0.01), WNT4 (p=0.004) and TCF7 (p<0.01). Conclusions: In childhood ACTs, CTNNB1 mutations are rare and appear to be associated with poor prognosis. Regardless of CTNNB1 mutations, these tumors presented reduced expression of Wnt inhibitor genes (DKK3, SFRP1 and AXIN1) and increased expression of CTNNB1 and a target gene, WISP2. Thus, besides CTNNB1 mutations, additional genetic events affecting the Wnt/-catenin pathway may be involved in childhood adrenocortical tumorigenesis.

Meduloblastoma é um tumor embrionário maligno e invasivo do cerebelo, com manifestação preferencial em crianças, sendo predominantemente de diferenciação neuronal e tendência natural a metastatização por via liquórica. O gene da b-catenina (CTNNB1) está localizado no cromossomo 3p22-p21-3, sendo seu produto uma proteína citoplasmática de 92 kDa, envolvida na adesão celular e na transdução de sinal durante a embriogênese e morfogênese tecidual. A fosforilação da b-catenina é necessária para sua degradação, evitando a associação com o fator de transcrição Tcf (fator de célula T), responsável pela ativação de genes, cujos produtos promovem a proliferação celular. Estudos têm demonstrado a presença da b-catenina no núcleo das células de tumorais, um achado inesperado, pois, tratando-se de uma proteína envolvida na adesão celular, sua expressão seria esperada na membrana celular. Subseqüentemente foram descritas mutações no exon 3 do gene da b-catenina, envolvendo sítios de fosforilação. Este estudo teve como objetivo analisar em meduloblastomas: mutações no gene CTNNB1, o acúmulo da proteína b-catenina, bem como correlacionar ambos os achados entre si e com o tipo histológico e analisar os níveis de expressão relativa de genes envolvidos na via WNT (CTNNB1, AXIN1, WNT1 e APC) e correlaciona-los com o tipo histológico, idade e dados de mutação de CTNNB1 e acúmulo de b-catenina. As amostras de DNA foram extraídas de 67 casos de meduloblastomas. A análise de alterações no exon 3 de CTNNB1 foi realizada pela reação em cadeia da polimerase (PCR) e seqüenciamento direto. A expressão da b-catenina foi analisada pela técnica de imunohistoquímica (IHQ). As análises de expressão relativa de CTNNB1, AXIN1, WNT1 e APC foram realizadas pelo método de PCR quantitativo em tempo real (RQ-PCR) em 31 amostras de meduloblastomas. A freqüência de mutações do exon 3 de CTNBB1 foi de 15%. Foram identificadas 6 mutações missense e em heterozigose em 10 casos: troca de G por A (Asp32Asn) em um caso, troca de C por A (Ser34Tir) em quatro casos, troca de C por G (Ser33Cis) em dois casos, troca G por A (Gli34Arg) em um caso, troca de G por T (Gli34Glu) em um caso e troca de C por A (Ser37Tir) em um caso. Foi observada uma imunorreatividade de ß-catenina no núcleo em 36,4% dos casos analisados. No citoplasma, a ß-catenina estava presente em todos os casos. Não houve correlação entre o tipo histológico e os dados qualitativos e semi-quantitativos de IHQ. Também não houve correlação entre o tipo histológico com os achados de mutações. Não foi observada diferença nos níveis de expressão dos genes CTNNB1, AXIN1 e APC nos meduloblastomas em relação ao tecidos cerebelares não tumorais. Na análise de expressão relativa e a classificação histológica, apenas APC apresentou diferença entre o tipo clássico com o desmoplásico. Não houve diferença dos níveis de expressão relativa em nenhum dos genes com relação à idade do paciente. A presença de mutações de CTNNB1 não afetou a expressão relativa de CTNNB1 e APC. Por outro lado, AXIN1 apresentou uma maior expressão relativa nos casos com mutação. APC apresentou uma menor expressão quanto maior o acúmulo de b-catenina no núcleo. Os dados indicam que outras proteínas da via WNT podem estar envolvidas no acúmulo de b-catenina nas células de meduloblastomas, além do envolvimento de outras diferentes vias. / Medulloblastoma is a malignant invasive embryonal tumor of the cerebellum with a preferential manifestation in children, being predominantly with neuronal differentiation, and a natural tendency to metastasize through spinal fluid pathways. b-catenin gene (CTNNB1) is localized at chromosome 3p22-p21.3 and codifies a cytoplasmatic protein of 92 kDa, involved in cellular adhesion and signal transduction during embriogenesis and tissue morphogenesis. b-catenin phosphorylation is necessary for its degradation, avoiding association with Tcf (T cell factor), responsible for activation of some genes, whose products promote cellular proliferation. Studies have demonstrated the presence of b-catenin in the nucleus of tumoral cells, an unexpected finding because it is a protein involved in cellular adhesion and its normal localization is at the cellular membrane. Subsequentially, mutations in the phosphorylation sites, localized at the exon 3 of b-catenin gene, have been described. The aims of this study were to analyze in medulloblastomas: CTNNB1 gene mutations, the protein b-catenin accumulation, as well as to correlate both findings between them and with the histological type and to analyze the relative expression levels of genes involved in the WNT pathway (CTNNB1, AXIN1, WNT1 and APC). DNA samples were extracted from 67 cases of medulloblastoma. Alterations of CTNNB1 exon 3 were analyzed by polymerase chain reaction (PCR) and direct sequencing. The expression of the protein b-catenin was assessed by immunohistochemistry (IHC). The relative expression analyses of CTNNB1, AXIN1, WNT1 and APC were determined by quantitative real time PCR (RQ-PCR) in 31 medulloblastoma samples. The frequency of CTNBB1 exon 3 mutations in the CTNNB1 was 15%. We identified six missense heterozygous mutations in ten cases: a G to A change (Asp32Asn) in one case, a C to A change (Ser34Tyr) in four cases, a C to G change (Ser33Cys) in two cases, a G to A change (Gly34Arg) in one case and a G to T change (Gly34Glu) in one case and a C to A change (Ser37Tyr) in one case. It was observed b-catenin immunoreactivity in the nucleus in 36.4% of all cases analyzed. In the cytoplasm, the ß-catenin was present in all the cases. No correlation between histological type and IHQ qualitative and semi-quantitative. Also, there was no correlation between histological type and mutations. No difference in the expression levels of the genes CTNNB1, AXIN1 and APC were observed in medulloblastomas in relation to normal cerebellum samples by QT-PCR analysis. In the analysis of relative expression and the histological classification, only APC presented significant difference between classic and desmoplastic type. There was no difference of the relative expression levels of any gene with the patient?s age. The presence of CTNNB1 mutations did not affect the relative expression of CTNNB1 and APC. On the other hand, AXIN1 presented a higher relative expression in the cases with mutation. APC expression level was lower when b-catenin nuclear accumulation was higher. Our data indicate that other proteins of WNT pathway can be involved in b-catenin accumulation in medulloblastoma cells, as well as the involvement of other different pathways.

O carcinoma ex-adenoma pleomórifoco (CXAP) é a contraparte maligna do Adenoma pleomórfico (AP), sendo sua malignização descrita em 10% dos AP. Histológicamente o CXAP apresenta grande variação morfológica vista a capacidade do componente maligno se originar de diferentes estruturas do componente misto do AP. Nota-se que grande parte dos CXAP apresentam caráter infiltrativo, metástase linfonodal e metástase tardia. Para que as células neoplásicas adquiram um fenótipo com maior capacidade infiltrava é necessário que passem por um processo de transição de um fenótipo epitelial para mesenquimal. Este processo é conhecido como Transição epitélio-mesênquima (TEM). Tal processo é visto em situações fisiológicas, tais quais, migração de células ectodérmicas durante o período embriológico, reparação e cicatrização e também em processos neoplásicos. O objetivo deste trabalho é avaliar a presença de proteínas inerentes ao processo de transição epitélio mesênquima e comparar a expressão destas proteínas com achados histopatológicos sugestivos de invasão e mestástase. A análise das proteínas E-caderina e Beta-catenina em células neoplásicas de CXAP foi realizada de forma semi-quantitativa conforme sugerido pela literatura. Os casos foram subdividos de acordo com a positividade da reação de imunohistoquímica. Onde houve ausência de células positivas o caso recebeu escore 0, casos onde houve <10% de células positivas o escore foi 1, casos onde 10- 75% de células positivas escore 2 e consequentemente 3 para casos em que >75% das células eram positivas. Tais achados foram relacionados com presença de invasão angiolinfática, perineural, metástase tardia, recorrência e metástase linfonodal. De um total de 16 casos de CXAP, o sitio mais acometido foi a parótida e 53% da nossa amostra era composta por homens, a idade média foi de 52,9 anos e a parótida foi o sitio mais acometido. A análise histopatológica demonstrou que quando havia marcação para E-caderina a mesma se dava em membrana celular. 12,5% ausência de marcação, 50% dos casos com marcação fraca 31,25% dos casos com expressão moderada e 6,25% dos casos com marcação intensa. Já para Beta-catenina um caso apresentou marcação citoplasmática e os restantes em membrana celular.18,75% ausente de marcação, 25 % com marcação fraca, 50% dos casos com marcação moderada e 6,25 dos casos com marcação intensa. A imuno-marcação estava distribuída de forma difusa tanto no front de invasão quanto no parênquima do carcinoma. Casos com maior presença de E-caderina apresentaram mais metástases linfonodais, p=0,035. Para outros critérios de invasão nenhuma relação estatística significante foi observada. Sugere-se que E-caderina e Beta-catenina não fazem parte do processo de invasão e metástase de CXAP nem são fatores relacionados a invasão dos tecidos adjacentes. / Carcinoma ex-pleomorphic adenoma (CXAP) is the malignant counterpart of pleomorphic adenoma(PA), although malignant transformation of PA is unusual occurring in 10% of the PA cases. The CXAP histologically presents an intense morphologic variation due to the ability of the malignant tissue to originate from any structure of de mixed component. A significant number of CXAPs show an infiltrative behavior, lymph node metastasis and late metastasis. The cell component must undergo a morphologic alteration changing the epithelial phenotype to a mesenchymal one. That development process is known as epithelial-mesenchymal transiction (MET). This process is seen in physiologic situations, like cell migration on embryologic ectodermal evolution, tissue repair and int neoplastic processes. The main objective of this study was to evaluate immunohistochemical expression of epithelial-mesenchymal transiction proteins, e-caderin and beta-catenin in malignant areas of CXAP and correlate with pathologic parameters that indicates migration, like perineural and angiolymphatic invasion and metastasis as suggested by the literature. Immunohistochemical analysis was performed semiquantitatively according to the scores 0 (no positive cell), 1 (<10% positive cells), 2 (10-75% of cells positive, and 3 (>75% positive cells). These results were also correlated with pathological parameters of neoplastic aggressiveness using the Fisher\'s exact test. Of the16 cases, the parotid gland was the most involved site and men were affected in 53.8 % of our sample. The mean age was 52.9 year. The histopathological analysis showed that in all cases in which e-caderin was positive, the immunoreaction was of the cell membrane 12,5% of the cases showed absent of e-caderin expression, 50% showed weak expression, 31,25% showed moderate expression and 6,25 show strong one. In the other hand, b-catenin showed cytoplasmic expression in one case, all other cases showed protein in cell membrane. 18,75 showed absent expression, 25% showed weak expression, 50% showed moderate and 6,25% showed intense one. The immunohistochemical reaction was diffuse and presented itself in invasion front as well as in the carcinoma parenchyma. Cases presenting high expression of e-caderin developed more lymph node metastasis, p=0,035. For the others invasion parameters there was no statistic summary observed. This work suggest that e-caderin and b-catenin have no relation to CXAP carcinogenesis or invasion process

Introdução: Em crianças das regiões Sul e Sudeste do Brasil há uma incidência elevada de tumores adrenocorticais (TAC). Anormalidades da ?-catenina tem sido encontradas em TAC em adultos e sugerem a ativação da via Wnt/ -catenina nestes tumores. No entanto, não há estudos avaliando o papel desta via em casuísticas de TAC pediátricos. Objetivos: Avaliar o papel da via Wnt/catenina e mutações do gene CTNNB1 na tumorigênese adrenocortical pediátrica. Indivíduos, Material e Métodos: Foram avaliados 62 pacientes pediátricos com TAC oriundos de dois centros de referência. Controles: córtex adrenal de indivíduos jovens com morte acidental. Avaliou-se a presença de mutação nos genes TP53 e CTNNB1. A expressão de genes da via Wnt (CTNNB1, o ligante WNT4, os inibidores SFRP1, DKK3 e AXIN1, o fator de transcrição TCF7 e os genes-alvo MYC e WISP2) foi avaliada por qPCR, utilizando-se o método de 2-Ct. Adicionalmente, a expressão de proteínas da via Wnt/-catenina e P53 foi avaliada por imunoistoquímica. Avaliou-se a relação entre possíveis anormalidades moleculares com o fenótipo clínico e o desfecho. Resultados: A sobrevida geral foi maior em pacientes menores que 5 anos de idade (p<0.0001) e em pacientes com estágios tumorais menos avançados (p<0.0001). A mutação P53 p.R337H foi encontrada em 87% dos pacientes e não se associou com características clinicopatológicas ou desfecho. Mutações do gene CTNNB1 foram encontradas em 4/62 (6%) TAC, todos carreadores da mutação P53 p.R337H. Houve associação entre óbito e presença de mutações do gene CTNNB1 (p=0,02). Acúmulo difuso da -catenina foi observado em 71% dos TAC, a maioria sem mutações do CTNNB1. Comparados a adrenais normais, os TAC apresentaram aumento da expressão do RNAm de CTNNB1 (p=0.008) e diminuição da expressão de genes inibidores da via Wnt: DKK3 (p<0.0001), SFRP1 (p=0.05) e AXIN1 (p=0.04). Com relação aos genes-alvo da via Wnt/-catenina, TAC apresentaram expressão aumentada de WISP2 e baixa expressão de MYC. Maior sobrevida geral foi associada à expressão baixa de SFRP1 (p=0.01), WNT4 (p=0.004) e TCF7 (p<0.01). Conclusões: Em TAC pediátricos, mutações somáticas ativadoras do gene CTNNB1 são pouco freqüentes e parecem estar associadas à maior ocorrência de óbito. Mesmo na ausência de mutações do gene CTNNB1, estes tumores apresentaram acúmulo de -catenina e do gene-alvo WISP2 e expressão reduzida de inibidores da via Wnt (DKK3, SFRP1 e AXIN1). Estes dados demonstram evidências de anormalidades na via Wnt/-catenina em TAC pediátricos, mesmo na ausência de mutações do gene CTNNB1. É provável que outros eventos genéticos afetando a via Wnt/-catenina estejam envolvidos na tumorigênese adrenocortical pediátrica / Context: CTNNB1 mutations and activation of Wnt/-catenin pathway are frequent in adult adrenocortical tumors (ACTs) but data on childhood ACTs are lacking. Objective: To investigate Wnt/-catenin pathway abnormalities and CTNNB1 mutations in childhood ACTs. Patients and Methods: Clinicopathological findings and outcome of 62 childhood ACTs patients were analyzed regarding to CTNNB1/ -catenin mutations and to the expression of Wnt-related genes (CTNNB1, a Wnt ligand: WNT4, Wnt inhibitors: SFRP1, DKK3 and AXIN1, a transcription factor: TCF7, and target genes: MYC and WISP2) by qPCR and immunohistochemistry. Results: Overall survival (OS) was higher in patients younger than 5 years (p<0.0001) and associated with less advanced tumoral stage (p<0.0001). The p.R337H P53 mutation, found in 87% of the patients, was not associated with clinicopathological findings or outcome. CTNNB1 activating mutations were found in only 4/62 ACTs (6%), all of them harboring TP53 mutation. There was association between the presence of CTNNB1 mutation and death (p=0.02). Diffuse -catenin accumulation was found in 71% of ACTs, most of them without CTNNB1 mutation. CTNNB1 mutated ACTs presented weak/moderate -catenin accumulation. Compared to normal adrenals, ACTs presented increased expression of CTNNB1 (p=0.008) and underexpression of Wnt inhibitor genes: DKK3 (p<0.0001), SFRP1 (p=0.05) and AXIN1 (p=0.04). With regards to Wnt/-catenin target genes, ACTs presented lower expression of MYC but increased expression of WISP2. Higher overall survival was associated with underexpression of SFRP1 (p=0.01), WNT4 (p=0.004) and TCF7 (p<0.01). Conclusions: In childhood ACTs, CTNNB1 mutations are rare and appear to be associated with poor prognosis. Regardless of CTNNB1 mutations, these tumors presented reduced expression of Wnt inhibitor genes (DKK3, SFRP1 and AXIN1) and increased expression of CTNNB1 and a target gene, WISP2. Thus, besides CTNNB1 mutations, additional genetic events affecting the Wnt/-catenin pathway may be involved in childhood adrenocortical tumorigenesis.

Introdução: A endometriose é uma doença ginecológica comum caracterizada pela presença de estroma e/ou glândula endometrial fora da cavidade uterina, e que não possui sua etiopatogenia bem estabelecida. A transição epitélio-mesênquima (TEM) é um processo que consiste em uma série de mudanças no fenótipo de células epiteliais que fazem com que estas células assumam características de células mesenquimais. Assim como observado na TEM, as células endometriais no contexto da endometriose apresentam capacidade migratória, invasibilidade e elevada resistência à apoptose. As moléculas de adesão têm adquirido crescente relevância na TEM, pois relacionam-se à perda de adesão célula-célula com o aumento da invasão e metástase. O objetivo deste estudo foi investigar a expressão de marcadores relacionados com a TEM na endometriose superficial, ovariana e profunda. Pacientes e Métodos: Foram selecionadas 103 mulheres que preenchiam os critérios de inclusão estabelecidos, constituindo 2 grupos de estudo independentes entre si: 18 mulheres com endometriose peritoneal, ovariana e profunda concomitantes; 85 mulheres com endometriose ovariana e/ou profunda, dividido em 44 mulheres com endometriose ovariana e 41 com endometriose intestinal. Através de reações de imunoistoquímica, a expressão proteica dos marcadores e-caderina, n-caderina, betacatenina, receptor de estrogênio e receptor de progesterona foram avaliados nos tecidos de interesse em cada grupo de estudo. Além dos locais de doença, as mulheres foram avaliadas quanto à relação com a fase do ciclo e à classificação histológica da doença. Resultados: As lesões de endometriose de ovário mostraram uma menor expressão de n-caderina em comparação às lesões de intestino e peritônio (p=0,032). O receptor de estrogênio e receptor de progesterona se mostraram significativamente menos expressos no componente epitelial da doença de ovário do que no epitélio da endometriose de peritônio e intestino (p=0,002; p=0,48). A expressão da n-caderina apresentou uma correlação direta com a expressão do receptor de estrogênio no estroma da endometriose de intestino (p=0,036). Conclusão: Estes resultados sugerem que a transição epitélio-mesênquima esteja envolvida na etiopatogenia da endometriose, demonstrando que a doença de ovário se comporta de maneira diferente da doença superficial e da doença infiltrativa profunda, sendo a n-caderina um importante fator envolvido neste processo possivelmente influenciada pela ação do estrogênio / Background: Endometriosis is a common gynecological disease defined as the presence of ectopic endometrial glands and stroma outside the uterine cavity, and its pathogenesis is not well established. The epithelial to mesenchymal transition (EMT) is a process consisting of a series of changes in the phenotype of epithelial cells that make these cells assume the characteristics of mesenchymal cells. As observed in the EMT, endometrial cells in the context of endometriosis have the capacity of migration, invasiveness and high resistance to apoptosis. . The adhesion molecules have become progressively relevant in EMT, in view of the cell-to-cell adhesion loss, with increased invasion and metastasis. The goal of this study was to investigate the expression of markers related to EMT in superficial, ovarian and deep endometriosis. Patients and Methods: 103 women were selected who met the inclusion criteria, constituting two independent study groups: 18 women with peritoneal, ovarian and deep concomitant endometriosis, 85 women with ovarian and / or deep endometriosis, divided in 44 women with ovarian endometriosis and 41 with intestinal endometriosis. Through immunohistochemical reactions, the protein expression of e-cadherin, ncadherin, beta-catenin, estrogen receptor and progesterone receptor markers were evaluated in tissues of interest in each study group. In addition to the sites of the disease, menstrual phase and histological classification (well-differentiated, undifferentiated, mixed pattern and stromal) of the disease were recorded. Results: The ovarian endometrisis showed less n-cadherin marker than lesions of the peritoneum and bowel (p=0,032). Ovarian endometriosis also showed markedly decreased expression of estrogen and progesterone receptors in epithelial cells, compared with peritoneal and deep endometriosis (p=0,002; p=0,48). The expression of N-cadherin showed a direct correlation with estrogen receptor expression in the stroma of bowel endometriosis (p = 0.036). Conclusion: These results suggest that epithelial to mesenchymal transition involved in the pathogenesis of endometriosis, demonstrating that the ovary disease behaves differently disease than peritoneal and deep disease, so that the n-cadherin is an important factor involved in this process, possibly influenced by the action of estrogen