Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Erythropoietin is a sialoglycoprotein which promotes the increase of erythropoiesis. Clinically is used for the treatment of anaemia associated to chronic renal failure. Identification and separation of isoforms of recombinant human erythropoietin (rhEPO) in biopharmaceuticals of different origins, was carried out by isoelectric focusing (IEF) western blotting and, also by lectin binding with Triticum vulgaris, showing 4-7 isoforms distributed in the isoeletric range of 4.4 to 5.2. N-acetylneuraminic acid content was quantified by reversed-phase liquid chromatography method with fluorescence detection giving values higher than 108.74 ηg/μg. Biological activity was evaluated by the normocythaemic mice bioassay, and investigating the TF-1 cell line in vitro. The correlation of the results of both of the methods were significant, as calculated by the Pearson s coefficient (r = 0.9967). In addition, the content/potency of the biopharmaceutical products was assessed by validated reversed phase and size exclusion liquid chromatography methods, showing mean values 2.11% and 1.21% lower, respectively, related to the in vivo bioassay. Sample was degraded under UV light to generate deamidate/sulphoxide forms and treatment at 65ºC for 12 hours to produce dimeric and aggregated forms. The potencies were evaluated by the normocythaemic mice assay and the TF-1 cell culture assay giving mean reduction of 14.05% and 32.87%, respectively, related to the intact molecule. The alternative in vitro assay investigated in the context of the reduction or replacement of the animals, and the evaluation of the correlations between physicochemical and biological methods, represent improvements which can be applied to the production steps and for the quality control of rhEPO, contributing to ensure the batch-to-batch consistency of bulk and finished biological products. / A eritropoietina é uma sialoglicoproteína que promove o aumento da eritropoiese. Clinicamente é usada para o tratamento de anemias associadas à falência renal crônica. No presente realizou-se identificação e separação das isoformas de eritropoietina humana recombinante (rhEPO) em produtos biofarmacêuticos de diferentes origens, por focalização isoelétrica (IEF), seguida de imunodetecção, e também por ligação à lectina Triticum vulgaris, demonstrando a presença de 4 a 7 isoformas, distribuídas na faixa de ponto isoelétrico de 4,4 a 5,2. Quantificou-se o conteúdo de ácido N-acetilneuramínico por cromatografia líquida por fase-reversa e detecção por fluorescência obtendo teores acima de 108,74 ηg/μg. Avaliou-se a atividade biológica pelo bioensaio em camundongos normocitêmicos e pesquisou-se o ensaio alternativo baseado na cultura da linhagem celular TF-1 in vitro. Os resultados dos bioensaios apresentaram correlação significativa, conforme calculado pelo coeficiente de correlação de Pearson (r = 0,9967). Paralelamente, determinou-se o teor/potência dos produtos pelas metodologias validadas por cromatografia líquida por fase reversa e por exclusão molecular, que forneceram média de resultados 2,11% e 1,21% menores, respectivamente, em relação ao bioensaio in vivo. Submeteu-se amostra à degradação por luz UV para obter as formas desamidadas/oxidadas e tratamento a 65°C por 12 horas para as diméricas e agregadas. Efetuou-se a avaliação pelo bioensaio in vivo e in vitro, que apresentaram redução média de 14,05% e 32,87% respectivamente, em relação à molécula intacta. Desse modo, o ensaio biológico alternativo in vitro, pesquisado no contexto da redução ou substituição do uso de animais, e as avaliações de correlação entre métodos físico-químicos e biológicos, representam aprimoramentos aplicáveis para as etapas do processo de produção e para o controle de qualidade de rhEPO, contribuindo para garantir a consistência lote-a-lote da solução concentrada e dos produto biológicos acabados.

O objetivo deste estudo foi mensurar o fluxo salivar, pH, capacidade tampão, concentrações de proteína total e ácido siálico, atividades das enzimas amilase e peroxidase e concentração dos íons sódio, potássio, cálcio, fósforo, zinco e magnésio em saliva total de indivíduos síndrome de Down com idade entre 1 e 25 anos. Nos indivíduos com idade entre 1 e 5 anos a saliva total foi coletada através de uma leve sucção, enquanto que nos outros indivíduos com idade entre 6 e 10, 11 e 15, 15 e 20, 21 e 25 a saliva total foi coletada com estimulação mecânica através da mastigação de parafilm, durante 10 minutos. O pH e a capacidade tampão foramdeterminadas usando um pHmetro digital. A capacidade tampão foi mensurada através de titulação com HCl a 0,01N. A concentração de eletrólitos foi determinada através de um espectrofotômetro de emissão atômica com fonte de excitação de argônio induzido. A proteína total foi mensurada através do reagente de Folin. A atividade da amilase foi mensurada através da produção de maltose e a atividade da peroxidase foi mensurada através da utilização de orto-dianisidina. Para a analise estatística os dados foram apresentados em media ± desvio padrão. Foi utilizado o teste “t" de Student para determinar as diferenças entre as medias dos indivíduos síndrome de Down e o grupo controle. Nenhuma diferença significante foi observada na concentração de ácido siálico, fósforo, zinco, magnésio e cálcio entre os indivíduos síndrome de Down e o grupo controle. A concentração de sódio, proteína total e a capacidade tampão demonstraram ser maior nos indivíduos com síndrome de Down em comparação ao grupo controle. Por outro lado, o fluxo salivar, a concentração de potássio, e a atividade das enzimas amilase e peroxidase foram menores no grupo síndrome de Down quando comparado ao grupo controle. Estes resultados sugerem que as pessoas com síndrome de Down apresentam alterações no metabolismo do ducto e/ou das células acinares das glândulas salivares. / The aim of this study was to measure the flow rate, pH, buffer capacity, sialic acid, total protein concentrations, amylase and peroxidase activities and sodium, potassium, calcium, phosphorus, zinc and magnesium concentration whole saliva of individuals with Down syndrome aged 1 - 25 years. In individuals aged 1-5 years the whole saliva was collected under slight suction, while in the others individuals aged 6-10, 11-15, 15-20, 21-25 the whole saliva was collected with stimulation by chewing a piece of parafilm, for 10 minutes. The pH and the buffer capacity were determined using a digital pHmeter. The buffer capacity was measured by titration with 0.01 N HCl. Electrolyte concentrations were determined by inductively coupled argon plasma with atomic emission spectrometry. Sialic acid was determined by thiobarbituric acid assay. Protein was determined by the folin’s phenol reagent. Amylase was assayed measuring the maltose produced by the breakdown of starch and peroxidase with ortho dianisidine. For statistical analysis the date are presented as mean ± SD. Student’s “t" test was used to determine differences between the mean of the Down syndrome and control groups. No statistically significant differences were observed in sialic acid, phosphorus, zinc, magnesium and calcium concentration between the individuals with Down syndrome and control group. The sodium and total protein concentration and buffer capacity showed higher in the Down syndrome than in the control group. On the other hand the flow rate and potassium concentration, amylase and peroxidase activities were lower in the Down syndrome than in the control group. These results suggest that the Down syndrome persons present alteration in the metabolism of the duct and/or acinar cells of salivary glands.

O objetivo deste estudo foi mensurar o fluxo salivar, pH, capacidade tampão, concentrações de proteína total e ácido siálico, atividades das enzimas amilase e peroxidase e concentração dos íons sódio, potássio, cálcio, fósforo, zinco e magnésio em saliva total de indivíduos síndrome de Down com idade entre 1 e 25 anos. Nos indivíduos com idade entre 1 e 5 anos a saliva total foi coletada através de uma leve sucção, enquanto que nos outros indivíduos com idade entre 6 e 10, 11 e 15, 15 e 20, 21 e 25 a saliva total foi coletada com estimulação mecânica através da mastigação de parafilm, durante 10 minutos. O pH e a capacidade tampão foramdeterminadas usando um pHmetro digital. A capacidade tampão foi mensurada através de titulação com HCl a 0,01N. A concentração de eletrólitos foi determinada através de um espectrofotômetro de emissão atômica com fonte de excitação de argônio induzido. A proteína total foi mensurada através do reagente de Folin. A atividade da amilase foi mensurada através da produção de maltose e a atividade da peroxidase foi mensurada através da utilização de orto-dianisidina. Para a analise estatística os dados foram apresentados em media ± desvio padrão. Foi utilizado o teste “t” de Student para determinar as diferenças entre as medias dos indivíduos síndrome de Down e o grupo controle. Nenhuma diferença significante foi observada na concentração de ácido siálico, fósforo, zinco, magnésio e cálcio entre os indivíduos síndrome de Down e o grupo controle. A concentração de sódio, proteína total e a capacidade tampão demonstraram ser maior nos indivíduos com síndrome de Down em comparação ao grupo controle. Por outro lado, o fluxo salivar, a concentração de potássio, e a atividade das enzimas amilase e peroxidase foram menores no grupo síndrome de Down quando comparado ao grupo controle. Estes resultados sugerem que as pessoas com síndrome de Down apresentam alterações no metabolismo do ducto e/ou das células acinares das glândulas salivares. / The aim of this study was to measure the flow rate, pH, buffer capacity, sialic acid, total protein concentrations, amylase and peroxidase activities and sodium, potassium, calcium, phosphorus, zinc and magnesium concentration whole saliva of individuals with Down syndrome aged 1 - 25 years. In individuals aged 1-5 years the whole saliva was collected under slight suction, while in the others individuals aged 6-10, 11-15, 15-20, 21-25 the whole saliva was collected with stimulation by chewing a piece of parafilm, for 10 minutes. The pH and the buffer capacity were determined using a digital pHmeter. The buffer capacity was measured by titration with 0.01 N HCl. Electrolyte concentrations were determined by inductively coupled argon plasma with atomic emission spectrometry. Sialic acid was determined by thiobarbituric acid assay. Protein was determined by the folin’s phenol reagent. Amylase was assayed measuring the maltose produced by the breakdown of starch and peroxidase with ortho dianisidine. For statistical analysis the date are presented as mean ± SD. Student’s “t” test was used to determine differences between the mean of the Down syndrome and control groups. No statistically significant differences were observed in sialic acid, phosphorus, zinc, magnesium and calcium concentration between the individuals with Down syndrome and control group. The sodium and total protein concentration and buffer capacity showed higher in the Down syndrome than in the control group. On the other hand the flow rate and potassium concentration, amylase and peroxidase activities were lower in the Down syndrome than in the control group. These results suggest that the Down syndrome persons present alteration in the metabolism of the duct and/or acinar cells of salivary glands.